Name: Fabbricazione e incapsulamento di sferoidi tumorali in idrogel di polietilenglicole per lo studio delle interazioni sferoide-matrice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Scopri la fabbricazione rapida e a basso costo di sferoidi tumorali e il loro incapsulamento in idrogel di polietilenglicole per studiare le interazioni sferoide-matrice in modelli in vitro.

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Questo lavoro è stato finanziato da fondi iniziali forniti alla Dott.ssa Silviya P Zustiak dalla Saint Louis University e da una sovvenzione iniziale del Centro Henry e Amelia Nasrallah per le Neuroscienze dell'Università di Saint Louis assegnata alla Dott.ssa Silviya P Zustiak.

Fabbricazione seguita da incapsulamento 3D di sferoidi tumorali in idrogel PEG

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<li>Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+synthetic+biomaterials+for+engineering+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids.</a> Polymers. 12 (11), 2506(2020).</li>
<li>Wang, C., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+3D+brain+tumor+model+to+elucidate+the+effects+of+matrix+stiffness+on+glioblastoma+cell+behavior+using+PEG-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).</li>
<li>Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biomimetic+hyaluronic+acid+hydrogels+to+investigate+glioblastoma+stem+cell+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+scaffolds+for+3D+culture+demonstrate+extracellular+matrix-mediated+mechanisms+of+chemotherapy+resistance+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma.</a> Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).</li>
<li>Pedron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid-functionalized+gelatin+hydrogels+reveal+extracellular+matrix+signals+temper+the+efficacy+of+erlotinib+against+patient-derived+glioblastoma+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens.</a> Biomaterials. 219, 119371(2019).</li>
<li>Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+matrix+presence+and+composition+influence+drug+responses+of+encapsulated+glioblastoma+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).</li>
<li>Chen, J. -W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+microglia+and+patient-derived+glioblastoma+cells+inhibit+invasion+in+a+three-dimensional+gelatin+hydrogel+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346(2020).</li>
<li>Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials-based+approaches+to+tumor+spheroid+and+organoid+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980(2018).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-marine+collagen-agarose+composite+hydrogels+as+matrices+for+biomimetic+3D+cell+spheroid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation.</a> RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).</li>
<li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li>
<li>Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Templated+macroporous+polyethylene+glycol+hydrogels+for+spheroid+and+aggregate+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).</li>
<li>Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+size-controlled+glioma+spheroids+using+agarose+hydrogel+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells.</a> PLoS One. 14 (1), e0211078(2019).</li>
<li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+numbers+of+size-controlled+tumor+spheroids+using+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665(2013).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTimmins%2C+NE+%22Generation+of+Multicellular+Tumor+Spheroids+by+the+Hanging-Drop+Method%22">Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method</a>. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+printed+hanging+drop+dripper+for+tumor+spheroids+analysis+without+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19717(2019).</li>
<li>Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605(2017).</li>
<li>Gencoglu, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+multicellular+tumor+spheroid+formation+methods+and+implications+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).</li>
<li>Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+brain+tissue+based+on+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of brain tissue based on microstructure.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924(2021).</li>
<li>Alifieris, C., Trafalis, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+Pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment.</a> Pharmacology & Therapeutics. 152, 63-82 (2015).</li>
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<li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-hydrogel+interactions+in+tissue+engineering%3A+Mechanisms+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).</li>
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<li>Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+engineered+PEG+hydrogels%3A+a+novel+model+system+for+proteolytically+mediated+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).</li>
<li>Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+spheroid+growth+and+chemotherapeutic+responses+in+single+and+dual-stiffness+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels.</a> Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shooting+for+the+moon%3A+using+tissue-mimetic+hydrogels+to+gain+new+insight+on+cancer+biology+and+screen+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Communications%22%5BJournal%5D)">Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics.</a> MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).</li>
<li>Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+polyethylene+glycol-based+hydrogel+microspheres+through+electrospraying%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Materials+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).</li>
<li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).</li>
<li>Lee, K. -H., Kim, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+multicellular+tumor+spheroid+generation+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening.</a> Biosensors. 11 (11), 445(2021).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I modelli di sferoidi tumorali multicellulari basati su idrogel sono sempre più sviluppati per far progredire le scoperte terapeutiche del cancro 11,13,29. Sono utili perché emulano i parametri chiave del microambiente tumorale in modo controllato e, nonostante la loro complessità, sono più semplici ed economici da usare rispetto ai modelli in vivo e molti sono compatibili con le tecnologie di screening ad alto rendimento. I bio...

