Name: Finestra stabilizzata per limaging intravitale del pancreas murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Scopri la tecnica SWIP per l'imaging intravitale ad alta risoluzione del pancreas murino. Questo metodo consente studi longitudinali seriali delle condizioni pancreatiche sane e patologiche, migliorando la comprensione dell'adenocarcinoma e della pancreatite.

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La Evelyn Lipper Charitable Foundation, il Gruss-Lipper Biophotonics Center, l'Integrated Imaging Program for Cancer Research, una borsa di studio NIH T-32 (CA200561) e una sovvenzione del Dipartimento della Difesa Pancreatic Cancer Research Program (PCARP) PA210223P1.

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti per l'uso di animali vertebrati, inclusa la previa approvazione da parte dell'Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Passivazione delle finestre
NOTA: La passivazione dell'acciaio inossidabile pulisce il metallo dai contaminanti e crea un sottile strato di ossido che aumenta notevolmente la biocompatibilità del metallo con i tessuti molli, anche oltre quella del titanio16.
<ol><li>Avviare il processo di passivazione lavando i serramenti ottici con una soluzione detergente enzimaticamente attiva all'1% (p/v).</li>
	<li>Immergere i telai in una soluzione di idrossido di sodio al 5% (p/v) a 70 °C per 30 minuti all'interno di un barattolo di vetro.</li>
	<li>Estrarre i telai e sciacquarli con acqua deionizzata.</li>
	<li>Immergere i telai in una soluzione di acido citrico al 7% (p/v) a 55 °C per 10 minuti all'interno di un nuovo barattolo di vetro.</li>
	<li>Rimuovere i telai e risciacquarli nuovamente con acqua deionizzata.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 1.2 e, infine, sciacquare un'ultima volta i telai delle finestre con acqua deionizzata.</li>
</ol>2. Preparazione per l'impianto del tumore o la chirurgia della finestra
NOTA: Per gli studi sui tumori del pancreas, le cellule tumorali devono essere impiantate e lasciate crescere in tumori conclamati. Per visualizzare le cellule tumorali in vivo, si raccomanda di utilizzare cellule che sono state geneticamente modificate per esprimere proteine fluorescenti come Dendra2. L'uso di etichette proteiche fluorescenti luminose mitigherà potenziali problemi con l'autofluorescenza tissutale. Altre potenziali proteine fluorescenti, coloranti e modelli murini fluorescenti geneticamente codificati che possono essere utilizzati sono stati discussi altrove17,18. Per prevenire la contaminazione del campo operatorio, eseguire la procedura chirurgica in una cappa o in un armadio a flusso laminare e assicurarsi che vengano utilizzate aree distinte per la preparazione, l'intervento chirurgico e il recupero.
<ol><li>Prima dell'intervento, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave e, se necessario, utilizzare uno sterilizzatore a microsfere calde per le procedure successive. Assicurati che l'intervento chirurgico utilizzi una tecnica di sole punte.</li>
	<li>Accendere il tampone chirurgico riscaldato e lo sterilizzatore a microsfere e attendere che raggiunga la temperatura di esercizio appropriata. La temperatura del termoforo deve essere monitorata con un termometro di superficie per evitare potenziali ustioni. Posizionare un panno sterile sul termoforo se la temperatura non può essere controllata adeguatamente. NOTA: La temperatura corporea durante le procedure brevi (≤20 min), come il tumore e l'impianto di finestre, è minimamente influenzata durante l'utilizzo di un cuscinetto chirurgico riscaldato. Tuttavia, periodi più lunghi di anestesia, come durante l'imaging timelapse prolungato, richiedono che il topo venga posto in una camera riscaldata per mantenere la temperatura corporea.</li>
	<li>Anestetizzare il topo con isoflurano al 5% in una camera di anestesia.</li>
	<li>Passaggio critico: abbassare l'anestesia al 2% una volta che il topo è incosciente. Monitorare attentamente il livello di anestesia e i parametri vitali del topo (ad esempio, utilizzando un pulsossimetro)19.</li>
	<li>Metti una piccola goccia di lubrificante per gli occhi su ciascun occhio del topo per evitare che la cornea si secchi.</li>
	<li>Prima dell'intervento chirurgico, applicare generosamente la crema depilatoria sulla parte superiore sinistra dell'addome per rimuovere i peli. Dopo 20 secondi, utilizzare carta velina inumidita per rimuovere saldamente i peli e la crema depilatoria. Ripetere il processo secondo necessità fino a quando tutti i peli non sono stati rimossi dall'area chirurgica.</li>
