Name: Analisi immunoistochimica multiplex del panorama spaziale delle cellule immunitarie del microambiente tumorale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Impara l'immunoistochimica multiplex per analizzare il microambiente tumorale e mappare le cellule immunitarie. Questo metodo consente di studiare marcatori multipli simultaneamente per comprendere la risposta terapeutica.

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Il PhenoImager HT è stato acquistato grazie ai finanziamenti forniti dal Radboud University Medical Center e dal Radboud Technology Center for Microscopy. La fibrosi cistica è sostenuta finanziariamente da una sovvenzione della Dutch Cancer Society (10673) e da una sovvenzione ERC Adv ARTimmune (834618). JT è sostenuto finanziariamente da una sovvenzione NWO Vidi (VI.Vidi.192.084). Gli autori desiderano ringraziare Eric van Dinther e Ankur Ankan per la loro assistenza nella creazione di flussi di lavoro per archiviare i dati IHC multiplex e Bengt Phung è ringraziato per le istruzioni su come implementare i dati IHC multiplex in QuPath per il disegno ROI.

Mappatura del panorama immunitario dei tumori: un protocollo approfondito di analisi IHC multiplex

<ol><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+immunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li>
<li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+into+the+tumor%3A+a+roadmap+for+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+of+human+tumors%3A+general+significance+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunoscore%3A+colon+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li>
<li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore%3A+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+classification+using+the+Immunoscore%3A+a+worldwide+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World-wide+Immunoscore+Task+Force%3A+meeting+report+from+the+34%3BMelanoma+Bridge%26%2334%2C+Napoli%2C+November+30th-December+3rd%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).</li>
<li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER+IMMUNOLOGY.+The+%26%2334%3Bcancer+immunogram%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CANCER IMMUNOLOGY. The &#34;cancer immunogram&#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li>
<li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis%3B+a+unique+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762(2020).</li>
<li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).</li>
<li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li>
<li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy%3A+Effects+on+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li>
<li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938(2022).</li>
<li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).</li>
<li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).</li>
<li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology.+Heart+%26+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma%3A+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li>
<li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).</li>
<li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , https://www.leicabiosystems.com/en-nl/ihc-ish/ihc-ish-instruments/bond-rx/ (2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