Gli sferoidi tumorali sono emersi come utili strumenti in vitro nello studio dell'eziologia, della patologia e della risposta ai farmacidel cancro 1. Tradizionalmente, gli sferoidi sono stati coltivati in condizioni come piastre a bassa adesione o bioreattori, in cui l'adesione cellula-cellula è favorita rispetto all'adesione cellula-superficie2. Tuttavia, è ormai riconosciuto che per ricapitolare più fedelmente il microambiente tumorale, i modelli di sferoidi in vitro dovrebbero catturare sia le interazioni cellula-cellula che cellula-matrice. Ciò ha spinto diversi gruppi a progettare scaffold, come gli idrogel, in cui gli sferoidi possono essere incapsulati 3,4. Tali modelli di sferoidi basati su idrogel consentono di chiarire le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice su vari comportamenti cellulari, come la vitalità, la proliferazione, la staminalità o la risposta alla terapia3.
Qui descriviamo un protocollo per l'incapsulamento di sferoidi di glioblastoma in idrogel di polietilenglicole (PEG). Ci sono diversi rapporti in letteratura sull'incapsulamento di sferoidi delle cellule di glioblastoma in idrogel. Ad esempio, gli sferoidi sono stati formati incapsulando cellule U87 in idrogel PEG decorati con un ligando adesivo RGDS e reticolati con un peptide enzimaticamente scissibile per determinare l'effetto della rigidità dell'idrogel sul comportamento cellulare5. Le cellule U87 sono state formate anche in altri idrogel a base di PEG o acido ialuronico per espandere la popolazione di cellule staminali tumorali6 o per esplorare i meccanismi mediati dalla matrice di resistenza alla chemioterapia 7,8,9. Gli sferoidi del glioblastoma sono stati anche incapsulati in idrogel di gelatina per studiare il crosstalk tra microglia e cellule tumorali e il suo effetto sull'invasione cellulare10. Nel complesso, tali studi hanno dimostrato l'utilità dei modelli in vitro a base di idrogel nella comprensione della patologia del glioblastoma e nell'ideazione di trattamenti.
Inoltre, esistono diversi metodi per la fabbricazione di sferoidi tumorali e l'incapsulamento dell'idrogel11. Ad esempio, le cellule disperse potrebbero essere seminate in idrogel e lasciate formare sferoidi nel tempo 5,12. Uno svantaggio di tale metodo è la polidispersione degli sferoidi formati, che potrebbe portare a risposte cellulari differenziali. Per produrre sferoidi uniformi, le cellule potrebbero essere incapsulate in microgel e coltivate per lunghi periodi fino a quando non invadono e rimodellano il gel13, oppure le cellule potrebbero essere depositate in gel modellati con "fori" sferici e lasciate aggregare14. Lo svantaggio di questi metodi è la loro relativa complessità, la necessità di un generatore di goccioline o di altri mezzi per formare microgel o i "buchi" nel gel e il tempo necessario agli sferoidi per crescere e maturare. In alternativa, gli sferoidi possono essere preformati in micropozzetti 9,15,16 o in piastre a goccia sospesa 17,18 e quindi incapsulati in un idrogel, in modo simile alla tecnica qui descritta. Questi metodi sono più semplici e possono essere eseguiti con una velocità effettiva più elevata. È interessante notare che è stato dimostrato che il metodo di formazione degli sferoidi può influenzare i comportamenti delle cellule sferoidi, come l'espressione genica, la proliferazione cellulare o la risposta ai farmaci19,20.
Qui, ci concentriamo sul glioblastoma poiché è un tumore solido il cui ambiente nativo è la matrice cerebralemorbida e nanoporosa 21, che può essere imitata da un idrogel morbido e nanoporoso. Il glioblastoma è anche il tumore cerebrale più mortale per il quale non esiste una cura disponibile22. Tuttavia, il protocollo qui descritto può essere utilizzato per l'incapsulamento di sferoidi che rappresentano qualsiasi tumore solido. Abbiamo scelto di utilizzare idrogel PEG che si formano attraverso una reazione di addizione di tipo Michael23. Il PEG è un idrogel sintetico, non degradabile e biocompatibile, inerte e che funge da impalcatura e supporto fisico delle cellule, ma non supporta l'attaccamento cellulare23. L'adesività cellulare può essere aggiunta separatamente tramite il legame di proteine intere o ligandi adesivi24 e la degradabilità può essere aggiunta tramite modifiche chimiche della catena polimerica PEG o reticolanti idroliticamente o enzimaticamente degradabili25,26. Ciò consente di regolare le proprietà biochimiche indipendentemente dalle proprietà meccaniche o fisiche dell'idrogel, il che potrebbe essere vantaggioso nello studio delle interazioni cellula-matrice. La chimica di gelificazione di tipo Michael è selettiva e avviene in condizioni fisiologiche; Quindi, consente l'incapsulamento degli sferoidi semplicemente mescolando gli sferoidi con la soluzione precursore dell'idrogel.
Nel complesso, la metodologia qui presentata presenta diverse caratteristiche degne di nota. Innanzitutto, la fabbricazione di sferoidi tumorali in un gruppo multipozzetto è efficiente, rapida e il costo dei materiali richiesti è basso. In secondo luogo, gli sferoidi sono prodotti in grandi lotti in una varietà di dimensioni con bassa polidispersione. Infine, sono richiesti solo materiali disponibili in commercio. L'utilità della metodologia è illustrata esplorando l'effetto delle proprietà del substrato sulla vitalità, la circolarità e la staminalità delle cellule sferoidi.

