Name: Produzione di cellule T del recettore dellantigene chimerico su un processore cellulare automatizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Impara la produzione semi-automatizzata di cellule CAR T per terapie cellulari e geniche utilizzando un processore cellulare a sistema chiuso. Questo metodo offre flessibilità e riduce i costi rispetto alle alternative commerciali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano riconoscere il contributo di diversi individui e organizzazioni a questo lavoro. Il Laboratorio di Terapia Cellulare e Genica e il Laboratorio di Studi Traslazionali e Correlativi della Penn hanno fornito una preziosa assistenza per lo sviluppo del processo e la preparazione per le richieste di IND. Melissa Varghese e Amanda DiNofia hanno contribuito allo sviluppo del processo e alla preparazione per le presentazioni IND che sono alla base di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di accelerazione della Cell and Gene Therapy Collaborative del Children's Hospital di Filadelfia. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Miltenyi Biotec per il supporto tecnico e di ricerca. La Figura 1 è coperta da copyright © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG; Tutti i diritti riservati.

Processore automatizzato per la produzione di cellule CAR-T su scala clinica

<ol><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Shah, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+anti-CD20%2C+anti-CD19+CAR+T+cells+for+relapsed+B+cell+malignancies%3A+A+phase+1+dose+escalation+and+expansion+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial.</a> Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+humanized+CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-modified+T+cells+in+children+and+young+adults+with+relapsed%2Frefractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 128 (22), 217(2016).</li>
<li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+manufacturing+of+CAR-T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li>
<li>Fernández, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-compliant+manufacturing+of+NKG2D+CAR+memory+T+cells+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy.</a> Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361(2019).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20%2F19+chimeric+antigen+receptor+T+Cells+using+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li>
<li>Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clinical+grade+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+produced+using+automated+CliniMACS+prodigy+system%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system.</a> Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).</li>
<li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li>
<li>Miltenyi Biotec. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CliniMACS+Prodigy+User+Manual%22">CliniMACS Prodigy User Manual</a>. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chemistry%2C+manufacturing%2C+and+control+%28CMC%29+information+for+human+gene+therapy+investigational+new+drug+applications+%28INDs%29+guidance+for+industry%22">Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Considerations+for+the+development+of+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+products+draft+guidance+for+industry%22">Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).</li>
</ol>

S.K., S.G. e Y.W. hanno ricevuto supporto per la ricerca da Miltenyi Biotec.

La terapia cellulare CAR-T è emersa come un approccio terapeutico promettente per le cellule B e altre neoplasie maligne. Tuttavia, i metodi tradizionali di produzione di celle CAR-T presentano diverse limitazioni, come i costi elevati, la produzione ad alta intensità di manodopera e le fasi aperte che aumentano il rischio di contaminazione. Recentemente, sono emerse diverse piattaforme semi-automatizzate, tra cui Miltenyi CliniMACS Prodigy (il "processore"), per affrontare queste limitazioni. Il processo di trasduzione ...

