Name: Utilizzo della piattaforma tissutale barriera MicroSiM (μSiM) per la modellazione della barriera emato-encefalica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Scopri la modellazione della barriera emato-encefalica con la piattaforma MicroSiM utilizzando cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo consente di studiare gli effetti della sepsi sul cervello in vitro.

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J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. e L.W. sono stati finanziati dalla sovvenzione NIH R33 HL154249. J.L.M. è stato finanziato da R44 GM137651. M.M. è stato finanziato dallo Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, Università di Rochester. M.T. è stata finanziata da RF1 AG079138. K.C. è stato finanziato dalla Fondazione Internazionale per la Ricerca Etica.

Analisi di modelli di barriera emato-encefalica mediante colorazione in immunofluorescenza

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J.L.M. è co-fondatore di SiMPore e detiene una partecipazione azionaria nella società. SiMPore sta commercializzando tecnologie ultrasottili a base di silicio, comprese le membrane utilizzate in questo studio.

Sebbene i trucioli della membrana siano stati progettati per la stabilità, possono rompersi o rompersi se maneggiati in modo errato durante l'assemblaggio. Pertanto, è fondamentale afferrare il chip nelle tacche della pinzetta per chip e posizionarlo delicatamente nell'attrezzatura. Quando si maneggiano i dispositivi in generale, è necessario prendere ulteriori precauzioni per non urtare o far cadere i dispositivi. Durante l'incollaggio del chip della membrana al dispositivo A1, il chip deve essere posato in piano e centrato sul pilastro del dispositivo A1 per evitare la rottura della membrana durante l'incollaggio al componente 1. Inoltre, qualsiasi contatto con gli strati di PSA esposti deve essere evitato dopo aver rimosso le maschere protettive. Quando si maneggia il componente 2 dopo la rimozione delle maschere protettive, si consiglia di tenerlo lungo il bordo del componente e di utilizzare una pinzetta per afferrare l'angolo triangolare privo di PSA.
Mentre i protocolli di coltura cellulare sono stati descritti per possibili modelli di BBB, il modello di co-coltura BMEC/periciti della BBB qui descritto può essere sufficiente o insufficiente a seconda del contesto fisiologico e delle domande di interesse. Ad esempio, il traffico di cellule immunitarie si verifica in gran parte nelle venule postcapillari del cervello41,42. In queste regioni, uno spazio perivascolare separa la barriera BMEC/pericita dai limitans gliali stabiliti dagli astrociti. Pertanto, nelle venule postcapillari, l'unità neurovascolare (NVU) comprende due barriere fisicamente separate in serie e le estremità astrocitarie non entrano direttamente in contatto con la barriera emato-pericitica/BMEC, che è ben rappresentata dal modello attuale. Se l'obiettivo è un modello NVU che tenga conto dell'impatto dei fattori secreti dagli astrociti sulla barriera ematologica, è possibile aggiungere al dispositivo un compartimento astrocitario che consenta lo scambio di fattori solubili attraverso lo spazio perivascolare. Questo esempio è stato illustrato in precedenza 34 e potrebbe essere esteso per includere altre cellule come la microglia e i neuroni in un compartimento "cerebrale"3D. L'architettura modulare della piattaforma consente di utilizzare semplici strategie di assemblaggio per ottenere queste riconfigurazioni, in modo che la piattaforma sia semplice o complessa quanto necessario per affrontare le ipotesi a portata di mano. Ogni configurazione di coltura cellulare; tuttavia, deve essere ottimizzato per nuove linee cellulari e multi-colture. Ad esempio, a causa delle proprietà delle membrane in nitruro di silicio, potrebbe essere necessario adattare le soluzioni di rivestimento rispetto alle piastre di coltura tissutale. L'inclusione di fibronectina in genere aiuta l'attaccamento cellulare e la sopravvivenza. Inoltre, gli utenti potrebbero coltivare cellule endoteliali e periciti in direzioni opposte. In questo caso, potrebbe essere necessario modificare, ad esempio, il modo in cui vengono effettuate e interpretate le misure di permeabilità. Fornire passaggi per questo tipo di cultura, tuttavia, esula dallo scopo di questo documento.
Un'altra sfida che si può incontrare durante la coltura cellulare è la rapida evaporazione dei terreni, poiché i dispositivi possono essere più sensibili alle alterazioni dell'ambiente rispetto alle piastre e ai flaconi standard per la coltura dei tessuti. Se si osserva un'evaporazione eccessiva o una crescita cellulare rallentata, è necessario misurare tutti i parametri critici dell'incubatore per garantire impostazioni accurate. È possibile aggiungere più acqua al cappuccio del tessuto o alla piccola capsula di Petri posta all'interno della camera di coltura cellulare, oppure i terreni devono essere scambiati più frequentemente. Inoltre, le bolle possono entrare nel canale inferiore e rimanere bloccate nella trincea per i dispositivi di trincea. Sebbene possano essere rimossi, è più facile evitare di aggiungere bolle in primo luogo. A tale scopo, è importante verificare che non vi siano bolle nel puntale della pipetta o aria all'estremità del puntale della pipetta prima di pipettare il terreno nella camera inferiore. Inoltre, l'evaporazione del fluido nel canale può portare a uno spazio tra la superficie del supporto e la parte superiore della porta. È possibile pipettare un piccolo volume di supporti in una porta fino a quando non raggiunge la superficie della porta opposta, dopodiché il supporto può essere sostituito in quella porta opposta. Mentre i terreni hECSR ed E6 + 10% FBS non devono essere riscaldati a bagnomaria, altri terreni possono essere preriscaldati per ridurre la formazione di bolle. Se una bolla penetra nella camera inferiore, può essere rimossa pipettando rapidamente 100 μL attraverso il canale. Tuttavia, questo metodo può portare alla contaminazione tra le camere o alla fuoriuscita di fluidi sulla superficie del dispositivo. Può anche distruggere gli strati cellulari. In alternativa, il mezzo può essere prima rimosso dal canale e poi reintrodotto con un volume di 50 μL. Rimuovere prima il supporto, tuttavia, può causare una maggiore formazione di bolle nel canale. Se una bolla non si trova direttamente sotto l'area della membrana, può essere lasciata nel canale senza effetti sulla coltura cellulare.
L'attaccamento e la crescita dei periciti, come dimostrato nella Figura 2, possono essere impegnativi. L'utilizzo di una densità di semina ottimizzata è essenziale per la formazione di uno strato con un rapporto periciti-cellule endoteliali fisiologicamente rilevante. Inoltre, poiché i periciti sono sensibili al taglio, tutti gli scambi di terreni nel canale dovrebbero essere eseguiti molto lentamente per proteggere le cellule. Per la coltura BPLC, è possibile ottenere un migliore attaccamento rivestendo la camera inferiore con 800 μg/mL di collagene di tipo IV o 100 μg/mL di fibronectina.
L'immunocitochimica nei dispositivi qui descritti consente un'analisi qualitativa della salute e della funzione cellulare. I metodi per la colorazione nelle piastre di coltura tissutale o in altre piattaforme devono essere direttamente traducibili nella piattaforma. Per la coltura cellulare solo nella camera superiore, dopo la fissazione, il PBS può essere aggiunto nella camera inferiore e lasciato per i passaggi rimanenti, con il blocco e la colorazione eseguiti solo nella camera superiore. In questo modo si riducono al minimo i rischi di rottura delle membrane o di formazione di bolle nella camera inferiore. Per la colorazione in co-coltura, si consiglia di utilizzare entrambe le camere in tutte le fasi. È importante notare che la viscosità del fissativo e del PBS è diversa da quella del fluido. Pertanto, può essere più facile aggiungere bolle nella camera inferiore ed è necessario prestare particolare attenzione a controllare la presenza di aria nei puntali delle pipette all'estremità del puntale prima di pipettare nella camera inferiore.
Il protocollo descritto per il saggio di permeabilità a piccole molecole consente una valutazione funzionale e quantitativa della funzione di barriera delle cellule endoteliali coltivate nel dispositivo μSiM. Un problema che può essere riscontrato durante questo test è l'aspirazione di bolle d'aria nella pipetta durante la raccolta del campione dal canale inferiore nella fase 4.1.7.4 del protocollo. Per evitare questo problema, è importante assicurarsi che la punta sia sigillata nella porta prima di iniziare la raccolta del campione e che il campione non venga prelevato troppo velocemente. Se ciò non risolve il problema, la dimensione delle punte utilizzate potrebbe essere troppo piccola o troppo grande per adattarsi alle porte; utilizzare i suggerimenti elencati nella Tabella dei materiali. Se vengono misurati valori di permeabilità inaspettatamente elevati nonostante un monostrato confluente dall'aspetto sano, l'integrità del monostrato deve essere verificata per rilevare eventuali interruzioni durante la raccolta del campione. Si consiglia di controllare sempre il monostrato al microscopio subito dopo la raccolta del campione. Se il monostrato sembra ancora intatto e sano, il campione può essere fissato e i marcatori biologici della funzione di barriera possono essere valutati, ad esempio, tramite immunocolorazione delle proteine giunzionali. Al contrario, se vengono misurati valori di permeabilità inaspettatamente bassi, è importante assicurarsi che 50 μL di terreno vengano campionati dal canale inferiore senza bolle d'aria. Se il terreno fuoriesce dalla porta di campionamento non appena viene posizionato il puntale del serbatoio, tale terreno deve essere raccolto prima di inserire la pipetta nella porta di campionamento, poiché la maggior parte della piccola molecola fluorescente sarà presente nel volume iniziale di 10 μL campionato dal canale inferiore. Disegnando cerchi intorno alle porte utilizzando una penna idrofobica o posizionando un nastro idrofobico con un foro intorno alla porta si evita che i fluidi pompati passivamente si diffondano. Se durante il campionamento vengono prelevate delle bolle o se l'intero campione da 50 μL non viene rimosso, il campione non deve essere utilizzato. In alternativa, il volume esatto può essere determinato e utilizzato nel calcolo della permeabilità; tuttavia, questo dovrebbe essere fatto solo se il volume rimosso è ≥40 μL, che corrisponde a ~98-99% di recupero del colorante34.