<table><tbody><tr><td>70% Etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>LC22210-4</td><td></td></tr> Piastre <tr><td>coniche da 15 mL</td><td>Piastre a</td><td>24</td> pozzetti FALCON 352097 <td></td></tr><tr><td>Piastre di fissaggio ultra basse</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 35 mm</td><td>Amazon</td><td>706011</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico)-acrilato a 4 bracci (PEG-Ac a 4 bracci; 10 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-10K-5g</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Coniche</td><td>Fisher Scinetific</td><td></td><td></td>3181345107</tr><tr><td>AggreWell 400 a 6 pozzetti</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Canada</td><td>34421</td><td>Micropozzetti piramidali quadrati&nbsp;</td></tr><tr><td>soluzione di risciacquo antiaderente</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Canada</td><td>Cat #: 07010</td><td></td></tr><tr><td>Acido aspartico-Arginina-Cisteina-Glicina-Valina-Prolina-Metionina-Serina-Metionina-Arginina-Glicina-Cisteina-Arginina- Acido aspartico (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide</td><td>Genic Bio, Shanghai, Cina</td><td>n/a</td><td>Sintesi personalizzata</td></tr><tr><td>Cappa chimica</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale Corning Matrigel, senza LDEV</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Detergente per matrice a membrana basale</td></tr><tr><td>- Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>Tensioattivo non ionico</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipette monouso (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td><td>Fisher Scinetific</td><td>1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide al 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Lastre di vetro</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento in vetro</td><td>Fisher Scinetific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>Glicona-Arginina-Cisteina-Acido aspartico-Arginina-Glicina-Acido aspartico-Serina (GRCD-RGDS) peptide</td><td>Genic Bio, Shanghai, Cina</td><td>n/a</td><td>Sintesi personalizzata</td></tr><tr><td></td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione idrofobica - Repel Silane&nbsp;</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Incubatore</td><td>NUAIRE NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td></td> 663526 <td></td></tr><tr><td>Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dioxadecyloxacarbocianina Perclorato)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D1125</td><td></td></tr><tr><td>Leica Confocal SP8</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico e fluorescente (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Micro provette per centrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 mL: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>Software</td> per <td>microscopio Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Nestin Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7,4</td><td>HyClone</td><td>SH30256,01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (1&ndash; 200 &micro; L, 101&ndash; 1000 &micro; L)</td><td>Fisher Scinetific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento monouso standard in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Barche di pesatura in plastica (100 mL)</td><td>Amazon&nbsp;</td><td>mdo-azoc-1030</td><td></td></tr><tr><td>poli(glicole etilenico)-ditiolo (PEG-diSH; 3,4 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>SH-PEG-SH-3400-5g</td><td></td></tr><tr><td>Polidimehylsiloxane (PDMS) [Kit elastomero Slygard 182]</td><td>Adesivi Elsworth</td><td>3097358-1004</td> Guanti da esplorazione senza polvere di <td>polidimetilsilossano</td></tr><tr><td></td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio, 1 mg/mL di soln.</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AAJ66584AB</tr><tr><td>RPMI-1640 Medium (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Distanziatori in silicone - Foglio in silicone, 0,5 mm di spessore/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0,5</td><td></td></tr><tr><td>SOX2 Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365823</td><td></td></tr><tr><td>Cappa per coltura tissutale</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolammina, &ge; 99,0% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG cellule di glioblastoma umano</td><td>Collezione di colture di tipo americano&nbsp;</td><td>HTB-14</td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione e incapsulamento di sferoidi tumorali in idrogel di polietilenglicole per lo studio delle interazioni sferoide-matrice