Il trasferimento adottivo di cellule T ingegnerizzate per esprimere un recettore chimerico dell'antigene (CAR) ha mostrato una notevole efficacia nel trattamento di pazienti con neoplasie refrattarie a cellule B 1,2,3,4,5. Tuttavia, i metodi di produzione tradizionali per le celle CAR-T sono laboriosi, richiedono molto tempo e tecnici altamente qualificati per eseguire passaggi altamente specializzati. Ad esempio, il processo di produzione tradizionale di un prodotto a base di cellule CAR-T autologhe prevede la centrifugazione a gradiente di densità, l'elutriazione o la separazione magnetica per arricchire le cellule T, l'attivazione e la trasduzione con un vettore virale in un matraccio sterile e l'espansione in un bioreattore prima della raccolta e della formulazione. Recentemente sono emersi vari sistemi che mirano ad automatizzare parzialmente questo processo. Ad esempio, il Miltenyi CliniMACS Prodigy (di seguito denominato "processore") è un dispositivo automatizzato per l'elaborazione delle cellule in grado di eseguire molti di questi passaggi in modo automatizzato 6,7,8,9. Una discussione approfondita dei metodi di produzione CAR-T tradizionali e automatizzati è presentata in un recente articolo di revisione10.
Il processore si basa sulla funzionalità di CliniMACS Plus, un dispositivo medico approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) statunitense per l'elaborazione di cellule progenitrici ematopoietiche. Il processore include un'unità di coltivazione cellulare che consente il lavaggio, il frazionamento e la coltivazione automatizzati delle cellule (Figura 1). Il processo di trasduzione delle cellule T (TCT) è un programma preimpostato all'interno del dispositivo del processore che replica in gran parte la produzione manuale di celle CAR-T. TCT consente l'elaborazione personalizzabile delle celle utilizzando un'interfaccia utente grafica (la "Matrice delle attività", Figura 2). Poiché il processore automatizza molti passaggi e consolida la funzionalità di più dispositivi in un'unica macchina, richiede meno formazione e competenze specializzate per la risoluzione dei problemi da parte dei tecnici. Poiché tutte le fasi vengono eseguite all'interno di un set di tubi chiuso e monouso, il processore può essere utilizzato in strutture con infrastrutture di trattamento dell'aria meno rigorose di quelle che sarebbero considerate accettabili per un processo di produzione aperto. Ad esempio, stiamo gestendo il processore in uno stabilimento certificato come ISO classe 8 (paragonabile al grado C dell'UE).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg"> Figura 1: Produzione di cellule CAR-T utilizzando il sistema di trasduzione delle cellule T. Nell'immagine è mostrato il processore con il set di tubi installato. Il set di tubi consente di collegare altri componenti come sacche contenenti tampone di lavorazione, terreno di coltura e vettore lentivirale tramite saldatura sterile. Una volta che il prodotto per la leucoaferesi è stato aggiunto al sacchetto di applicazione, può essere etichettato con perline di selezione delle cellule T, fatto passare attraverso la colonna di separazione e quindi trasferito nel sacchetto di riapplicazione. Le cellule selezionate vengono quindi indirizzate all'unità di coltura dello strumento per la coltura e attivate con il reagente di attivazione (vedere la tabella dei materiali). Il prodotto finale viene raccolto nella sacca cellulare Target. Durante tutto il processo, è possibile prelevare i campioni per il controllo qualità in modo asettico. I numeri grigi all'interno dei cerchi rappresentano le valvole numerate sul processore che dirigono il percorso del liquido attraverso il set di tubi. Riprodotto con permesso da 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg"> Figura 2: Matrice delle attività. Dopo la selezione e l'attivazione delle cellule T, il resto del processo di produzione delle cellule CAR-T è completamente personalizzabile. Le attività possono essere aggiunte o eliminate e pianificate per il giorno e l'ora appropriati ed è possibile specificare il volume delle impostazioni cultura dopo l'attività (Volume). Ad esempio, l'attività di trasduzione è stata configurata per iniziare alle 10:00 del giorno 1 e il volume di coltura alla fine dell'attività è stato impostato su 100 ml. La Matrice delle Attività può essere modificata durante tutto il periodo di coltivazione. Lo stato del processo può essere monitorato sullo schermo integrato del dispositivo di elaborazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Lo scopo di questo manoscritto è quello di fornire una guida dettagliata alla produzione di cellule CAR-T utilizzando il processore e fornire inoltre indicazioni sui test in corso e di rilascio del prodotto che saranno probabilmente richiesti dalle autorità di regolamentazione per approvare una domanda di nuovo farmaco sperimentale (IND). Il protocollo presentato rimane vicino all'approccio raccomandato dal fornitore ed è il protocollo alla base di IND 28617, che è attualmente in fase di valutazione in uno studio clinico di fase I/II avviato da un singolo sperimentatore. Questo studio mira a determinare la sicurezza e l'efficacia dell'utilizzo di questo processore per produrre cellule CAR-T autologhe umanizzate dirette da CD19 per pazienti con leucemia linfoblastica acuta a cellule B (B-ALL) o linfoma linfoblastico di linea B (B-LLY) [NCT05480449]. Lo studio è iniziato a settembre 2022 e prevede di arruolare fino a 89 pazienti di età compresa tra 0 e 29 anni con B-ALL o B-Lly. Riportiamo nel manoscritto alcuni risultati di fabbricazione della prova.
