In vivo Imaging dell'intero cervello delle larve di zebrafish mediante microscopia a fluorescenza tridimensionale
28 aprile 2023
Presentato qui è un protocollo per l'imaging in vivo dell'intero cervello del pesce zebra larvale utilizzando la microscopia a fluorescenza tridimensionale. La procedura sperimentale include la preparazione del campione, l'acquisizione di immagini e la visualizzazione.
Stiamo sviluppando sistemi immunitari ottici e algoritmi computazionali per registrare e analizzare la neuroattività dell'intero cervello con un'elevata risoluzione spaziale e temporale. Il pesce da laboratorio è un animale modello ideale per la ricerca. Grazie ad ogni trasparenza ottica e alla disponibilità di diversi strumenti genetici, la qualità dell'immagine ottica può essere degradata a causa dell'aberrazione introdotta dal gel di agarosio utilizzato per il montaggio del campione e il pesce può muoversi durante la registrazione causando artefatti di movimento nelle immagini o impedendo l'estrazione del segnale di precisione dalle immagini.
I protocolli disponibili al pubblico forniscono solo una breve panoramica della procedura sperimentale, vivendo parti sostanziali dei dettagli, come le tecniche di montaggio precise di solidificazione dell'agarosio e il semplice posizionamento. Pertanto, è necessario un protocollo efficace e riproducibile per acquisire dati di immagine di alta qualità. Con rumore e movimento minimi.
Il nostro protocollo prevede una procedura sperimentale ottimizzata e riproducibile. Questo protocollo consente l'imaging in vivo dell'intero cervello per un periodo prolungato e la visualizzazione dei dati di imaging acquisiti. Il flusso di lavoro si è concentrato sull'imaging dell'intero cervello, ma può essere facilmente applicato all'imaging di altri organi di molti dei nostri pesci zebra.
Il nostro obiettivo è quello di svelare i principi alla base del calcolo neurale. Per questo continueremo a lavorare su una pipeline che coinvolge l'imaging su larga scala dell'attività neurale e della struttura e l'analisi computazionale di tali per la mappatura sistematica del cervello.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'immagine in vivo di tutto il cervello di zebrafish larvali, utilizzando la microscopia a fluorescenza tridimensionale. Il modello di zebrafish è preferito grazie alla sua trasparenza ottica e all'accessibilità genetica per lo studio del calcolo neurale e dell'attività. Il protocollo affronta problemi comuni come gli artefatti di movimento e le aberrazioni del gel di agarosio, garantendo l'acquisizione di dati immagine di alta qualità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Tecniche di Imaging
Sfondo
- Il pesce zebra larvale è un modello fondamentale per gli studi di neuroattività grazie alla sua trasparenza.
- Le principali difficoltà includono aberrazioni causate dal gel di agarosio e artefatti di movimento durante l'acquisizione delle immagini.
- I protocolli attuali non forniscono passaggi dettagliati per un efficace montaggio e posizionamento del campione.
- L'acquisizione di immagini ad alta risoluzione è fondamentale per comprendere il calcolo neurale.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo riproducibile per l'acquisizione di immagini di alta qualità dell'attività cerebrale del pesce zebra.
- Ridurre il rumore e gli artefatti dovuti al movimento durante le sessioni di acquisizione immagini.
- Facilitare lo studio del calcolo neurale per periodi prolungati.
Metodi Utilizzati
- La piattaforma principale utilizzata è la microscopia a fluorescenza tridimensionale.
- Il modello biologico implica l'utilizzo di zebrafish larvali, preparati e immobilizzati per l'acquisizione di immagini.
- Viene adottato un flusso di lavoro sperimentale ottimizzato per garantire un numero minimo di artefatti.
- I passaggi critici includono il posizionamento preciso dello zebrafish e la corretta regolazione dei parametri di acquisizione.
- La visualizzazione dei dati acquisiti viene effettuata mediante l'uso di strumenti software come napari.