I tessuti viventi sono compartimentati da cellule specializzate che creano e mantengono barriere e regolano quali cellule e molecole vengono trasportate da un compartimento all'altro. L'impropria regolazione delle funzioni di barriera può essere la fonte sia di malattie acute che di malattie croniche. La barriera emato-encefalica (BBB) è la barriera tissutale più restrittiva del corpo umano1. La disfunzione della BBB è alla base di un'ampia gamma di malattie del sistema nervoso centrale (SNC), tra cui il morbo di Alzheimer2, il morbo di Parkinson3,4 e la sclerosi multipla 5,6. La lesione della BBB è anche legata al deterioramento cognitivo a lungo termine come risultato di disturbi acuti, come la sepsi7, il COVID-198 e il delirio postoperatorio9. Lo sviluppo di farmaci con il potenziale per il trattamento dei disturbi cerebrali è stato frustrantemente difficile a causa della sfida di violare intenzionalmente la BBB per fornire molecole bioattive ai bersagli nel cervello10. Per questi motivi, i metodi per studiare la funzione della BBB in vitro sono di fondamentale importanza per la comprensione e il trattamento delle malattie del SNC.
I metodi di base per misurare la funzione di barriera in vitro prevedono la creazione di un monostrato o di una co-coltura su una membrana semipermeabile e la misurazione della resistenza impartita dalle cellule alla diffusione di piccole molecole o a piccole correnti elettriche11,12,13,14. Mentre l'emergere dei sistemi microfisiologici (MPS) ha prodotto un'abbondanza di scelte per modellare la BBB in 3D15,16, la diversità delle geometrie del sistema rende difficile confrontare le misurazioni di permeabilità tra MPS o con i valori stabiliti in letteratura. La definizione di valori basali affidabili è particolarmente importante nella ricerca sulla BBB dove, a causa dell'ampia regolazione della barriera da parte delle cellule endoteliali vascolari cerebrali, i valori di permeabilità in vitro sono altamente esaminati12,17,18. Per questi motivi, le misurazioni della permeabilità attraverso i monostrati stabiliti su membrane 2D rimarranno un punto fermo negli studi sulla BBB per gli anni a venire. Ciò vale per altre barriere tissutali, comprese le barriere epiteliali, in cui i valori assoluti di permeabilità basale vengono utilizzati per convalidare e confrontare i modelli in vitro 19,20,21.
Con l'obiettivo di creare un nuovo strumento prezioso per la comunità di ricerca sulla BBB, negli ultimi 5 anni abbiamo introdotto 22 eavanzato 23,24,25,26 il microdispositivo dotato di una piattaforma di embrane di licon membrane (μSiM) per l'uso nella modellazione dei tessuti di barriera. La caratteristica abilitante della piattaforma è una membrana ultrasottile (<100 nm di spessore) con centinaia di milioni di nanopori 27,28 o una miscela di nanopori e micropori29. I chip a membrana autoportanti sono prodotti su un "chip" di silicio da 300 μm che stabilizza le strutture ultrasottili30 e consente loro di essere maneggiate con pinzette per l'assemblaggio del dispositivo. A causa della loro natura ultrasottile, le membrane hanno una permeabilità di due ordini di grandezza superiore a quella delle membrane convenzionali incise su traccia utilizzate nei dispositivi commerciali di coltura a membrana31,32. In pratica, ciò significa che l'ostacolo della membrana alla diffusione di molecole più piccole dei nanopori (<60 nm) è trascurabile33. Pertanto, per le barriere cellulari, solo le cellule e le matrici che depositano determineranno la velocità di trasporto di piccole molecole dai compartimenti apicali a quelli basali che sono separati dalla membrana34. Il design del dispositivo e la natura ultrasottile delle membrane offrono anche molti vantaggi per la microscopia ottica. Questi includono 1) la capacità di seguire colture vive utilizzando il contrasto di fase o l'imaging in campo chiaro, 2) la capacità di colorare e visualizzare immagini fluorescenti in situ senza la necessità di estrarre e trasferire la membrana in un vetro di copertura e 3) il fatto che le membrane sono più sottili delle "fette" confocali in modo che le co-colture dirette abbiano una spaziatura più naturale tra i tipi di cellule rispetto a quella che può essere ottenuta con membrane incise in traccia spesse 6-10 μm.
Più recentemente, abbiamo avanzato la piattaforma a un formato modulare per facilitare l'assemblaggio rapido34 e la personalizzazione35,36. Abbiamo sfruttato il formato modulare per distribuire i componenti del dispositivo tra i nostri laboratori di bioingegneria e i laboratori di barriera cerebrale che collaborano. Abbiamo quindi sviluppato congiuntamente protocolli per l'assemblaggio del dispositivo, la monocoltura e la co-coltura, la colorazione immunofluorescente e la permeabilità a piccole molecole e abbiamo dimostrato che questi metodi erano riproducibili tra i laboratori. Utilizzando questi protocolli, abbiamo anche dimostrato che la piattaforma modulare supporta una BBB convalidata sviluppata utilizzando il metodo di coltura endoteliale estesa (EECM) per la creazione di cellule endoteliali simili a microvascolari cerebrali (BMEC) da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs)37. Lo scopo del presente rapporto è quello di esaminare questi metodi in modo più dettagliato e, con l'aiuto del video di accompagnamento, facilitare una più ampia adozione della piattaforma nella comunità BBB.