Vorremmo sottolineare che, sebbene il manoscritto sia presentato come un protocollo con i passaggi da seguire, dovrebbe essere considerato un punto di partenza per altri per iniziare a ottimizzare il proprio processo di produzione di cellule CAR-T. Un elenco non esaustivo di possibili variazioni al protocollo presentato include: l'utilizzo di cellule T fresche invece di quelle crioconservate come materiale di partenza; l'utilizzo di un metodo diverso di arricchimento delle cellule T o l'omissione del tutto; l'utilizzo di diversi terreni e cocktail di citochine come IL7/IL15 invece di IL2; variare la concentrazione di AB sierico umano o ometterla del tutto; tempi di trasduzione; l'utilizzo di trasduzioni "multi-hit"; variare l'agitazione, i volumi di coltura e il programma di alimentazione; l'utilizzo di diversi metodi di trasferimento genetico, tra cui l'elettroporazione di acidi nucleici o vettori non lentivirali; utilizzando un tampone e/o crioprotettore di formulazione finale diverso; e l'infusione di cellule CAR-T fresche invece di crioconservarle per l'infusione in un secondo momento. Queste variazioni possono avere un impatto significativo sulla composizione cellulare e sulla potenza del prodotto terapeutico.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fase complessiva del processo</td>
			<td>Giorno del processo</td>
			<td colspan="4">Dettagli tecnici</td>
		</tr><tr><td>Arricchimento cellulare</td>
			<td rowspan="2">Giorno 0</td>
			<td colspan="4">Selezione di cellule T CD4+/CD8+</td>
		</tr><tr><td>Attivazione cellulare</td>
			<td colspan="4">Semina e attivazione di colture di cellule T</td>
		</tr><tr><td>Trasduzione cellulare</td>
			<td>Giorno 1</td>
			<td colspan="4">Trasduzione lentivirale (volume di coltura di 100 mL)</td>
		</tr><tr><td rowspan="12">Espansione cellulare (seguita dalla formulazione cellulare)</td>
			<td>Giorno 2</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>Giorno 3</td>
			<td colspan="4">Lavaggio coltura (1 ciclo); Scuotitore attivato; Il volume di coltura aumenta a 200 mL</td>
		</tr><tr><td>Giorno 4</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr><tr><td>Giorno 5</td>
			<td colspan="4">Mangime (50 ml); Il volume di coltura raggiunge il volume finale di 250 mL</td>
		</tr><tr><td>Giorno 6</td>
			<td colspan="4">Campione in corso di lavorazione; Scambio di terreni (-125 mL / +125 mL)</td>
		</tr><tr><td>Giorno 7</td>
			<td colspan="4">Scambio di terreni (-150 mL / +150 mL) o Raccolta</td>
		</tr><tr><td>Giorno 8</td>
			<td colspan="4">Campione in corso di lavorazione; Scambio di terreni (-150 mL / +150 mL) o Raccolta</td>
		</tr><tr><td>Giorno 9</td>
			<td colspan="4">Scambio di terreni (-180 mL / +180 mL) o Raccolta</td>
		</tr><tr><td>Giorno 10</td>
			<td colspan="4">Campione in corso di lavorazione; Scambio di terreni (-180 mL / +180 mL) o Raccolta</td>
		</tr><tr><td>Giorno 11</td>
			<td colspan="4">Scambio di terreni (-180 mL / +180 mL) o Raccolta</td>
		</tr><tr><td>Giorno 12</td>
			<td colspan="4">Scambio di terreni (-180 mL / +180 mL) o Raccolta</td>
		</tr><tr><td>Giorno 13</td>
			<td colspan="4">Raccolto</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Sequenza temporale e panoramica del processo. Questa tabella riassume le fasi del processo TCT impiegate in uno studio clinico in corso [NCT05480449]. Il processo inizia con l'arricchimento delle cellule T mediante selezione CD4+/CD8+, semina e attivazione della coltura il giorno 0, seguito dalla trasduzione il giorno 1. Le cellule riposano per 48 ore, seguite da un lavaggio della coltura, un aumento del volume della coltura a 200 ml e agitazione mediante un meccanismo di agitazione. Il giorno 6 viene prelevato il primo campione in lavorazione. Le cellule vengono raccolte quando sono disponibili cellule sufficienti per almeno tre dosi complete di cellule CAR-T (5 × 106 cellule CAR-T/kg se il paziente pesa &lt;50 kg, altrimenti 2,5 × 108 cellule CAR-T) e test di controllo qualità (~2 × 106 cellule CAR-T); o una volta che la coltura raggiunge un totale di 4-5 x 109 cellule. Abbreviazioni: TCT = trasduzione delle cellule T; CAR-T = cellule T chimeriche del recettore dell'antigene; MACS = selezione cellulare attivata magneticamente.

