Screening della modificazione degli istoni mediante cromatografia liquida, spettrometria di mobilità ionica intrappolata e spettrometria di massa a tempo di volo
12 gennaio 2024
Un flusso di lavoro analitico basato sulla cromatografia liquida, sulla spettrometria di mobilità ionica intrappolata e sulla spettrometria di massa a tempo di volo (LC-TIMS-TOF MS/MS) per un'analisi "bottom-up" ad alta affidabilità e altamente riproducibile delle modificazioni istoniche e l'identificazione in base ai parametri principali (tempo di ritenzione [RT], sezione d'urto di collisione [CCS] e rapporto massa-carica [m/z] accurato).
Viene proposto un metodo che utilizza un protocollo di estrazione degli istoni con un'efficienza del 95%. Insieme a LC-TIMS-ToF MS/MS, in breve tempo, è possibile ottenere uno screening per quei PTM presenti nell'istone. E soprattutto, la possibilità di separare gli isomeri.
La separazione dei peptidi isomerici, sebbene possibile utilizzando la sola spettrometria di massa tandem, è spesso difficile. Incorporando TIMS, introduciamo un'ulteriore dimensione di separazione, semplificando molte identificazioni di isomeri posizionali. Inoltre, la tecnologia passiva aumenta la sensibilità di questi esperimenti, migliorando ulteriormente la nostra capacità di analizzare le variazioni epigenetiche.
Con l'aumento della capacità di identificare le posizioni PTM, arriva la capacità di determinare ulteriormente la correlazione tra vari fattori ambientali o biologici e i loro effetti sull'epigenoma. I metodi che migliorano e facilitano l'analisi degli istoni possono essere applicati a diverse aree di ricerca, tra cui la chimica medica e ambientale. La dinamica della conferma delle proteine in stati nativi o danneggiati sarà stabilita dall'implementazione di TIMS MS/MS con HDX.
Attraverso LC-TIMS-ToF MS/MS e Nano LC-TIMS-ToF MS/MS, verranno tracciate le differenze di PTM esistenti in vari campioni biologici.
Panoramica
Questo studio presenta un flusso di lavoro analitico che utilizza la cromatografia liquida, la spettrometria di mobilità ionica intrappolata e la spettrometria di massa con analizzatore a tempo di volo (LC-TIMS-ToF MS/MS) per l'analisi ad alta affidabilità delle modifiche istoniche. Il metodo migliora in modo significativo l'identificazione delle modifiche post-traduzionali (PTMs) e dei loro isomeri posizionali.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Epigenetica
Sfondo
- Gli istoni svolgono un ruolo cruciale nella regolazione genica attraverso varie modificazioni.
- L'identificazione di queste modificazioni è essenziale per comprendere i meccanismi epigenetici.
- I metodi tradizionali incontrano difficoltà nella separazione degli isomeri.
- L'integrazione della TIMS offre una nuova dimensione per un miglioramento della separazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per l'estrazione e l'analisi efficiente delle istoni.
- Migliorare l'identificazione delle PTM e dei loro isomeri.
- Correlare i fattori ambientali alle variazioni epigenetiche.
Metodi Utilizzati
- Protocollo di estrazione delle istone con un'efficienza del 95%.
- LC-TIMS-ToF MS/MS per l'analisi ad alta risoluzione.
- Tecnologia passiva per aumentare la sensibilità negli esperimenti.
- Screening delle PTM presenti nelle istone.
Risultati principali
- Separazione riuscita di peptidi isomeri mediante TIMS.
- Miglioramento nell'identificazione delle posizioni delle PTM.
- Maggiore capacità di analizzare le variazioni epigenetiche.
- Possibili correlazioni tra fattori biologici e l'epigenoma.
Conclusioni
- Il metodo proposto migliora in modo significativo l'analisi delle modifiche istoniche.
- L'integrazione di TIMS semplifica l'identificazione degli isomeri.
- Questo approccio apre nuove strade per ulteriori ricerche sugli effetti epigenetici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il screening ad alto rendimento delle modifiche post-traduzionali degli istoni (PTM) mediante LC-TIMS-ToF MS/MS risponde a un'esigenza fondamentale di mappatura epigenetica precisa nelle fasi iniziali della scoperta e della validazione dei bersagli. La capacità di assegnare con sicurezza le posizioni delle PTM e di distinguere le forme isomeriche migliora la fiducia predittiva nel collegare gli stati epigenetici alle risposte biologiche. Questo flusso di lavoro supporta decisioni ponderate sui portafogli consentendo un'analisi robusta e quantitativa delle modifiche della cromatina rilevanti per i meccanismi delle malattie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei meccanismi regolatori epigenetici attraverso la mappatura ad alta affidabilità delle PTM.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio distinguendo gli isomeri posizionali delle modifiche istoniche.
- Facilita la riduzione del rischio biologico correlando i profili delle PTM con fattori ambientali o genetici.
- Migliora l'affidabilità predittiva per la selezione di bersagli epigenetici nel percorso di scoperta.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara campioni biologici validati per lo screening successivo di composti modificatori della cromatina.
- Fornisce profili quantitativi riproducibili di PTM per la standardizzazione e il confronto degli saggi.
- Consente analisi scalabili ad alto rendimento adatte a campagne di screening.
- Permette una valutazione affidabile degli effetti dei composti sui paesaggi di modificazione istonica.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea il rilevamento delle PTM a biomarcatori epigenetici rilevanti per la malattia, quando supportato dal contesto del campione.
- Garantisce continuità dalla mappatura epigenetica nella fase di scoperta alla validazione nei modelli preclinici.
- Permette un avanzamento basato sul rischio quantificando le variazioni delle PTM in risposta a perturbazioni biologiche.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella ricerca traslazionale attraverso un profilo dettagliato delle modifiche.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo LC-TIMS-ToF MS/MS integra le fasi iniziali della scoperta fino all'identificazione dei composti promettenti, supportando flussi di lavoro basati su ipotesi e su screening nella ricerca epigenetica.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici mappando i modelli di PTM agli esiti biologici.
- Screening: Fornisce dati quantitativi su PTM pronti per saggi, utili per la valutazione dei composti e la valutazione della riproducibilità.
- Analisi: Offre misurazioni ad alta risoluzione delle posizioni dei PTM, della separazione degli isomeri e degli spettri di frammentazione per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Permette l'allineamento dei profili di PTM con modelli di malattia e strategie di biomarcatori quando pertinente.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma analitica riutilizzabile per studi epigenetici continui in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi epigenetici.
- Valore operativo: Standardizza l'analisi delle PTM con elevata riproducibilità e produttività.
- Valore strategico: Supporta decisioni informate di prosecuzione/cessazione e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione degli obiettivi e programmi epigenetici corretta per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in spettrometria di massa, cromatografia e analisi dei dati proteomici.
- Richiede l'accesso a strumentazione avanzata LC-TIMS-ToF MS/MS e a software di supporto.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione dei campioni e di interpretazione dei dati.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse matrici biologiche o fonti di istoni.
- La calibrazione dello strumento e l'ottimizzazione del metodo sono fondamentali per riproducibilità e sensibilità.