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

L'incapsulamento tridimensionale (3D) degli sferoidi è fondamentale per replicare adeguatamente il microambiente tumorale per una crescita cellulare ottimale. Qui, abbiamo progettato un modello di glioblastoma 3D in vitro per l'incapsulamento sferoidale per imitare il microambiente extracellulare del tumore. Innanzitutto, abbiamo formato stampi per micropozzetti piramidali quadrati utilizzando il polidimetilsilossano. Questi stampi per micropozzetti sono stati poi utilizzati per fabbricare sferoidi tumorali con dimensioni strettamente controllate da 50 a 500 μm. Una volta formati, gli sferoidi sono stati raccolti e incapsulati in idrogel a base di polietilenglicole (PEG). Gli idrogel PEG sono una piattaforma versatile per l'incapsulamento degli sferoidi, poiché le proprietà dell'idrogel come la rigidità, la degradabilità e l'adesività cellulare possono essere regolate in modo indipendente. In questo caso, abbiamo utilizzato un idrogel morbido rappresentativo (~8 kPa) per incapsulare gli sferoidi del glioblastoma. Infine, è stato sviluppato un metodo per colorare e visualizzare gli sferoidi per ottenere immagini di alta qualità tramite microscopia confocale. A causa del denso nucleo sferoidale e della periferia relativamente scarsa, l'imaging può essere difficile, ma l'uso di una soluzione di purificazione e di un sezionamento ottico confocale aiuta ad alleviare queste difficoltà di imaging. In sintesi, mostriamo un metodo per fabbricare sferoidi uniformi, incapsularli in idrogel PEG ed eseguire la microscopia confocale sugli sferoidi incapsulati per studiare la crescita degli sferoidi e le varie interazioni cellula-matrice.

Le piattaforme di screening farmacologico basate su sferoidi per studiare gli effetti chemioterapici sono sempre più ricercate a causa dell'enfasi sulla modulazione del microambiente tumorale sull'incapsulamento dello sferoide in biomateriali che replicano il tessuto nativo. Qui abbiamo sviluppato un metodo per la preparazione di sferoidi tumorali multicellulari e il successivo incapsulamento e imaging in un idrogel 3D. Gli sferoidi vengono preparati in stampi a micropozzetti (Figura 3A,B), ...

Qui, presentiamo un protocollo che consente la fabbricazione rapida, robusta ed economica di sferoidi tumorali seguita dall'incapsulamento dell'idrogel. È ampiamente applicabile in quanto non richiede attrezzature specializzate. Sarebbe particolarmente utile per esplorare le interazioni sferoide-matrice e costruire modelli di fisiologia o patologia tissutale in vitro .

Fabbricazione e incapsulamento di sferoidi tumorali in idrogel di polietilenglicole per lo studio delle interazioni sferoide-matrice

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth.  Here, we ...

Il nostro laboratorio si concentra sulla progettazione di modelli di idrogel in vitro per l'incapsulamento steroideo del glioblastoma per imitare il microambiente extracellulare del tumore. Con tali modelli vengono studiati il substrato efficace, le proprietà meccaniche e biochimiche sulla vitalità, la circolarità, la staminalità e la diffusione delle cellule steroidee. Le attuali sfide sperimentali nello sviluppo di moduli tumorali ruotano attorno al desiderio di complessità per imitare tutti gli aspetti del microambiente tumorale per rilevanza fisiologica, e anche al desiderio di semplicità per rendere il modello accessibile, robusto, a basso costo e facile da usare e compatibile con gli approcci di screening multiplex.Presentiamo un protocollo che consente la fabbricazione rapida, robusta e a basso costo di steroidi tumorali e l'incapsulamento in idrogel realizzati per imitare il microambiente tumorale. Il modello non richiede alcuna attrezzatura specializzata. Sarà particolarmente utile per esplorare le interazioni della matrice steroidea nella costruzione di modelli di fisiologia o patologia tissutale in vitro.Comprendere le interazioni tra le cellule tumorali del glioblastoma e il loro microambiente può incoraggiare lo sviluppo di nuove terapie per trattare meglio questo cancro. Inoltre, lo sviluppo di un modello in vitro per il cancro del glioblastoma può migliorare lo sviluppo di questo modello per altre malattie tumorali.