<table><tbody><tr><td>12 provette in borosilicato da 75 Charles</td><td>River</td><td>TL1000</td><td></td></tr><tr><td>Sacca per reagenti da 20 mL</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-631</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>Fisher</td><td>05-539-10</td><td></td></tr><tr><td>Set di trasferimento da 150 mL</td><td>Fenwal</td><td>4R2001</td><td></td></tr><tr><td>Set di trasferimento da 2.000 mL</td><td>Fenwal</td><td>4R2041</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BDB559925</tr><tr><td>Alcohol Prep</td><td>Tyco/Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bag Access</td><td>Medline</td><td>2300E-0500</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-643</td><td></td></tr><tr><td>CD19 Reagente di rilevamento CAR Biotina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-129-550</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>BD</td><td>555413</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC</td><td>BD</td><td>340440</td><td></td></tr><tr><td>CD4 VioBright FITC REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-229</td><td></td></tr><tr><td>CD45 VioBlue REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-637</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-681</td><td></td></tr><tr><td>Perline di riferimento per cellometro 10um</td><td>Nexcelom</td><td>B10-02-020</td><td></td></tr><tr><td>Perline di riferimento per cellometro 15um</td><td>Nexcelom</td><td>B15-02-010</td><td></td></tr><tr><td>Perline di riferimento per cellometro 5um</td><td>Nexcelom</td><td>B05-02-050</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per cellometro</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS CD4 GMP MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>276-01</td><td>Il reagente CD4</td></tr><tr><td>CliniMACS CD8 GMP MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>275-01</td><td>Il reagente CD8</td></tr><tr><td>CliniMACS PBS / EDTA Tampone</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-201</td><td>Il tampone</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Origen</td><td>CP-10</td><td></td></tr><tr><td>Sacca di congelamento 50 mL</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>Fiala di congelamento, 1,8 mL</td><td>Nunc</td><td>12565171N</td><td></td></tr><tr><td>Fiala di congelamento, 4,5 mL</td><td>Nunc</td><td>12565161N</td><td></td></tr><tr><td>Siero AB umano</td><td>Valley Biomedical</td><td></td><td>Sterile albumina sierica umana filtrata e inattivata a caldo</td></tr><tr><td>25%</td><td>Grifols</td><td>68516-5216-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica umana 5%</td><td>Grifols</td><td>68516-5214-1</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP ricombinante umano IL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-148</td><td>Le citochine</td></tr><tr><td>MACS GMP T Cell TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-076-202</td><td>Il reagente</td></tr><tr><td>di attivazione MycoSeq Mycoplasma Kit di rilevamento</td><td>Life Technologies</td><td>4460623</td><td></td></tr><tr><td>aghi, aghi ipodermici 14G</td><td>Medline</td><td>SWD200573</td><td></td></tr>, punte per pipette <tr><td>SlideSafe 18G</td><td>BD</td><td>B-D305918</td><td></td></tr><tr><td>, 2-200 &; L, confezionato singolarmente</td><td>Eppendorf</td><td>022492209</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette, 50-1000 &mu; L, confezionato singolarmente</td><td>Eppendorf</td><td>022492225</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 10 mL</td><td>Fisher</td><td>13-678-27F</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 25 mL</td><td>Fisher</td><td>13-675-30</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 5 mL</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Plasmalyte-A</td><td>Baxter</td><td>2B2544X</td><td>La soluzione elettrolitica</td></tr><tr><td>Prodigy TS520 Set di tubi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076- 600</td><td>Il set di tubi</td></tr><tr><td>Campo sterile</td><td>Medline</td><td>NON21001</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-793</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 3 mL</td><td></td><td>BD 309657</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 30 mL</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>Siringa 50 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-306</td><td>Il medium</td></tr><tr><td>Adattatore a triplo campionamento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-609</td><td></td></tr><tr><td>Vettore virale</td><td>CHOP Vettore clinico Core</td><td></td><td>huCART19</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet</td><td>The Baker Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-075-301</td><td>Il processore</td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer Planer</td><td>/Kryosave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endosafe nexgen-PTS150K</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mettler Balance</td><td>Mettler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD Saldatrice per tubi sterili</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sebra Sigillante per tubi</td><td>Sebra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varitherm</td><td>Barkey</td><td></td><td>Il dispositivo di disgelo a secco</td></tr><tr><td>XN-330 Analizzatore ematologico</td><td>Sysmex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produzione di cellule t del recettore dell'antigene chimerico su un processore cellulare automatizzato