	<li>Iniettare 10 μL di buprenorfina (0,1 mg/kg) diluiti in 90 μL di PBS per via sottocutanea per garantire l'analgesia preoperatoria.</li>
</ol>3. Impianto di tumore al pancreas
<ol><li>Preparare aliquote di cellule tumorali alla concentrazione desiderata (in base al tempo di raddoppio delle cellule tumorali). Mettere la sospensione cellulare in una siringa da insulina e tenerla in ghiaccio. Per seguire questo protocollo, utilizzare 106 cellule tumorali KPC singeniche 20 sospese in un massimo di 50 μL di PBS, seguendo il protocollo di iniezione ortotopica adattato da Erstad etal.21 NOTA: Questa linea cellulare iniettata a questa concentrazione ha prodotto abitualmente tumori palpabili o adeguatamente grandi entro 10-14 giorni. I subcloni di questa linea cellulare e di altre linee cellulari pancreatiche dovrebbero essere valutati per concentrazioni e tempistiche appropriate per produrre tumori di dimensioni appropriate).</li>
	<li>Lavarsi le mani con sapone antisettico.</li>
	<li>Prima di ogni nuovo intervento chirurgico, indossare nuovi guanti sterili.</li>
	<li>Trasferire il mouse sul cappuccio chirurgico sterile e posizionarlo in una posizione di decubito laterale destro parziale.</li>
	<li>Fissare gli arti con del nastro di carta. NOTA: L'uso corretto degli strumenti è importante durante tutta la procedura. Esempi di come tenere in mano la pinza, le forbici Castroviejo e lo strumento di raccolta del vuoto sono mostrati nella Figura 2A-C.</li>
	<li>Sterilizzare l'addome con antisettico (Figura 2D).</li>
	<li>Assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato eseguendo un test di pizzicamento delle dita dei piedi.</li>
	<li>Praticare un'incisione sottocostale sinistra di 10-15 mm nella pelle utilizzando una pinza e le forbici Castroviejo (Figura 2E).</li>
	<li>Controllare l'emostasi utilizzando tamponi di cotone o una penna per cauterizzazione quando/dove ritenuto necessario.</li>
	<li>Dividere con cura il muscolo sottostante con una pinza e una forbice di Castroviejo per entrare nel peritoneo (Figura 2F).</li>
	<li>Utilizzando tamponi di cotone sterili, esternare in modo atraumatico il pancreas e la milza.</li>
	<li>Allargare il pancreas in modo che non ci siano pieghe (Figura 2G).</li>
	<li>Identificare il sito di iniezione del tumore desiderato nel corpo o nella coda del pancreas (lontano dai vasi sanguigni).</li>
	<li>Passaggio critico: dopo un attento posizionamento del pancreas, utilizzare una pinza per fornire tensione al tessuto e inserire la punta della siringa da insulina, con lo smusso rivolto verso l'alto, nel sito desiderato del pancreas a una profondità di 4-5 mm (Figura 2H).</li>
	<li>Iniettare lentamente la soluzione di cellule tumorali. Cercare una piccola bolla che confermi l'avvenuta iniezione (Figura 2I).</li>
	<li>Riportare con cautela il pancreas nell'addome senza disturbare la bolla di iniezione delle cellule tumorali (Figura 2J).</li>
	<li>Utilizzando suture riassorbibili in polidiossanone 5-0, chiudere prima lo strato muscolare e poi la pelle con punti di sutura interrotti (Figura 2K-N).</li>
	<li>Coprite l'incisione con colla cianoacrilica (Figura 2O), quindi rimettete il topo in una gabbia pulita sotto una lampada riscaldante per il recupero. Somministrare antibiotici nell'acqua potabile per prevenire l'infezione. Monitora i topi e consenti loro di riprendersi completamente dall'intervento chirurgico. NOTA: Gli antibiotici vengono somministrati come richiesto dal protocollo IACUC. Tutti gli animali sono alloggiati individualmente.</li>
	<li>Lasciare che il tumore si sviluppi per 10-14 giorni fino a quando non è palpabile attraverso la parete addominale.</li>
</ol>4. Chirurgia della finestra del pancreas
<ol><li>Quando gli animali sono pronti per l'imaging, iniziare l'intervento chirurgico di impianto della finestra. Per iniziare, lavati le mani con sapone antisettico.</li>
	<li>Prima di ogni nuovo intervento chirurgico, indossare guanti sterili nuovi.</li>
	<li>Sul supporto chirurgico riscaldato, posizionare il mouse nella posizione di decubito laterale destro per esporre l'addome sinistro.</li>
	<li>Ancorare gli arti anteriori e posteriori del topo alla fase chirurgica riscaldata cranialmente e caudalmente utilizzando del nastro di carta. Assicurarsi che la milza (sotto la pelle) sia visibile all'interno del campo operatorio (Figura 3A).</li>
	<li>Per mantenere la sterilità, disimballare tutti gli strumenti chirurgici nel cappuccio.</li>
	<li>Disinfettare il sito chirurgico tamponando la pelle del topo con una generosa applicazione di antisettico.</li>