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 Anticorpo policlonale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32321</td><td></td></tr><tr><td>Claudin-5 anticorpo IgG di topo, 4C3C2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>IgG di capra e alfa;-topo Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>IgG di capra e coniglio Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>NG2, mouse IgG2a, 9.2.27</td><td>Millipore</td><td>&nbsp; </td><td></td>MAB2029</tr><tr><td>Anticorpo IgG di topo occludina, OC-3F10</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;, anticorpo IgG di coniglio,</td><td>tecnologia di segnalazione cellulare</td> 28E1 <td>3169</td><td></td></tr><tr><td>VE-caderina clone IgG2B di topo # 123413</td><td>R& D Systems</td><td>MAB9381</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 coniglio anticorpo IgG, policlonale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Sostanze chimiche, peptidi e proteine ricombinanti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Metanolo</td><td>VWR</td><td>101443-718</td><td>Può essere sostituito con prodotti simili</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Può essere sostituito con prodotti simili</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>integratore di B27</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagene IV da placenta umana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Collagene, soluzione di tipo I da coda di ratto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Può essere sostituito con prodotti simili</td></tr><tr><td>DMEM/Ham' s F12</td><td>Thermo Fisher Scientific 11320033</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Terreno di crescita delle cellule endoteliali-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina da plasma bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina proteina umana, plasma</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>Può essere sostituito con prodotti simili</td></tr><tr><td>hESFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH sale di dilitio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861502</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>500627</td><td>Può essere sostituito con prodotti simili</td></tr><tr><td>PBS senza di calcio, di magnesio</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>Può essere sostituito con prodotti simili</td></tr><tr><td>Pericyte Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td>Utilizzare il kit completo (include integratori)</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina, 10 mg/mL</td><td>ScienCell</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td>Può essere sostituito con prodotti simili</td></tr><tr><td>Acqua distillata UltraPure senza DNasi/RNasi</td><td>Invitrogen&commercio;</td><td>10977015</td><td>Può essere sostituito con prodotti simili</td></tr><tr><td>Modelli sperimentali: Linee cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare hCMEC/D3 della barriera emato-encefalica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Periciti vascolari cerebrali umani</td><td>ScienCell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 cellule staminali pluripotenti indotte umane</td><td>WiCell</td><td>RRID:CVCL_C437</td><td></td></tr><tr><td>Vetreria e plastica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 mm Piastra per colture cellulari trattata</td> con TC e morsetti per <td>353025 Falcon</td> con griglia da 20 mm Piastre per <td>colture</td><td></td></tr> tissutali <tr><td></td><td>VWR</td><td>MFLX06832-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning (6 pozzetti)</td><td>Micropiastre</td> piatte non vincolanti a 96 pozzetti Corning <td>3506</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-One</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per dispositivo per vetrini</td> per <td>microscopio&nbsp; SiMPore</td><td>USIM-SB</td><td>Dimensioni compatibili con i supporti per vetrini per microscopio</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339653</td><td>I tappi delle provette possono essere riempiti con acqua per la coltura cellulare</td></tr><tr><td>Puntali per pipette P20-200</td><td>VWR</td><td>76322-516</td><td>Le marche alternative potrebbero non sigillare in modo altrettanto efficace nelle porte</td></tr><tr><td>Filtri Transwell (12 pozzetti, 12 mm, 0,4 &mu; m dimensione dei pori, PC)</td><td>CoStar</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Obiettivo (per Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD00105</td><td>Aria; WD: 4 mm; NA 0.45</td></tr><tr><td>Obiettivo 10X (per Nikon)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRP40102</td><td>Aria; Peso interno: 6,2 mm; NA 0.25</td></tr><tr><td>40X Obiettivo (LWD) (per Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD77410</td><td>Immersione in acqua; WD: 590-610 mm; NA 1.15</td></tr><tr><td>Microscopio confocale a disco rotante Andor</td><td>Oxford Instruments, Microscopio a</td> contrasto di fase Andor <td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Può essere sostituito con prodotti simili</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td>Può essere sostituito con prodotti simili</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced PAP Pen</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z672548</td><td>si consiglia la punta da 2 mm Kit</td></tr><tr><td>di montaggio con dispositivi</td><td>SiMPore</td><td>USIM-JIGSET</td><td>Incluso dispositivo A1, A2, B1 e B2</td></tr><tr><td>Adattatore per Microscopi</td><td>AmScope</td><td>CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR</td><td>&Phi; 23.2 - &Phi; 30 adattatore adatto a Nikon Eclipse Ts2</td></tr><tr><td>Canon EOS Rebel SL3 DSLR Fotocamera</td><td>Canon</td><td>EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001</td><td>Può essere sostituito con prodotti simili</td></tr><tr><td>Filtro cellulare, 40 &; m</td><td>Millipore Sigma (Corning)</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>Componente 1</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C1</td><td></td></tr><tr><td>Componente 2</td><td>SiMPore</td><td>USIM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Chip a membrana</td><td>SiMPore</td><td>NPSN100-1L</td><td>Sono disponibili altri formati di chip</td></tr><tr><td>Pinzetta per la manipolazione SMD a doppio angolo</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW003</td><td>"Pinzette per chip"</td></tr><tr><td>Stainless pinzetta GG di precisione in acciaio</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW534</td><td>"Pinzette dritte"</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Per l'elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Fusion</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td>Istruzioni per la versione 2.3.0.44</td></tr><tr><td>i-control</td><td>TECAN</td><td></td><td>Istruzioni per la versione 2.0</td></tr><tr><td>Strumenti Imaris</td><td>Oxford Per</td><td></td><td>l'elaborazione delle immagini. Istruzioni per la versione 9.9.0</td></tr></tbody></table>