Chimeric Antigen Receptor T Cell Manufacturing on an Automated Cell Processor

Le cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR)-T rappresentano un promettente approccio immunoterapico per il trattamento di varie malattie maligne e non maligne. Le cellule CAR-T sono cellule T geneticamente modificate che esprimono una proteina chimerica che riconosce e si lega a un bersaglio della superficie cellulare, con conseguente uccisione della cellula bersaglio. I metodi tradizionali di produzione di celle CAR-T sono laboriosi, costosi e possono comportare il rischio di contaminazione. Il CliniMACS Prodigy, un processore cellulare automatizzato, consente di produrre prodotti per la terapia cellulare su scala clinica in un sistema chiuso, riducendo al minimo il rischio di contaminazione. L'elaborazione avviene in modo semiautomatico sotto il controllo di un computer e quindi riduce al minimo il coinvolgimento umano nel processo, risparmiando tempo e riducendo la variabilità e gli errori.
Questo manoscritto e video descrivono il processo di trasduzione delle cellule T (TCT) per la produzione di cellule CAR-T utilizzando questo processore. Il processo TCT prevede l'arricchimento, l'attivazione, la trasduzione con un vettore virale, l'espansione e la raccolta delle cellule T CD4+/CD8+. Utilizzando la Matrice delle Attività, una funzionalità che consente l'ordinamento e la tempistica di questi passaggi, il processo TCT può essere ampiamente personalizzato. Forniamo una panoramica della produzione di cellule CAR-T in conformità con le attuali buone pratiche di fabbricazione (cGMP) e discutiamo i test di rilascio richiesti e gli esperimenti preclinici che supporteranno una domanda di nuovo farmaco sperimentale (IND). Dimostriamo la fattibilità e discutiamo i vantaggi e gli svantaggi dell'utilizzo di un processo semiautomatico per la produzione clinica di cellule CAR-T. Infine, descriviamo uno studio clinico in corso avviato dallo sperimentatore che prende di mira le neoplasie pediatriche a cellule B [NCT05480449] come esempio di come questo processo di produzione possa essere applicato in un contesto clinico.

I risultati dei primi tre cicli di produzione di CAR-T della prova NCT05480449 sono presentati di seguito nella Tabella 3. Il materiale di partenza, il vettore, le citochine di coltura e le concentrazioni sieriche AB sono state mantenute coerenti per ogni corsa. I prodotti sono stati raccolti il giorno 7 o 8. La crescita cellulare media giornaliera è stata del 46% (aumento del numero totale di cellule), indicando che il processo TCT è stato efficace nel promuovere l'espansione cellulare. Questi risultati...

Questo articolo descrive in dettaglio il processo di produzione delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico per uso clinico, in particolare utilizzando un processore cellulare automatizzato in grado di eseguire la trasduzione virale e la coltivazione delle cellule T. Forniamo raccomandazioni e descriviamo le insidie che dovrebbero essere considerate durante lo sviluppo del processo e l'implementazione di uno studio clinico in fase iniziale.

Produzione di cellule T del recettore dell'antigene chimerico su un processore cellulare automatizzato

Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells represent a promising immunotherapeutic approach for the treatment of various malignant and non-malignant ...