	<li>Assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato eseguendo un test di pizzicamento delle dita dei piedi.</li>
	<li>Fase critica: sollevare la pelle del quadrante superiore sinistro dell'addome con una pinza e praticare un'incisione circolare di ~10 mm nella pelle e nella muscolatura utilizzando le forbici Castroviejo (Figura 3B,C).</li>
	<li>Controllare l'emorragia e mantenere l'emostasi utilizzando tamponi di cotone o la penna per cauterizzazione, ove necessario.</li>
	<li>Localizzare il pancreas, che è attaccato alla milza, e identificare la direzione in cui il pancreas si trova all'interno dell'incisione per decidere dove posizionare il punto croce di supporto.</li>
	<li>Usando la sutura di seta 5-0, posiziona il primo punto nella posizione desiderata nello strato muscolare. Lega questa estremità con 3-5 nodi. (Figura 3D,E)</li>
	<li>Continua a cucire direttamente attraverso l'incisione. Tagliare e lasciare una coda di ~5 cm (Figura 3F).</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.11 e 4.12 perpendicolarmente al primo punto (Figura 3G,H).</li>
	<li>Passaggio critico: sollevare delicatamente e posizionare il pancreas sopra il punto croce (Figura 3I,J). Fare attenzione a non danneggiare il pancreas durante la manipolazione.</li>
	<li>Passaggio critico: utilizzando la sutura di seta 5-0, eseguire un punto a strappo ~1 mm dal foro, circonferenzialmente, intrecciando la pelle e lo strato muscolare (Figura 3K).</li>
	<li>Posizionare il telaio della finestra in modo che i bordi dell'incisione circolare si trovino all'interno della scanalatura della finestra (Figura 3L).</li>
	<li>Fissare la finestra impiantata legando saldamente la seta 5-0.</li>
	<li>Caricare 100 μL di adesivo cianoacrilato liquido nella siringa da 1 mL.</li>
	<li>Asciugare il tessuto applicando un delicato getto di aria compressa per ~10 s.</li>
	<li>Afferrare il telaio della finestra dal bordo esterno con una pinza e sollevarlo delicatamente per garantire la separazione del pancreas dalla superficie inferiore del telaio della finestra.</li>
	<li>Passaggio critico: erogare un sottile strato di adesivo cianoacrilato liquido lungo l'incavo della finestra (Figura 3M). Assicurati di non far cadere l'adesivo sul tessuto del pancreas.</li>
	<li>Utilizzando i pickup a vuoto, sollevare il vetrino coprioggetti da 5 mm.</li>
	<li>Posizionare con cautela il vetrino coprioggetti all'interno dell'incavo al centro del telaio della finestra ottica. Tenere premuto con una leggera pressione, lasciando che l'adesivo cianoacrilato si solidifichi (~25 s).</li>
	<li>Separare il vetrino coprioggetti dai prelievi a vuoto utilizzando una pinza.</li>
	<li>Stringere le suture a punto croce per fissare saldamente il pancreas al vetrino coprioggetto (Figura 3N,O). Nota: non stringere eccessivamente il punto croce in quanto può causare danni e ischemia al pancreas.</li>
	<li>Tagliare le estremità della sutura.</li>
	<li>Rimuovi il nastro dal mouse.</li>
	<li>Spegnere il vaporizzatore isoflurano.</li>
	<li>Riposizionare il topo in una gabbia pulita o direttamente nel microscopio intravitale.</li>
	<li>Alloggiare gli animali singolarmente dopo l'intervento chirurgico alla finestra e monitorarli fino al completo recupero.</li>
	<li>L'imaging viene quindi eseguito su un microscopio multifotone a due laser, come abbiamo descritto in precedenza 22,23,24 Per lunghe sessioni di imaging, il topo viene posto in una camera riscaldata per mantenere la temperatura corporea e dotato di fluidi di supporto secondo gli standard IACUC.</li>
</ol>5. Trattamento con ceruleina per l'induzione della pancreatite
<ol><li>Per studiare l'insorgenza della pancreatite, trattare i topi sani con ceruleina dopo l'impianto dello SWIP. Assicurarsi che i topi siano a digiuno per 14-18 ore e che gli venga somministrata acqua ad libitum prima della somministrazione di ceruleina.</li>
	<li>Iniettare 50 μg/kg di ceruleina in 100 μL di DPBS sterile 1x per via intraperitoneale a intervalli di 1 ora per un massimo di otto iniezioni. Somministrare un volume equivalente di 1x DPBS da solo, iniettato per via intraperitoneale, ai topi di controllo.</li>
	<li>Dopo l'imaging, sacrificare i topi 24 ore dopo la prima iniezione mediante lussazione cervicale secondo gli standard IACUC.</li>
	<li>Eseguire l'imaging su un microscopio multifotone a due laser come descritto in precedenza22,23,24. Per lunghe sessioni di imaging, posizionare il topo in una camera riscaldata per mantenere la temperatura corporea e fornirgli fluidi di supporto secondo gli standard IACUC.</li>
</ol>