utilizzo della piattaforma tissutale barriera microsim (μsim) per la modellazione della barriera emato-encefalica

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

Il microSiM (μSiM) è una piattaforma di coltura basata su membrana per la modellazione della barriera emato-encefalica (BBB). A differenza delle piattaforme convenzionali basate su membrana, μSiM offre agli sperimentatori nuove capacità, tra cui l'imaging di cellule vive, la segnalazione paracrina senza ostacoli tra le camere "sangue" e "cervello" e la capacità di visualizzare direttamente l'immunofluorescenza senza la necessità di estrarre/rimontare le membrane. Qui dimostriamo l'uso di base della piattaforma per stabilire modelli di monocoltura (cellule endoteliali) e co-coltura (cellule endoteliali e periciti) della BBB utilizzando membrane nanoporose ultrasottili di nitruro di silicio. Dimostriamo la compatibilità sia con colture cellulari primarie che con colture di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Forniamo metodi per l'analisi qualitativa di modelli di BBB tramite colorazione in immunofluorescenza e dimostriamo l'uso del μSiM per la valutazione quantitativa della funzione di barriera in un saggio di permeabilità a piccole molecole. I metodi forniti dovrebbero consentire agli utenti di stabilire i loro modelli di barriera sulla piattaforma, promuovendo l'uso della tecnologia dei chip tissutali per lo studio dei tessuti umani.

