Name: Gascromatografia-Metabolomica mirata basata sulla spettrometria di massa di campioni di corallo duro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Scopri l'estrazione metabolica da olobionti di corallo mediante gascromatografia-spettrometria di massa. Questo metodo consente di analizzare separatamente i tessuti dell'ospite e le cellule di Symbiodiniaceae per studiare le interazioni metaboliche.

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J.L.M. è stato sostenuto da una borsa di studio di ricerca del Cancelliere dell'UTS.

Profilazione dei metaboliti di campioni di corallo duro mediante GC-MS

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

La separazione dell'ospite e del simbionte è facilmente e rapidamente ottenibile tramite una semplice centrifugazione, e i risultati qui mostrano che la separazione delle frazioni può fornire preziose informazioni indicative di specifici contributi dei membri olobionti, che possono contribuire all'analisi funzionale della salute dei coralli. Nei coralli adulti, la sintesi lipidica è eseguita principalmente dal simbionte algale residente 40, che fornisce lipidi (ad esempio, triacilglicerolo e fosfolipidi)41 e aci...

I metaboliti rappresentano i prodotti finali dei processi cellulari e la metabolomica - lo studio della serie di metaboliti prodotti da un determinato organismo o ecosistema - può fornire una misura direttadel funzionamento dell'organismo. Ciò è particolarmente importante per l'esplorazione degli ecosistemi, delle interazioni simbiotiche e degli strumenti di ripristino, poiché l'obiettivo della maggior parte delle strategie di gestione è quello di preservare (o ripristinare)specifiche funzioni dei servizi ecosistemici. Le barriere coralline sono un ecosistema acquatico che dimostra il valore potenziale della metabolomica per chiarire le interazioni simbiotiche e collegare le risposte fisiologiche dei coralli agli impatti a livello di comunità e di ecosistema3. L'applicazione della gascromatografia-spettrometria di massa ad alto rendimento (GC-MS) è particolarmente apprezzata per la sua capacità di analizzare rapidamente un'ampia gamma di classi di metaboliti contemporaneamente con elevata selettività e sensibilità, fornire una rapida identificazione dei composti quando sono disponibili librerie spettrali e fornire un elevato livello di riproducibilità e accuratezza, con un costo per campione relativamente basso.
I coralli sono olobionti costituiti dall'animale corallo, dagli endosimbionti dinoflagellati fotosintetici (famiglia: Symbiodiniaceae4) e da un microbioma complesso 5,6. Nel complesso, la fitness dell'olobionte viene mantenuta principalmente attraverso lo scambio di piccole molecole ed elementi per supportare il funzionamento metabolico di ciascun membro 7,8,9,10. Gli approcci metabolomici si sono dimostrati particolarmente efficaci per chiarire le basi metaboliche della specificità della simbiosi9,11, la risposta allo sbiancamento allo stress termico 7,8,12,13, le risposte alle malattie 14, le risposte all'esposizione all'inquinamento 15, la fotoacclimatazione16 e la segnalazione chimica 17 nei coralli, oltre a contribuire alla scoperta di biomarcatori 18,19. Inoltre, la metabolomica può fornire una preziosa conferma delle conclusioni dedotte dalle tecniche basate sul DNA e sull'RNA 9,20. Esiste, quindi, un notevole potenziale per l'uso della metabolomica per valutare la salute della barriera corallina e sviluppare strumenti per la conservazione della barriera corallina3, ad esempio attraverso l'individuazione di biomarcatori metabolici di stress18,19 e per esaminare il potenziale di strategie di gestione attiva come i sussidi nutrizionali21.
Separare le cellule ospite e simbionte e analizzare i loro profili metabolitici in modo indipendente, piuttosto che insieme come olobionte, può fornire maggiori informazioni sulle interazioni del partner, sugli stati fisiologici e metabolici indipendenti e sui potenziali meccanismi molecolari per l'adattamento 11,12,22,23,24. Senza separare il corallo dalle Symbiodiniaceae, è quasi impossibile chiarire il contributo e il metabolismo dei coralli e/o delle Symbiodiniaceae in modo indipendente, tranne che con la ricostruzione complessa del genoma e la modellazione metabolica25, ma questo deve ancora essere applicato alla simbiosi corallo-dinoflagellato. Inoltre, il tentativo di estrarre informazioni sul metabolismo individuale del simbionte ospite o algale dal profilo metabolitico dell'olobionte può portare a interpretazioni errate.
Ad esempio, fino a poco tempo fa, si pensava che la presenza di acidi grassi polinsaturi C18:3n-6, C18:4n-3 e C16 negli estratti di tessuti di corallo e olobionte derivasse dal simbionte algale, poiché si presumeva che i coralli non possedessero le desaturasi ωx essenziali per la produzione di acidi grassi omega-3 (ω3); tuttavia, recenti evidenze genomiche suggeriscono che più cnidari hanno la capacità di produrre ω3 PUFA de novo e di biosintetizzare ulteriormente ω3 PUFA26 a catena lunga. La combinazione di GC-MS con marcatura isotopica stabile (ad esempio, 13 C-bicarbonato, NaH13CO 3 ) può essere utilizzata per tracciare il destino del carbonio fissato fotosinteticamente attraverso le reti metaboliche degli olobionti corallini sia in condizioni di controllo che in risposta a fattori di stress esterni27,28. Tuttavia, un passo critico nel monitoraggio del destino del 13 C è la separazione del tessuto del corallo dalle cellule algali: solo allora la presenza di un composto marcato con 13C nella frazione ospite del corallo può essere inequivocabilmente assegnata come un metabolita derivato dalle Symbiodiniaceae traslocato nel corallo o un prodotto a valle di un composto marcato traslocato. Questa tecnica ha dimostrato la sua potenza sfidando l'ipotesi di lunga data che il glicerolo sia la forma primaria in cui il fotosintato, traslocato dal simbionte all'ospite29, oltre a chiarire come cambia il flusso nutrizionale tra i partner durante lo sbiancamento27,28 e in risposta a specie di Symbiodiniaceae incompatibili11.
Sebbene la decisione di separare i tessuti sia guidata principalmente dalla domanda di ricerca, la praticità, l'affidabilità e i potenziali impatti metabolici di questo approccio sono importanti da considerare. Qui, forniamo metodi dettagliati e dimostrati per l'estrazione dei metaboliti dall'olobionte, nonché dalle frazioni separate dell'ospite e del simbionte. Confrontiamo i profili dei metaboliti dell'ospite e del simbionte in modo indipendente e come questi profili si confrontano con il profilo del metabolita dell'olobionte.

