Fabbricazione di griglie monostrato rivestite di grafene per microscopia crioelettronica
8 settembre 2023
Qui, descriviamo un protocollo per l'applicazione di un singolo monostrato di grafene alle griglie di microscopia elettronica e come prepararle per l'uso nella determinazione della struttura crioEM.
Attualmente, la conservazione ottimale dei campioni biologici è una sfida importante per ottenere strutture CryoEM ad alta risoluzione. Durante il processo di preparazione del campione, i campioni sono esposti all'interfaccia idrofobica aria-acqua, che ha effetti denaturanti sui campioni e può far sì che i campioni stabili adottino un orientamento preferenziale nel ghiaccio, impedendo la determinazione della struttura ad alta risoluzione. Il rivestimento delle griglie CryoEM con un sottile strato di carbonio simile all'ossido di grafene molle è stato comunemente utilizzato per risolvere i problemi relativi alle interazioni con l'interfaccia aria-acqua.
Tuttavia, questi strati spesso aumentano il rumore di fondo nelle nostre immagini, che compromette le risoluzioni della nostra struttura. Rivestendo la griglia con un monostrato di grafene si ottiene una protezione simile senza introdurre un rumore di fondo significativo. L'utilizzo di griglie CryoEM rivestite di grafene può aiutare a superare i problemi legati alle interazioni con l'interfaccia aria-acqua, tuttavia, le griglie di grafene commerciali sono costose e molti laboratori considerano le griglie di grafene troppo complicate da preparare internamente.
I ricercatori nel campo di CryoEM possono ora utilizzare questo protocollo passo-passo per riprodurre dozzine di grafeni di alta qualità completamente prodotti in un giorno.
Panoramica
Questo studio affronta la sfida di preservare in modo ottimale i campioni biologici per la microscopia crioelettronica ad alta risoluzione (cryo-EM). Gli autori presentano un protocollo per rivestire le griglie EM con un singolo monostrato di grafene per minimizzare il rumore di fondo e migliorare l'integrità del campione durante l'imaging.
Componenti principali dello studio
Area di ricerca
- Microscopia crioelettronica
- Preservazione dei campioni in imaging biologico
- Applicazioni del grafene nella microscopia
Contesto
- La conservazione dei campioni biologici è cruciale per le strutture cryo-EM ad alta risoluzione.
- I rivestimenti di carbonio tradizionali possono aumentare il rumore di fondo nell'imaging.
- Il grafene fornisce uno strato protettivo senza compromettere la qualità dell'immagine.
Metodi utilizzati
- Applicazione di un monostrato di grafene alle griglie EM
- Tecniche di imaging cryo-EM
- Uso di spin coater fatti in casa e vari agenti detergenti
Risultati principali
- Le griglie rivestite di grafene mostrano un rumore di fondo ridotto nell'imaging.
- Il metodo permette la produzione in massa di grafene di alta qualità in un solo giorno.
- Le griglie EM dimostrano una conservazione e concentrazione efficaci dei campioni biologici.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un approccio semplice per i laboratori per produrre griglie EM rivestite di grafene.
- Questo avanzamento migliora il potenziale per un imaging cryo-EM migliorato nella ricerca biologica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High-resolution cryoEM is pivotal for structural biology and drug discovery, but sample denaturation and orientation bias at the air-water interface limit data quality and throughput. Monolayer graphene-coated grids address these bottlenecks by preserving macromolecular integrity and reducing background noise, directly impacting early discovery and target validation. Scalable in-house fabrication of graphene grids enables broader adoption, supporting portfolio-wide structural studies and accelerating mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity structural interrogation of macromolecular complexes for target validation.
- Reduces denaturation and aggregation, supporting mechanistic de-risking in early discovery.
- Improves orientation diversity, enhancing predictive confidence in structural models.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of reproducible, low-background cryoEM grids for downstream screening.
- Supports quantitative imaging by minimizing noise and concentration artifacts.
- Enables reliable evaluation of protein complexes at lower sample concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from discovery to preclinical validation by supporting robust structural data generation.
- Aligns with translational biomarker development through enhanced structural resolution.
- Reduces risk of late-stage failures due to ambiguous or compromised structural data.
Pipeline & Workflow Integration
Monolayer graphene-coated grids integrate into the cryoEM workflow from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis-driven structural studies and enabling reproducible, high-quality imaging.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by preserving native macromolecular conformations.
- Screening: Provides standardized, reproducible grids for quantitative cryoEM assays.
- Analytics: Delivers low-noise, high-resolution images for robust comparative analysis.
- Translational Research: Enhances preclinical continuity by enabling reliable structural characterization of therapeutic candidates.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, cost-effective platform for repeated structural studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology.
- Operational Value: Standardizes grid preparation, improves reproducibility, and enables batch scalability.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through higher-quality data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM grid handling and graphene manipulation.
- Needs access to spin coaters, fume hoods, and standard EM grid preparation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible grid quality and imaging results.
- Adaptation may be needed for different protein classes or sample types.
- Potential limitations include handling sensitivity and initial training for graphene transfer steps.