L'assemblaggio di un dispositivo di scavo è mostrato nella Figura 1. I dispositivi guidano l'assemblaggio dei componenti e del chip a membrana. Il componente 1 è principalmente acrilico con una superficie PSA per l'incollaggio al chip e un'apertura per la camera inferiore e porte per l'accesso della pipetta alla camera inferiore. Il componente 2 è lo strato del canale e contiene un "triangolo" non adesivo e privo di PSA in alto a destra per la presa. I dispositivi trench-down forniscono un'area piatta per la crescita della coltura cellulare nella camera superiore, mentre i dispositivi trench-up hanno una superficie piana per la coltura cellulare nella camera inferiore.
Sono state eseguite monocolture endoteliali e co-colture di hCMEC/D3 e HBVPs e di cellule EECM-BMEC-like derivate da hiPSC IMR90-4 e BPLC e abbiamo acquisito immagini di fase utilizzando un microscopio a contrasto di fase Nikon Eclipse Ts2 e un obiettivo 10x (Figura 2). Vengono mostrate le densità di semina ottimali per la coltura cellulare primaria (immagini scattate 1 giorno dopo la semina), nonché gli HBVP sottoseminati (Figura 2A). Le immagini finali della fase di cocoltura e monocoltura (coltura di cellule endoteliali a 6 giorni) possono essere difficili da distinguere (Figura 2C) e la conferma del successo della co-coltura di cellule primarie può richiedere la colorazione in immunofluorescenza (vedere paragrafo 3 del protocollo). Vengono inoltre illustrate le densità di semina BPLC derivate da hiPSC basse, alte e ottimali (Figura 2B). La co-coltura derivata da hiPSC è più chiara da distinguere nell'imaging a contrasto di fase rispetto alle co-colture primarie (Figura 2D). Una bassa semina BPLC provoca una scarsa copertura dei periciti e l'aggregazione dei periciti, mentre la trasemina eccessiva provoca il distacco dello strato di periciti dalla membrana. Inoltre, lo scambio troppo rapido del mezzo nella camera inferiore può causare la perdita di periciti, poiché queste cellule sono molto sensibili al taglio. La copertura ottimale da parte dei periciti è ~90% per un modello BBB, senza lacune nello strato endoteliale.
Immagini rappresentative di co-colture derivate da hiPSC immunocolorate sono illustrate nella Figura 3 (coltura di cellule endoteliali a 6 giorni). I BPLC derivati da IMR90-4 sono stati colorati per il marcatore pericicitario PDGFRβ e le cellule simili a EECM-BMEC derivate da IMR90-4 sono state colorate per il marcatore di giunzione aderente VE-caderina. Hoechst è stato utilizzato per colorare i nuclei. Le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale Spinning Disc utilizzando un obiettivo LWD 40x con fette da 0,2 μm ed elaborate con Imaris. Entrambi gli strati cellulari possono essere visualizzati anche se la sottile nanomembrana non è visibile.
Abbiamo eseguito il saggio di permeabilità a piccole molecole basato sul campionamento utilizzando le stesse condizioni sperimentali in due laboratori fisicamente distanti presso l'Università di Berna, in Svizzera, e l'Università di Rochester, NY, USA, per dimostrare la riproducibilità interlaboratorio dei risultati (Figura 4)34. Le cellule simili a EECM-BMEC derivate da hiPSC IMR90-4 sono state coltivate nel dispositivo μSiM per 2, 4 o 6 giorni e su filtri transwell per 6 giorni. Il test è stato eseguito utilizzando 150 μg/mL di giallo lucifero (457 Da) in entrambi i laboratori. L'elevata variabilità nella permeabilità delle cellule endoteliali coltivate per 2 giorni nel dispositivo indica che 2 giorni di coltura non sono stati sufficienti per la maturazione della barriera. Non ci sono state differenze significative nella permeabilità tra i laboratori al momento della maturazione della barriera, da 4 giorni in poi. Abbiamo anche dimostrato che la permeabilità delle cellule endoteliali coltivate in filtri μSiM e transwell per 6 giorni corrispondeva a quelle precedentemente pubblicate40.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig01.jpg"> Figura 1: Fasi dell'assemblaggio di μSiM . (A) Preparare il chip posizionandolo sull'attrezzatura A1. Posizionare la trincea dei trucioli verso l'alto per un dispositivo finale di trincea. Posizionare lo scavo trucioli verso il basso per un dispositivo di scavo finale. (B) Incollare il componente 1 al chip rimuovendo le maschere protettive dal componente 1 e posizionandolo a faccia in giù in FA1. Incollare applicando pressione con il dispositivo A2. (C) Incollare il componente 2 e il componente 1 rimuovendo il componente 2 dal suo foglio e staccando gli strati protettivi superiori. Posizionare il canale verso l'alto nell'attrezzatura B1 e posizionare il componente 1 sopra il componente 2 rivolto verso l'alto. Incollare applicando pressione con il dispositivo B2. Abbreviazioni: FAn = apparecchio An; FBn = fixture Bn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig02.jpg"> Figura 2: Schema della cocoltura e immagini rappresentative a contrasto di fase di colture cellulari nei dispositivi. (A) Localizzazione della semina di cellule pericitarie ed endoteliali. (B) Vista laterale schematica delle posizioni delle celle attraverso la trincea del chip di membrana. (C) Immagini rappresentative di densità di semina basse e ottimali per linee cellulari endoteliali cerebrali