Imaging pancreatico murino utilizzando una finestra stabilizzata impiantata

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<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+the+membrane-fusion+regulator+Munc18c+attenuates+caerulein+hyperstimulation-induced+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).</li>
<li>Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caerulein-induced+acute+necrotizing+pancreatitis+in+mice%3A+protective+effects+of+proglumide%2C+benzotript%2C+and+secretin%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin.</a> Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).</li>
<li>Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microcartography+and+subcellular+imaging+of+tumor+angiogenesis%3A+a+novel+platform+for+translational+angiogenesis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research.</a> Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).</li>
<li>Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+high-resolution+imaging+of+tumor+cells+in+genetically+engineered+and+orthotopic+models+of+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer.</a> Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Il protocollo SWIP qui descritto fornisce un metodo migliorato di stabilizzazione del tessuto pancreatico utilizzando una tecnica a punto croce. Le finestre di imaging addominale precoce (AIW) hanno consentito l'imaging intravitale (IVI) degli organi interni dell'addome, ma non hanno limitato adeguatamente il movimento dei tessuti molli come il pancreas. In risposta, Park et al. hanno sviluppato una finestra di imaging del pancreas (PIW) che incorpora un ripiano metallico orizzontale e consente una migliore stabilizzazio...

Le malattie pancreatiche benigne e maligne sono potenzialmente pericolose per la vita, con notevoli lacune nella comprensione della loro fisiopatologia. La pancreatite, l'infiammazione del pancreas, è la terza causa principale di ricoveri ospedalieri e riammissioni correlati a malattie gastrointestinali negli Stati Uniti ed è associata a morbilità, mortalità e onere socioeconomicosostanziali. Classificato come la terza causa di morte correlata al cancro 2, l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) rappresenta la maggior parte delle neoplasie pancreatiche3 e fa presagire uno scarso tasso di sopravvivenza a 5 anni di solo l'11%2. La principale causa di mortalità correlata al cancro nel PDAC è il carico metastatico schiacciante. Sfortunatamente, la maggior parte dei pazienti presenta una malattia metastatica. Pertanto, la comprensione delle dinamiche delle metastasi nel PDAC è un'esigenza critica insoddisfatta nel campo della ricerca sul cancro.
I meccanismi alla base dell'infiammazione e della cascata metastatica del pancreas sono poco conosciuti. Uno dei principali fattori che contribuiscono a questa lacuna nella conoscenza è l'incapacità di osservare le dinamiche cellulari pancreatiche in vivo. L'osservazione diretta di queste dinamiche cellulari promette di svelare bersagli critici per sfruttare e migliorare la diagnosi e il trattamento delle persone affette da malattie pancreatiche.
L'imaging intravitale (IVI) è una tecnica di microscopia che consente ai ricercatori di visualizzare e studiare i processi biologici negli animali viventi in tempo reale. IVI consente la visualizzazione diretta ad alta risoluzione delle dinamiche intracellulari e microambientali in vivo e all'interno dell'ambiente nativo del processo biologico in questione. Pertanto, l'IVI consente l'osservazione in vivo di processi sani e patologici.