<table><tbody><tr><td>Metanolo di grado LC al 100%</td><td>Merck</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>provette per microcentrifuga essenziali da 2 mL</td> di grado LC, PP <td>Eppendorf</td><td>30121880</td><td>Il polipropilene offre un'elevata resistenza agli agenti chimici, alle sollecitazioni meccaniche e alle temperature estreme</td></tr><tr><td>2030 Cromatografo gassoso Shimadzu</td><td></td><td>GC-2030</td><td></td></tr><tr><td>710-1180 &; m perle di vetro lavate con acido</td><td>Merck</td><td> G1152</td><td>Questa dimensione è ottimale per rompere le cellule delle Symbiodiniaceae</td></tr><tr><td>AOC-6000 Plus Autocampionatore multifunzione</td><td>Shimadzu</td><td>AOC6000</td><td></td></tr><tr><td>reagente Bradford</td><td>Merck</td><td>B6916</td><td>Qualsiasi reagente colorimetrico proteico è accettabile</td></tr><tr><td>Pistola ad aria compressa</td><td>Ozito</td><td>6270636</td><td>Design simile accettabile. Avere un raccordo per adattarsi a un puntale da 1 ml è fondamentale.</td></tr><tr><td>&nbsp; Colonna DB-5 con colonna di diametro interno di 0,25 mm e 1 &micro; m spessore del film</td><td>Agilent</td><td>122-5013</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Merck</td><td>RTC000098</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitolo-6-13C e/o 13C5&ndash; 15N Valine</td><td>Merck</td><td>605514/ 600148</td><td>Al metanolo è possibile aggiungere uno o entrambi gli standard interni.</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti a fondo piatto</td><td>Merck</td><td>CLS3614</td><td></td></tr><tr><td>Fiale a scintillazione in vetro</td><td>Merck</td><td>V7130</td><td>20 mL, con sigillo non plastico</td></tr><tr><td>Immunoglogin G</td><td>Merck</td><td>56834</td><td>se non disponibile, l'albumina sierica bovina è accettabile</td></tr><tr><td>Primer</td><td></td><td>v4</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td>v4.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Software Shimadzu LabSolutions Insight</td><td></td><td>v3.6</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td>Pellet per fare 1 soluzione M</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td></td><td>v1.3.1</td><td>Pacchetto R</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td>O simile</td></tr><tr><td>TQ8050NX spettrometro di massa a triplo quadrupolo</td><td>Shimadzu</td><td>GCMS-TQ8050 NX</td><td></td></tr><tr><td>UV-96 piastra a pozzetti</td><td>Greiner</td><td>M3812</td><td></td></tr><tr><td>Sacchetto per campioni Whirl-Pak</td><td>Merck</td><td>WPB01018WA</td><td>Sacchetto per la raccolta dei campioni; Dimensioni: abbastanza grande da ospitare un frammento di corallo di ~5 cm, ma non troppo grande da far sì che l'acqua sia troppo diffusa</td></tr></tbody></table>

gascromatografia-metabolomica mirata basata sulla spettrometria di massa di campioni di corallo duro

Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples

Gli approcci basati sulla gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) si sono dimostrati potenti per chiarire le basi metaboliche della simbiosi cnidario-dinoflagellata e il modo in cui il corallo risponde allo stress (ad esempio, durante lo sbiancamento indotto dalla temperatura). Il profilo dei metaboliti allo stato stazionario dell'olobionte del corallo, che comprende l'ospite cnidariano e i suoi microbi associati (Symbiodiniaceae e altri protisti, batteri, archaea, funghi e virus), è stato applicato con successo in condizioni ambientali e di stress per caratterizzare lo stato metabolico olistico del corallo.
Tuttavia, per rispondere alle domande che circondano le interazioni simbiotiche, è necessario analizzare i profili dei metaboliti dell'ospite corallo e dei suoi simbionti algali in modo indipendente, il che può essere ottenuto solo mediante separazione fisica e isolamento dei tessuti, seguita da estrazione e analisi indipendenti. Mentre l'applicazione della metabolomica è relativamente nuova nel campo dei coralli, gli sforzi sostenuti dei gruppi di ricerca hanno portato allo sviluppo di metodi robusti per l'analisi dei metaboliti nei coralli, compresa la separazione del tessuto ospite del corallo e dei simbionti algali.
Questo documento presenta una guida passo-passo per la separazione degli olobionti e l'estrazione dei metaboliti per l'analisi GC-MS, comprese le principali fasi di ottimizzazione da prendere in considerazione. Dimostriamo come, una volta analizzato in modo indipendente, il profilo metabolitico combinato delle due frazioni (corallo e Symbiodiniaceae) sia simile al profilo dell'insieme (olobionte), ma separando i tessuti, possiamo anche ottenere informazioni chiave sul metabolismo e sulle interazioni tra i due partner che non possono essere ottenute dal solo tutto.

Tutti i dati prodotti nel corso di questo lavoro sono disponibili nelle informazioni supplementari.
Separazione ospite-simbionte
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65628/65628fig01.jpg"> Figura 1: Messa a punto e validazione della separazione dei tessuti ospiti del corallo e delle cellule di Symbiodiniaceae. (A) La co...

Qui, presentiamo l'estrazione e la preparazione di metaboliti polari e semi-polari da un olobionte di corallo, nonché tessuto ospite di corallo separato e frazioni cellulari di Symbiodiniaceae, per l'analisi gascromatografica-spettrometria di massa.

Gascromatografia-Metabolomica mirata basata sulla spettrometria di massa di campioni di corallo duro

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based approaches have proven to be powerful for elucidating the metabolic basis of the ...

Come ogni organismo, i coralli dipendono da un'alimentazione superlativa per crescere e costruire barriere coralline per l'immunità e la riproduzione e per resistere alle mutevoli condizioni ambientali. Ma sappiamo molto poco sull'alimentazione ottimale per i coralli in condizioni normali o mutevoli, e su come ogni membro dell'olobionte corallino contribuisca a questo stato nutrizionale. I coralli sono olobionti composti dall'ospite e da vari microrganismi simbionti.Questi includono Symbiodiniaceae, protisti, batteri, virus e funghi. La fitness dell'olobionte dipende dalle interazioni metaboliche tra questi membri. Ad esempio, le Symbiodiniaceae forniscono fotosintesi per supportare il metabolismo dell'ospite e aiutarlo ad adattarsi alle mutevoli condizioni.Per comprendere questa partnership cruciale, dobbiamo studiare separatamente la composizione chimica e metabolica di ciascun partner. Questi risultati hanno dimostrato che è possibile ottenere maggiori informazioni separando le frazioni dell'ospite e del simbionte per l'analisi metabolica. Tuttavia, la decisione di analizzare frazioni separate rispetto all'olobionte è in ultima analisi governata dalla domanda di ricerca.Quindi, nei casi in cui l'analisi dell'olobionte è preferibile, abbiamo fornito una metodologia per l'estrazione dei metaboliti dell'olobionte e suggerimenti per ottenere quante più informazioni possibili durante l'analisi. I metodi utilizzati in questo studio aprono nuove strade per la ricerca. Questi includono la rivelazione di potenziali biomarcatori, l'identificazione di metaboliti chiave durante specifiche fasi della vita o condizioni di stress, la comprensione dei vantaggi dell'associazione con determinate specie e l'esplorazione delle interazioni all'interno dell'olobionte.La ricerca futura si concentrerà sull'applicazione dei protocolli qui stabiliti a diverse aree di ricerca, tra cui il rilevamento di biomarcatori con applicazioni nella conservazione e nel ripristino della barriera corallina. Questa metodologia può essere applicata anche quando la separazione delle frazioni non è possibile per altre misure fisiologiche. Ad esempio, quando si analizzano le emissioni di metaboliti volatili dalle colonie di coralli.

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Metabolomica non mirati da fonti biologiche Uso UltraPerformance cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS)

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Gascromatografia-Metabolomica mirata basata sulla spettrometria di massa di campioni di corallo duro

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