primarie HBVP e hCMEC/D3. Le immagini sono state acquisite 1 giorno dopo la semina (HBVP) e 2 ore dopo la semina (hCMEC/D3). (D) Immagini rappresentative di densità di semina bassa, alta e ottimale per cellule cerebrali simili a periciti derivate da hiPSC. Le immagini sono state acquisite 1 giorno dopo la semina. (E) Immagini rappresentative della co-coltura finale di HBVP e hCMEC/D3 e della monocoltura hCMEC/D3. Le immagini sono state acquisite 8 giorni dopo la semina di HBVP e 7 giorni dopo la semina di hCMEC/D3. (F) Immagini rappresentative di co-colture cellulari BPLC e EECM-BMEC-like fallite e riuscite e monocolture cellulari EECM-BMEC-like. Le immagini sono state acquisite 7 giorni dopo la semina BPLC e 6 giorni dopo la semina EECM-BMEC. Le colture BPLC sottoseminate non riescono ad avere una copertura sufficiente, mentre le colture BPLC traseminate cresceranno in modo eccessivo e inizieranno ad aggregarsi/ritirarsi. Barre di scala = 100 μm (C-F). Abbreviazioni: HBVPs = periciti vascolari del cervello umano; hiPSC = cellula staminale pluripotente indotta umana; BPLCs = cellule cerebrali simili ai periciti derivate da hiPSC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig03.jpg"> Figura 3: Immagini rappresentative di co-colture cellulari derivate da hiPSC immunocolorate in dispositivi. Le cellule sono state colorate per il marcatore delle cellule endoteliali VE-caderina (verde), il marcatore pericitario PDGFRβ (rosso) e la colorazione nucleare (blu). Due strati di cellule possono essere visti in stretta vicinanza, separati solo da una sottile nanomembrana di nitruro di silicio (la freccia bianca indica la posizione della membrana nell'immagine a sinistra). Barra graduata = 50 μm. Abbreviazioni: hiPSC = cellula staminale pluripotente indotta umana; PDGFRβ = recettore beta del fattore di crescita derivato dalle piastrine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig04.jpg"> Figura 4: Saggio di permeabilità a piccole molecole basato sul campionamento. (A) Schema del flusso di lavoro sperimentale. (B) Dimostrazione della riproducibilità interlaboratorio tra due laboratori fisicamente distanti presso l'Università di Berna (UniBe), Svizzera, e l'Università di Rochester (UR), NY, USA: cellule endoteliali derivate da hiPSC sono state coltivate nel dispositivo μSiM per 2, 4 o 6 giorni e in filtri transwell per 6 giorni. Il test di permeabilità è stato eseguito utilizzando 150 μg/mL di giallo lucifero (457 Da). La barra rossa indica i dati di permeabilità alla fluoresceina sodica (376 Da) precedentemente pubblicati delle stesse cellule endoteliali derivate da hiPSC coltivate per 6 giorni in filtri transwell40. N = 4-16 per gruppo. È stata utilizzata l'ANOVA bidirezionale con il test post hoc di Tukey e i confronti sono stati visualizzati solo per p &lt; 0,05. (C) Dimostrazione della risposta citochinica utilizzando cellule EECM-BMEC-like derivate da hiPSC coltivate nel μSiM per 2 giorni; 0,1 ng/mL TNFα + 2 UI/mL IFNγ) o il mezzo di controllo (non stimolato, NS) è stato aggiunto alla camera superiore per 20 ore prima del test di permeabilità utilizzando 150 μg/mL di Lucifero Yellow. N = 3 per gruppo. Test t di Student, p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Superficie di semina della camera superiore</td>
			<td>Volume del pozzo superiore</td>
			<td>Area della superficie di semina della camera inferiore</td>
			<td>Volume del canale inferiore</td>
		</tr><tr><td>~37 millimetri2</td>
			<td>100 μL (può contenere ≥115 μL)</td>
			<td>~42 millimetri2</td>
			<td>10 μL (pipetta da 20 μL per evitare bolle)</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Area superficiale e volumi critici μSiM.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bersaglio</td>
			<td>Fissativo</td>
			<td>Soluzione di blocco</td>
			<td>Diluizione</td>
		</tr><tr><td>VE-caderina</td>
			<td>4% PFA o 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0,4% Tx-100 o 10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>4% PFA o 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0,3-0,4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Claudin-5</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>ZO-1</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Occludina</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>PDGFRβ</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0,4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>NG2</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0,4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Capra α-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Capra α-Mouse IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Anticorpi e metodi di colorazione convalidati per l'immunocitochimica di co-coltura in dispositivi μSiM. Abbreviazioni: PFA = paraformaldeide; MeOH = metanolo; GS = siero di capra.
File supplementare 1: Modello per il calcolo del valore di permeabilità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258_SupplementalFile_SamplingCalcTemplate_Updated.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Questo rapporto fornisce protocolli per l'assemblaggio, la coltura cellulare e i saggi sulla piattaforma μSiM per la costruzione di modelli di barriera emato-encefalica.