Il vantaggio del nostro protocollo è che si tratta di un sistema semi-automatizzato e chiuso che offre comunque flessibilità. I passaggi ad alta intensità di lavoro vengono sostituiti dall'automazione, che viene eseguita da un computer e, poiché viene eseguita da un computer, l'utente può personalizzare il proprio protocollo. Anche questo viene fatto in un sistema chiuso.Abbiamo scoperto che il tipo di laboratori di cellule staminali che sono comunemente presenti negli ospedali hanno la capacità di produrre cellule CAR-T di grado clinico a costi significativamente inferiori rispetto alle alternative commerciali. Pensiamo che il nostro processo potrebbe essere facilmente adattato per rendere le cellule CAR-T specifiche per altri bersagli e anche per produrre altri tipi di terapie cellulari e geniche. Il nostro team è pronto a esplorare altri bersagli cellulari CAR-T e nuove terapie geniche.Su scala più ampia, le terapie cellulari e geniche si stanno espandendo rapidamente e siamo entusiasti di continuare a sostenere e innovare in questo entusiasmante campo.

chimeric-antigen-receptor-t-cell-manufacturing-on-an-automated-cell

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Questo video mostra una tecnica per produrre cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) ex vivo. Le cellule T umane sono incubate con biglie magnetiche rivestite con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28, insieme a un terreno integrato con interleuchina-2 (IL-2), che porta all'attivazione e alla proliferazione delle cellule T. Vengono introdotti vettori lentivirali transgenici, che consentono all'RNA transgenico di integrarsi nel genoma ospite ed esprimere il transgene. Ciò si traduce in...

Una tecnica ex vivo per produrre cellule T del recettore dell'antigene chimerico

L'obiettivo di questo protocollo è produrre cellule T di grado clinico specifiche per i patogeni utilizzando un dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione automatizzato da banco che incorpora un sistema chiuso di cattura delle citochine e non richiede personale dedicato o l'uso di una struttura GMP. Le cellule T specifiche per il citomegalovirus pp65 generate possono essere somministrate direttamente ai pazienti.

Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura

Descriviamo un sistema quantitativo di analisi della citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico che prendono di mira le cellule tumorali liquide e solide. Questo protocollo può essere esteso per valutare altre cellule echeggiatrici immunitarie, così come i trattamenti combinati.

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Descriviamo un approccio per generare in modo affidabile le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) e testare la loro differenziazione e funzione in vitro e in vivo.

Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per l'immunoterapia adottiva

Questo protocollo delinea il processo di trasduzione delle cellule T umane primarie con un gene di interesse, garantendo la compatibilità con gli standard delle buone pratiche di fabbricazione (GMP).

Una procedura conforme alle GMP per la generazione di cellule T geneticamente modificate

Questo protocollo semplifica la produzione di vettori retrovirali e la trasduzione delle cellule T murine, facilitando la generazione efficiente di cellule CAR-T di topo.

Generazione efficiente di cellule T del recettore chimerico murino dell'antigene (CAR)-T

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro semplificato per generare e testare cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano (CAR Tregs).

Generazione di cellule T regolatorie del recettore dell'antigene chimerico umano

Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per la coltivazione delle cellule T primarie, inclusi il loro isolamento, attivazione, espansione e trasfezione transitoria tramite elettroporazione dell'mRNA. Inoltre, viene proposto un flusso di lavoro e un pannello di anticorpi per l'analisi citometrica a flusso del fenotipo, dei marcatori di attivazione, della vitalità e dell'espressione del recettore antigenico chimerico (CAR).

Isolamento, coltivazione e trasfezione transitoria delle cellule T primarie umane per generare cellule T del recettore antigenico chimerico (CAR)

Un elevato throughput, piattaforma automatizzata di sviluppo delle cellule linea di produzione per la produzione di proteine ​​terapeutiche è descritto. Implementazione di Cell BD FACS sorter Aria, CloneSelect Imager e TECAN Libertà sistema di movimentazione EVO liquido ha dimostrato capacità di elaborazione significativamente aumentata in linea con lo sviluppo delle cellule migliore qualità linea cellulare e alta riproducibilità.

A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

Questo protocollo permette di identificare fattori che modulano funzionale massa delle cellule beta per trovare potenziali bersagli terapeutici per il trattamento del diabete. Il protocollo consiste in un metodo semplificato per valutare la replicazione delle isole e la funzione delle cellule beta in isole di ratto isolati dopo manipolazione genica con adenovirus.

Isolotti roditori Valutazione di replica e la funzione delle cellule beta in Adenovirally-trasdotte Isolati

Impara la produzione semi-automatizzata di cellule CAR T per terapie cellulari e geniche utilizzando un processore cellulare a sistema chiuso. Questo metodo offre flessibilità e riduce i costi rispetto alle alternative commerciali.

Produzione di cellule T del recettore dell'antigene chimerico su un processore cellulare automatizzato

Esplora altri video