Le moderne modalità di imaging di tutto il corpo come la risonanza magnetica, la PET e la TC offrono un'eccellente visione di interi organi e possono rivelare patologie, anche prima dell'insorgenza dei sintomi clinici4. Non sono in grado, tuttavia, di raggiungere la risoluzione di una singola cellula o di rivelare i primi stadi della malattia-pancreatite o neoplasia.
Ricerche precedenti hanno utilizzato l'IVI a risoluzione singola cellulare per osservare malattie benigne e maligne della pelle5,6, della mammella7, del polmone8, del fegato9, del cervello 10 e dei tumori pancreatici 11, portando a intuizioni sui meccanismi di progressione della malattia 12. Tuttavia, il pancreas murino pone ostacoli significativi al raggiungimento della risoluzione di una singola cellula utilizzando IVI, principalmente a causa della sua posizione viscerale profonda e dell'elevata compliance. Inoltre, è un organo ramificato e diffusamente distribuito all'interno del mesentere che si collega alla milza, all'intestino tenue e allo stomaco, rendendolo di difficile accesso. Il tessuto è anche altamente sensibile al movimento causato dalla peristalsi e dalla respirazione adiacenti. Ridurre al minimo il movimento del pancreas è essenziale per la microscopia a risoluzione di una singola cellula, poiché artefatti da movimento anche di pochi micron possono sfocare e distorcere le immagini, rendendo impossibile il tracciamento della dinamica delle singole cellule13.
Per eseguire l'IVI, è necessario impiantare chirurgicamente una finestra di imaging addominale (AIW) 9,11. Per impiantare chirurgicamente l'AIW, un telaio metallico della finestra viene suturato nella parete addominale. Successivamente, l'organo di interesse viene fissato al telaio utilizzando un adesivo cianoacrilato. Mentre questo è sufficiente per alcuni organi interni rigidi (ad esempio, fegato, milza, tumori rigidi), i tentativi di imaging del pancreas murino sano sono compromessi da una stabilità laterale e assiale non ottimale a causa della struttura conforme del tessuto e dell'architettura complessa14. Per affrontare questa limitazione, Park et al.14 hanno sviluppato una finestra di imaging specificamente progettata per il pancreas sano. Questa finestra per imaging del pancreas (PIW) riduce al minimo l'influenza del movimento intestinale e della respirazione incorporando un ripiano metallico orizzontale all'interno del telaio della finestra, appena sotto il vetrino coprioggetto, stabilizzando il tessuto e mantenendo il contatto con il vetro di copertura. Sebbene il PIW offra una maggiore stabilità laterale, abbiamo scoperto che questa finestra mostra ancora una deriva assiale e impedisce inoltre l'imaging di tumori solidi di grandi dimensioni a causa dello stretto spazio tra il ripiano metallico e il vetrino coprioggetto15.
Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo sviluppato il Window tabilizzato a Sper l'imagingI ntravitale del Pancreas murino (SWIP), una finestra di imaging impiantabile in grado di ottenere un imaging stabile a lungo termine sia del pancreas sano che di quello malato (Figura 1)15. Qui forniamo un protocollo completo per la procedura chirurgica utilizzata per impiantare lo SWIP. Sebbene l'obiettivo primario fosse quello di studiare i meccanismi dinamici coinvolti nelle metastasi, questo metodo può essere utilizzato anche per esplorare vari aspetti della biologia e della patologia del pancreas.