Utilizzo della piattaforma tissutale barriera MicroSiM (μSiM) per la modellazione della barriera emato-encefalica

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Stiamo sviluppando un modello GI tissutale della barriera emato-encefalica per comprendere l'impatto della sepsi sul cervello e il contributo dei fattori trasmissibili per via ematica. Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Abbiamo in programma di valutare il contributo dei fattori genetici alla suscettibilità di alcune popolazioni di pazienti.Le attuali sfide sperimentali all'interno della comunità dei chip tissutali sono la riproducibilità dei risultati e l'adozione di tecniche da parte di laboratori esterni. I design unici dei chip tissutali, i piccoli volumi all'interno dei chip tissutali e la mancanza di saggi funzionali standard contribuiscono a queste sfide e spesso limitano gli utenti ai test basati sulla fluorescenza come output primario. I dispositivi Micro simm offrono modularità per una modellazione in vitro versatile, una superficie leggera in vetro ideale per l'imaging lifestyle ad alta risoluzione e una nanomembrana ultra syn 100 nanometri altamente prodotta, che garantisce diafonia solubile senza soluzione di continuità e saggi di permeabilità precisi.Con il micro simm, abbiamo visto che specifici tipi di cellule tendono a produrre più proteine della matrice che forniscono un'impalcatura di supporto intorno ai vasi sanguigni cerebrali. Ora possiamo chiederci se l'infiammazione induce queste stesse cellule a rafforzare o rompere le loro matrici, alterando così l'integrità della barriera. In futuro, aggiungeremo un altro compartimento al modello con cellule verdi come astrociti e microglia per studiare come queste cellule interagiscono con la barriera emato-encefalica in caso di infiammazione sistemica come la sepsi.Abbiamo anche in programma di indagare ulteriori cause di infiammazione sistemica come il delirio postoperatorio, sovrapposto alla demenza.