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Fonte: Guyon, J., et al. Un modello sferoidale 3D per il glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)Il video dimostra la generazione di un modello sferoidale tridimensionale dell'invasione delle cellule tumorali. Gli sferoidi sono formati da cellule tumorali cerebrali umane e incorporati in una matrice di collagene. Le cellule tumorali alla periferia sferoidale adottano un fenotipo invasivo, secernendo proteasi per degradare il collagene e avanzando per invadere la matrice circostante.

Generazione di un modello sferoidale tridimensionale dell'invasione delle cellule tumorali

Microrheology-particella di monitoraggio può essere utilizzato per non distruttivo quantificare e spazialmente mappare i cambiamenti nella matrice extracellulare proprietà meccaniche in modelli tumorali 3D.

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

Qui, descriviamo un protocollo rapido e flessibile per la formazione di sferoidi cellulari 3D attraverso l'aggregazione cellulare. Questo è facilmente adattabile a più tipi di cellule ed è adatto per l'uso in una varietà di applicazioni, tra cui la migrazione cellulare, l'invasione o i saggi anoikis e per l'imaging e la quantificazione delle interazioni cellula-matrice.

Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

Abbiamo sviluppato un modello di cancro al seno eterogeneo costituito da cellule del tumore e del fibroblasto immortalate incorporate in un bioink di alginato/gelatina bioprintable. Il modello ricapitola il microambiente tumorale in vivo e facilita la formazione di sferoidi multicellulari tumore, producendo la comprensione dei meccanismi di tumorigenesi di guida.

Bioprintable alginato/gelatina idrogel 3D In Vitro sistemi modello inducono la formazione di sferoide di cella

Il microambiente tumorale è una parte essenziale della crescita e dell'invasione del cancro. Per simulare la progressione del carcinoma, è necessaria una matrice umana biologicamente rilevante. Questo protocollo introduce un miglioramento per il saggio di invasione sferoidale tridimensionale in vitro applicando una matrice a base di leiomioma umano. Il protocollo introduce anche un'analisi di invasione cellulare basata su computer.

Matrice a base di tumore umano in un saggio di invasione sferoide tridimensionale

Qui, descriviamo un assaggio di invasione facile da usare per il glioblastoma. Questo test è adatto per cellule staminali del glioblastoma. Viene descritta anche una macro Fiji per una facile quantificazione dell'invasione, della migrazione e della proliferazione.

Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Mancano modelli completi in vitro che ricapitolino fedelmente la malattia umana pertinente. Il presente studio presenta la creazione e la coltura tridimensionale (3D) di sferoidi tumorali, uno strumento affidabile in vitro per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare umano.

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

Il presente studio descrive le metodologie per la coltivazione, il congelamento, lo scongelamento, la lavorazione, la colorazione, l'etichettatura e l'esame di interi sferoidi e organoidi sotto vari microscopi, mentre rimangono intatti in un idrogel all'interno di un dispositivo multiuso.

Coltivazione, congelamento, lavorazione e imaging di interi organoidi e sferoidi mentre sono ancora in un idrogel

Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la costruzione di sferoidi tumorali tridimensionali. Viene inoltre descritta una strategia per l'osservazione degli sferoidi e l'analisi di apprendimento profondo basata su immagini utilizzando un sistema di imaging automatizzato.

Generazione di sferoidi tumorali 3D per studi di valutazione dei farmaci

Scopri la fabbricazione rapida e a basso costo di sferoidi tumorali e il loro incapsulamento in idrogel di polietilenglicole per studiare le interazioni sferoide-matrice in modelli in vitro.

Fabbricazione e incapsulamento di sferoidi tumorali in idrogel di polietilenglicole per lo studio delle interazioni sferoide-matrice (Video) | JoVE Journal

Fabbricazione e incapsulamento di sferoidi tumorali in idrogel di polietilenglicole per lo studio delle interazioni sferoide-matrice

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