<table><tbody><tr><td>Soluzione all'1% (p/v) di detergente enzimatico attivo</td><td>Alconox Inc</td><td>NA</td><td>Detergente anionico concentrato con enzimi proteasi per la pulizia manuale e ad ultrasuoni</td></tr><tr><td>Soluzione al 5% (p/v) di idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Reagente di passivazione</td></tr><tr><td>Vetro di copertura da 5 mm</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Sciences 72296-05</td><td>Vetrini coprioggetti rotondi&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione al 7% (p/v) di acido citrico</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>251275</td><td>Reagente di passivazione</td></tr><tr><td>28G 1 mL BD Siringa da insulina</td><td>BD</td><td>329410</td><td>Siringa per iniezione cellulare</td></tr><tr><td>Baytril 100 (enrofloxacina)</td><td>Bayer (Santa Cruz Biotechnology)</td><td>sc-362890Rx</td> Lampada termica da banco <td>per antibiotici</td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr</td><td>3349K51</td><td>Lampada riscaldante</td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg/mL</td><td>Covetrus Nord America</td><td>059122</td><td>Buprenorfina Analgesia</td></tr><tr><td>Castroviejo Forbici curve</td><td>World Precision Instruments</td><td>WP2220</td><td>Forbice per il taglio dei tessuti</td></tr><tr><td>C57BL / 6J Mouse</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664&nbsp;</td><td>C57BL/6J Mouse</td></tr><tr><td>Soluzione di clorexidina</td><td>Durvet</td><td>7-45801-10258-3</td><td>Soluzione disinfettante alla clorexidina</td></tr><tr><td>Bomboletta di aria compressa</td><td>Falcon</td><td>DPSJB-12</td><td>Aria compressa per l'essiccazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Cianoacrilato - Gel Supercolla</td><td>Graffe</td><td>234790-6</td><td>Colla per pelle</td></tr><tr><td>Cianoacrilato - Supercolla liquida</td><td>Graffe</td><td>LOC1647358</td><td>Colla per vetrini coprioggetti</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>DPBS per iniezioni di ceruleina/cellule</td></tr><tr><td>Kit di cauterizzazione Gemini</td><td>Apparato Harvard</td><td>726067</td><td>Germinatore a penna per cauterizzazione</td></tr><tr><td>500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER&nbsp; 5287-120V</td><td>Sterilizzatore di Perline</td></tr><tr><td>Graefe Micro Pinza da Secatene; Seghettato; leggera curva; Larghezza della punta 0,8 mm; 4" di lunghezza</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>Pinza per micro dissezione Graefe</td></tr><tr><td>Microscopio per immagini</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Vedi Entenberg et al. 2011 [27]</td></tr><tr><td>Software di imaging</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Vedi Entenberg et al. 2011 [27]</td></tr><tr><td>Isoethesia (isoflurano)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>Anestesia isoflurano</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td>Salviette Kim</td></tr><tr><td>Nastro da laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td>Nastro da laboratorio</td></tr><tr><td>Kit di dissezione per topi</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td>Strumenti chirurgici</td></tr><tr><td>Sensore per pulsossimetro a zampa di topo</td><td>Kent Scientific Corpo</td><td>MSTAT Sensor-MSE</td><td>Pulsossimetro</td></tr><tr><td>per topi Surgisuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M04</td><td>Piattaforma riscaldata</td></tr><tr><td>Nair Hair Removal Lozione</td><td>Amazon</td><td>B001RVMR7K</td><td>Lozione depilatoria</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td>Oxygen</td></tr><tr><td>PERMA-HAND Suture di seta intrecciate nere, ETHICON Taglia 5-0</td><td>VWR</td><td>95056-872</td><td>Sutura di seta</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato 1x</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Sistema PBS</td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>Piattaforma</td><td>riscaldata PhysioSuite Controller</td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Salute degli animali</td><td>008897</td><td>Lubrificante per gli occhi</td></tr><tr><td>Puritan Tamponi di cotone non sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td>Cotton Swabs</td></tr><tr><td>Punte barriera di precisione SHARP, per P-100, 100 e micro; L</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P1125</td><td>100 &; L Punte di pipetta</td></tr><tr><td>Isotiocianato di tetrametilrodamina Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>Etichetta vascolare</td></tr><tr><td>Piastra di fissaggio della finestra</td><td>NA</td><td>NA Piastra</td><td>su misura per il posizionamento della finestra sul tavolino del microscopio. La piastra è realizzata in spessore 0,008 in acciaio inox. Per le dimensioni della piastra si veda Entenberg et al., 2018 [8].</td></tr><tr><td>Telaio della finestra</td><td>NA</td><td>NA</td><td>La finestra è composta da un telaio in acciaio con un'apertura centrale che accetta un vetrino coprioggetti da 5 mm. Una scanalatura di 1,75 mm attorno alla circonferenza della montatura offre spazio per l'adesione del muscolo peritoneale e degli strati cutanei. Vedi Entenberg et al., 2018 [8].</td></tr></tbody></table>

finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

La fisiologia e la fisiopatologia del pancreas sono complesse. Le malattie del pancreas, come la pancreatite e l'adenocarcinoma pancreatico (PDAC), hanno un'elevata morbilità e mortalità. L'imaging intravitale (IVI) è una potente tecnica che consente l'imaging ad alta risoluzione di tessuti sia in condizioni sane che malate, consentendo l'osservazione in tempo reale delle dinamiche cellulari. L'IVI del pancreas murino presenta sfide significative a causa della natura viscerale profonda e cedevole dell'organo, che lo rende altamente soggetto a danni e artefatti da movimento. 
Di seguito è descritto il processo di impianto del P increasmurino (SWIP). Lo SWIP consente l'IVI del pancreas murino in stati di salute normali, durante la trasformazione dal pancreas sano a pancreatite acuta indotta da ceruleina, e in stati maligni come i tumori pancreatici. In combinazione con cellule geneticamente marcate o con la somministrazione di coloranti fluorescenti, lo SWIP consente la misurazione delle dinamiche a singola cellula e subcellulare (compresa la migrazione a singola cellula e collettiva), nonché l'imaging seriale della stessa regione di interesse per più giorni.
La capacità di catturare la migrazione delle cellule tumorali è di particolare importanza in quanto la causa primaria di mortalità correlata al cancro nel PDAC è il carico metastatico schiacciante. Comprendere le dinamiche fisiologiche delle metastasi nel PDAC è un'esigenza critica insoddisfatta e cruciale per migliorare la prognosi del paziente. Nel complesso, lo SWIP fornisce una migliore stabilità dell'imaging ed espande l'applicazione dell'IVI nelle malattie sane del pancreas e del pancreas maligno.

La Figura 1, adattata da Du et al.15, mostra immagini fisse da un filmato IVI time-lapse del pancreas murino. È possibile osservare un certo movimento dei tessuti durante il periodo di assestamento iniziale (prima ora di imaging, Figura 1A). Tuttavia, con l'imaging continuato dopo questo periodo di assestamento (&gt;75 min), abbiamo osservato un aumento della stabilità laterale e assiale (Figura 1B). Il confr...

Presentiamo un protocollo per l'impianto chirurgico di una finestra ottica stabilizzata a permanenza per l'imaging a risoluzione subcellulare del pancreas murino, consentendo studi seriali e longitudinali del pancreas sano e malato.

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

Utilizzando l'imaging intravitale ad alta risoluzione e un metodo migliorato di stabilizzazione del pancreas, miriamo a migliorare la comprensione delle dinamiche fisiologiche dell'adenocarcinoma pancreatico, della pancreatite e del pancreas sano. Questo approccio consente di colmare le lacune nella comprensione fisiopatologica, facendo potenzialmente progredire le strategie di trattamento per queste condizioni ad alto rischio. L'imaging intravitale a risoluzione di singole cellule ha illuminato la fisiologia e i meccanismi di progressione della malattia in vari tessuti.Tuttavia, il pancreas presenta sfide uniche a causa del suo posizionamento profondo, della conformità e della suscettibilità agli artefatti da movimento, ostacolando l'accesso efficace per l'osservazione sia per condizioni benigne che maligne. La nostra tecnica SWIP migliora la stabilizzazione del pancreas murino rispetto alle precedenti finestre di imaging addominale. La montatura dal design unico presenta linee incise per l'uso della microcartografia, che consente una rilocalizzazione coerente della regione in più sessioni di imaging.Ciò facilita la misurazione della dinamica subcellulare nel corso dei giorni, fornendo preziose informazioni. Il protocollo SWIP consente l'imaging intravitale stabile, ad alta risoluzione e a singola cellula del pancreas murino in condizioni normali e malate. È particolarmente utile per l'imaging 3D e 4D prolungato, offrendo approfondimenti sulle interazioni cellulari e sui meccanismi della malattia.Preziosa per svelare la fisiologia e la patologia pancreatica, questa tecnica visualizza le singole cellule e il loro contesto in vivo.