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Bioingegneria

Questo metodo descrive come isolare e immortalare cellule endoteliali microvascolari di cervello di topo. Descriviamo un passo-passo protocollo partire dalla omogeneizzazione del tessuto cerebrale, mineralizzazione, semina e immortalizzazione delle cellule. Di solito, ci vogliono circa cinque settimane per ottenere una omogenea, immortalato linea microvascolare delle cellule endoteliali.

Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Cervello Modello barriera

Istituzione di modelli umani della barriera emato-encefalica (BBB) ​​può beneficiare la ricerca sulle condizioni del cervello connesse con il fallimento BBB. Descriviamo qui una tecnica migliorata per la preparazione di un modello BBB contatto, che consente coculturing di astrociti e cellule endoteliali cervello sui lati opposti di una membrana porosa.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

Lo scopo di questo studio era di convalidare la riproducibilità di un modello in vitro BBB coinvolge un singenici ratto co-coltura delle cellule endoteliali e astrociti. Il monostrato di cellule endoteliali presentato TEER alta e bassa permeabilità LY. Espressione di proteine ​​TJ specifici, sono state valutate le risposte funzionali ai infiammazione e la funzionalità dei trasportatori e recettori.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

Qui, descriviamo un modello murino in vitro della barriera emato-encefalica che fa uso della spettroscopia delle cellule di impedenza, con particolare attenzione alle conseguenze sull'integrità e la permeabilità delle cellule endoteliali in seguito all'interazione con le cellule T attivate.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

L'obiettivo del protocollo è di presentare una procedura ottimizzata per la creazione di un modello in vitro barriera ematomeningea (BBB) basato sulle cellule endoteliali cerebrali primari porcina (pBECs). Il modello mostra un'elevata riproducibilità, alta tenuta ed è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare nella scoperta della droga.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

Capillari cerebrali isolate da tessuto cerebrale umano possono essere utilizzati come un modello preclinico per studiare la funzione di barriera in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per isolare i capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco.

Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco

Qui presentiamo un protocollo che descrive l'impostazione di un cellulo in BBB (barriera ematoencefalica)-cultura di poliestere membrana porosa Minibrain inserire il sistema al fine di valutare il trasporto di biomolecole o agenti infettivi attraverso un Bee umano e loro impatto fisiologico sulle cellule cerebrali adiacenti.

Un modello di interfaccia sangue-cervello umano per studiare barriera attraversamenti di agenti patogeni o farmaci e loro interazioni con il cervello

La barriera emato-encefalica (BBB) è un'unità neurovascolare multicellulare che regola strettamente l'omeostasi cerebrale. Combinando gli iPSC umani e le tecnologie organ-on-chip, abbiamo generato un chip BBB personalizzato, adatto per la modellazione delle malattie e le previsioni di penetrazione dei farmaci del SNC. Viene descritto un protocollo dettagliato per la generazione e il funzionamento del chip BBB.

Generazione di un chip di barriera emato-encefalica basata sull'iPSC umano

Questo protocollo descrive un metodo per stabilire un modello umano di barriera emato-encefalica (BBB) in vitro . Le cellule endoteliali e i periciti sono seminati su ciascun lato di un filtro inserto (compartimento sanguigno) e gli astrociti sono seminati nel pozzetto inferiore (compartimento cerebrale). Il modello caratterizzato è stato utilizzato per esperimenti di trasporto di nanoparticelle.

Un sistema di cellule a tripla coltura che modella la barriera emato-encefalica umana

La barriera emato-encefalica (BBB) ha un ruolo cruciale nel sostenere un ambiente cerebrale stabile e sano. La disfunzione della BBB è associata a molte malattie neurologiche. Abbiamo sviluppato un modello 3D derivato da cellule staminali della BBB per studiare la patologia cerebrovascolare, l'integrità della BBB e il modo in cui la BBB viene alterata dalla genetica e dalla malattia.

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

Questo protocollo descrive una piattaforma di coltura cellulare riconfigurabile basata su membrana che integra il formato a pozzetto aperto con capacità di flusso del fluido. Questa piattaforma è compatibile con i protocolli standard e consente transizioni reversibili tra le modalità di coltura a pozzetto aperto e microfluidica, soddisfacendo le esigenze dei laboratori di ingegneria e bioscienze.

Trasformazione di modelli di tessuto barriera statico in sistemi microfisiologici dinamici

Scopri la modellazione della barriera emato-encefalica con la piattaforma MicroSiM utilizzando cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo consente di studiare gli effetti della sepsi sul cervello in vitro.

Utilizzo della piattaforma tissutale barriera MicroSiM (μSiM) per la modellazione della barriera emato-encefalica

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