Risultati principali
- Il protocollo di imaging consente una visualizzazione completa delle aree cerebrali, inclusi i neuroni del proencefalo, mesencefalo e romboencefalo.
- L'attività neuronale può essere catturata mediante imaging in serie temporale, rivelando informazioni significative sulle funzioni neurali.
- La chiara visibilità di tutte le regioni cerebrali indica l'efficacia del protocollo.
Conclusioni
- Questo studio dimostra un nuovo approccio di imaging che migliora la comprensione dell'attività neurologica del pesce zebra.
- Il protocollo non solo stabilisce uno standard per l'imaging del pesce zebra, ma ha anche implicazioni per ricerche neurali più ampie.
- Si prevede che un ulteriore sviluppo delle procedure di imaging migliori gli studi sulla mappatura cerebrale e sul calcolo neurale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging tridimensionale con fluorescenza dei cervelli di larve di pesce zebra consente una mappatura ad alta risoluzione, in vivo, della struttura e dell'attività neuronale, sostenendo la scoperta nelle fasi iniziali delle neuroscienze. Questo protocollo affronta la riproducibilità e la riduzione degli artefatti, fornendo una base solida per l'eliminazione dei rischi meccanicistici e la validazione degli obiettivi nella ricerca neurobiologica. La sua adattabilità e i risultati quantitativi lo posizionano come una capacità riutilizzabile all'interno di pipeline aziendali di ricerca e sviluppo focalizzate sull'analisi dei circuiti neurali e sullo screening funzionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi sistematica delle vie neurali e dell'attività cellulare in un modello vertebrale.
- Supporta la riduzione dei rischi biologici minimizzando gli artefatti di movimento e le aberrazioni nell'immagine.
- Facilita la previsione affidabile nell'identificazione di bersagli neurali attraverso dati quantitativi a livello di intero cervello.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara campioni di pesce zebra validati e immobilizzati per flussi di lavoro di imaging riproducibili.
- Standardizza i parametri di imaging e il posizionamento del campione per garantire la coerenza del saggio.
- Genera dati quantitativi volumetrici e in serie temporale adatti per analisi successive e screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Fornisce un sistema vertebrale pertinente alla malattia per la mappatura funzionale dei circuiti neurali.
- Consente una transizione continua dalla scoperta tramite imaging allo sviluppo di modelli preclinici per composti neuroattivi.
- Supporta un avanzamento proporzionato ai rischi fornendo output di imaging ad alto contenuto e riproducibili.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di imaging si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo la verifica di ipotesi, la mappatura di vie metaboliche e l'analisi quantitativa in modelli di neuroscienze vertebrati.
- Biologia della scoperta: Supporta la mappatura basata su ipotesi dell'attività neurale e della struttura a risoluzione cellulare.
- Screening: Fornisce output di imaging quantitativi e riproducibili per studi su composti o perturbazioni genetiche.
- Analisi: Offre set di dati volumetrici e serie temporali per l'analisi computazionale e il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si allinea allo sviluppo di modelli preclinici consentendo l'imaging funzionale in un sistema vertebrale.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo è adattabile per l'imaging di altri organi o sistemi nel pesce zebra larvale, favorendo la scalabilità della piattaforma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione dei bersagli neurali.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra esperimenti di imaging.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione (go/no-go) e l'efficienza nell'uso del capitale nei portafogli di neuroscienze.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli neurali e dei saggi funzionali in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione, immobilizzazione e microscopia a fluorescenza dei zebrafish.
- Richiede l'accesso a piattaforme di imaging a fluorescenza confocali o personalizzate e a strumenti di analisi computazionale.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei campioni e i parametri di imaging.
- È adattabile ad altri organi di larve di zebrafish, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo per tessuti diversi.
- Le limitazioni potenziali includono artefatti di imaging derivanti dall'agarosio e movimento qualora l'immobilizzazione non sia completa.