stabilized-window-for-intravital-imaging-of-the-murine-pancreas

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Questo video mostra la procedura per impiantare una finestra di imaging pancreatico per separare il pancreas dall'intestino per l'imaging longitudinale ad alta risoluzione time-lapse della microstruttura del pancreas.

Installazione della finestra di imaging intravitale pancreatico in un modello murino: una finestra di imaging pancreatico integrata per l'imaging in vivo time-lapse della microstruttura del pancreas murino

In questo video, descriviamo l'imaging intravitale di un pancreas di topo attraverso una finestra stabilizzata per la visualizzazione a lungo termine delle dinamiche cellulari.

Imaging intravitale: un metodo per l'osservazione a livello cellulare del pancreas di topo attraverso una finestra di imaging stabilizzata

L'imaging ad alta risoluzione in vivo del pancreas è stato facilitato con la finestra di imaging intravitale pancreatico.

Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico

Viene qui presentato un approccio per l'imaging intravitale a lungo termine utilizzando finestre in silicone otticamente chiare che possono essere incollate direttamente al tessuto / organo di interesse e alla pelle. Queste finestre sono più economiche e versatili di altre attualmente utilizzate sul campo e l'inserimento chirurgico provoca un'infiammazione e un disagio limitati agli animali.

Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multifotone per eseguire l'imaging a lungo termine ad alta risoluzione di una singola cellula del polmone intatto in tempo reale utilizzando una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto.

A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

Descriviamo un metodo che utilizza irraggiamento periferico mirati per indurre comportamento a fatica, come nei topi. La dose di irradiazione non letale selezionati porta ad una riduzione di una settimana in attività di ruote in esecuzione volontaria.

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Questo protocollo descrive un metodo neoformato per la consegna di virus alla prostata murina. Utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9, sovraespressione genica o consegna di Cre ricombinasi, la tecnica permette di orthotopic alterazione dell'espressione genica e implementa nuovi modelli murini per carcinoma della prostata.

Consegna di virus di CRISPR guide alla prostata per alterazione del Gene murina

Tumori della vescica murino sono indotti con l'agente cancerogeno nitrosamina di N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) (BBN). Generazione del tumore della vescica è eterogenea; Pertanto, una valutazione accurata del carico del tumore è necessario prima di randomizzazione al trattamento sperimentale. Qui presentiamo un protocollo di MRI veloce e affidabile per valutare la fase e dimensioni del tumore.

La formazione immagine a risonanza magnetica valutazione dei tumori della vescica murino indotto da agente

Qui descriviamo un metodo per l'imaging multi-fotofilano ad alta risoluzione delle cellule tumorali cerebrali prima e dopo l'intervento chirurgico invasivo (ad esempio, biopsia) all'interno dello stesso animale vivente. Questo metodo consente di studiare l'impatto di queste procedure chirurgiche invasive sul comportamento migratorio, invasivo e proliferativo delle cellule tumorali a livello di singola cellula.

Imaging intravitale longitudinale del comportamento delle cellule tumorali cerebrali in risposta a una biopsia chirurgica invasiva

Questo protocollo delinea un metodo rapido per generare simultaneamente colture di melanociti e fibroblasti dalla pelle di topi di 0-4 giorni. Queste colture primarie possono essere mantenute e manipolate in vitro per studiare una varietà di processi fisiologicamente rilevanti, tra cui biologia cellulare della pelle, pigmentazione, guarigione delle ferite e melanoma.

Generazione rapida delle culture primarie di Murine Melanocite e Fibroblast

Scopri la tecnica SWIP per l'imaging intravitale ad alta risoluzione del pancreas murino. Questo metodo consente studi longitudinali seriali delle condizioni pancreatiche sane e patologiche, migliorando la comprensione dell'adenocarcinoma e della pancreatite.

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

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