L'analisi spaziale del TME è una tecnica ricercata per saperne di più sul compartimento delle cellule immunitarie e scoprire nuovi biomarcatori prognostici e predittivi, in particolare nel campo dell'immuno-oncologia16. A questo scopo sono in fase di sviluppo molte tecniche diverse, che prevedono la rilevazione di proteine, trascritti di mRNA o una combinazione dei due, con stime fino a 100-1.000 bersagli. Tuttavia, un multiplexing più elevato comporta un minor numero di esperimenti ad alto rendimento, costi sperimentali più elevati e sfide tecniche e, spesso, solo una piccola parte del TME può essere analizzata. L'IHC multiplex che utilizza il metodo basato su TSA che descriviamo qui, rileva sei diversi marcatori + DAPI contemporaneamente, è relativamente meno costoso da eseguire e intere sezioni di tessuto vengono visualizzate in meno di 20 minuti, pronte per essere analizzate completamente. Questa tecnica è diventata meno complessa con l'automazione della procedura di colorazione. I miglioramenti apportati al microscopio multispettrale, che includono l'aggiunta di due filtri aggiuntivi, hanno migliorato enormemente i tempi di demiscelazione e scansione spettrale. È possibile rilevare contemporaneamente fino a otto diversi marcatori + DAPI. Tuttavia, espandendo il multiplexing con più marcatori, i vantaggi di cui sopra scompaiono poiché la miscelazione spettrale diventa più difficile e i tempi di scansione per interi vetrini aumentano notevolmente. Sono in corso sforzi per standardizzare l'IHC multiplex tra diverse istituzioni per facilitare più facilmente l'implementazione in ambito diagnostico. Per questa standardizzazione dell'IHC multiplex, consigliamo agli utenti di aderire al protocollo più accessibile con sei diversi marcatori + DAPI. Tuttavia, è necessario ancora un po' di know-how tecnico e l'analisi a valle può essere impegnativa, per la quale abbiamo sviluppato metodologie descritte in questo protocollo.
La standardizzazione inizia con lo sviluppo di pannelli IHC multiplex. L'importanza della scelta di anticorpi primari che rilevano particolari bersagli proteici è stata sottolineata prima del17. I nostri pannelli IHC multiplex sono per lo più sviluppati con cloni di anticorpi primari che vengono utilizzati e convalidati per IHC presso il nostro reparto diagnostico. Tuttavia, nel caso del pannello IHC multiplex a cellule dendritiche, la maggior parte degli anticorpi non è stata utilizzata in ambito diagnostico (van der Hoorn et al., manoscritto in presentazione). Per garantire la specificità e ridurre al minimo le differenze tra i lotti, abbiamo scelto di utilizzare anticorpi monoclonali rispetto agli anticorpi policlonali e abbiamo anche convalidato la maggior parte degli anticorpi utilizzando linee cellulari trasfettate e cellule primarie. Nel corso degli anni, diverse versioni di pannelli IHC multiplex sono state utilizzate in numerosi studi utilizzando il sistema Vectra 3 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 . Per implementare in modo ottimale questi pannelli IHC multiplex sul sistema PhenoImager HT, è stato necessario apportare alcune modifiche alle combinazioni di anticorpi primari e fluorofori. Per beneficiare di una migliore miscelazione spettrale e di tempi di scansione più rapidi di intere sezioni di tessuto, è necessaria l'implementazione dei più recenti fluorofori Opal480 e Opal780 ed evitare l'uso di fluorofori Opal540 e Opal650 nei pannelli IHC multiplex a sette colori. I tempi di scansione sono ~3-10 volte più veloci a seconda delle dimensioni della sezione di tessuto. Le regolazioni del pannello IHC multiplex sono state abbastanza facili da ottenere, ma è necessario tenere a mente alcune considerazioni. Lo spettro fluorescente di Opal480 si sovrappone molto allo spettro di autofluorescenza e quindi interferisce con la miscelazione spettrale degli eritrociti e di altre strutture autofluorescenti. L'utilizzo di una maggiore concentrazione dell'anticorpo primario abbinato a Opal480 ha risolto questo problema nella maggior parte dei casi. L'implementazione del filtro AF proprietario Sample AF sul PhenoImager HT facilita la dismiscelazione di Opal480 e l'autofluorescenza. Tuttavia, è meglio utilizzare un anticorpo primario che produca un segnale chiaro quando viene utilizzato con Opal480 in modo che il suo segnale sia superiore all'autofluorescenza.
Anche se questi pannelli IHC multiplex sono stati stabiliti, la variazione da lotto a lotto è qualcosa che deve essere considerato. Eseguendo controlli IHC monoplex prima di iniziare l'esperimento IHC multiplex completo, a volte abbiamo osservato che gli anticorpi primari si comportano più o meno forti da un esperimento all'altro. Le ragioni di ciò potrebbero essere errori di pipettaggio, condizioni di conservazione dei reagenti non ottimali e durata di conservazione. Abbiamo risolto questo problema regolando la soluzione di anticorpi primari in base alla nostra esperienza. Anche quando non è stato necessario effettuare alcuna delle regolazioni di cui sopra, con ogni esperimento batch IHC multiplex, è importante impostare i tempi di esposizione in base ai vetrini di controllo colorati con IHC monoplex.
Poiché la nostra ricerca si è inizialmente concentrata su diversi tipi di carcinomi e melanoma, i pannelli IHC multiplex dovevano essere intercambiabili tra i tipi di tumore con aggiustamenti minimi. Pertanto, abbiamo sempre incluso più tipi di tessuto (tumorale) nel processo di ottimizzazione e abbiamo osservato che le diluizioni per gli anticorpi primari per i marcatori delle cellule immunitarie possono essere mantenute simili tra i diversi tipi di tumore. Tuttavia, il rilevamento del tessuto tumorale tra carcinomi e melanoma necessita di marcatori tumorali diversi. Di conseguenza, il marcatore tumorale è sempre stato ottimizzato per funzionare all'estremità di ogni pannello IHC multiplex e attualmente viene sempre utilizzato in combinazione con Opal780, che per coincidenza deve essere anche all'ultimo fluoroforo in una procedura di colorazione IHC multiplex. Utilizzando il marcatore tumorale di conseguenza alla fine dell'IHC multiplex, questi pannelli IHC multiplex possono essere facilmente scambiati con altri tipi di tumore, come il glioblastoma (cioè GFAP) e il linfoma di Hodgkin (cioè CD30). Per l'angiosarcoma, abbiamo utilizzato questo pannello IHC multiplex linfocitario con gene correlato alla trasformazione specifica dell'eritroblasto (ERG) come marcatore tumorale con solo due esperimenti di ottimizzazione25. L'ottimizzazione ha incluso la titolazione dell'anticorpo primario ERG e il test del pannello IHC multiplex con ERG alla fine.
Altre regolazioni di questi pannelli IHC multiplex possono essere effettuate anche sostituendo un determinato marcatore di cellule immunitarie con un altro marcatore immunitario o funzionale. Ogni modifica richiede ottimizzazione. Il protocollo per l'ottimizzazione potrebbe essere seguito come descritto in precedenza17. Alcune modifiche ai pannelli IHC multiplex proposti interferiranno con gli algoritmi ImmuNet che abbiamo creato. È necessario generare dati sufficienti e dedicare tempo all'implementazione di queste modifiche nell'algoritmo (almeno 750 annotazioni per ogni nuovo marcatore e/o fenotipo cellulare e 150 annotazioni per la convalida di marcatori precedentemente addestrati). I pannelli qui presentati non contengono marcatori funzionali, sebbene l'implementazione di marcatori di checkpoint immunitari come PD-1 e PD-L1 in pannelli IHC multiplex venga eseguita nel nostro laboratorio. Tuttavia, l'analisi dei marcatori che sono meno binari nei segnali negativi e positivi si è dimostrata più difficile ed è un'area di ricerca attiva nel nostro gruppo.
Il numero di marcatori che possono essere valutati contemporaneamente con l'IHC multiplex è limitato rispetto ad altre nuove tecniche. Sebbene ciò possa essere aggirato analizzando diversi pannelli su sezioni consecutive di un blocco FFPE, sarà difficile confrontare queste sezioni spazialmente. L'orientamento e gli artefatti piegati probabilmente non sono gli stessi dopo la preparazione del vetrino. Tuttavia, l'IHC multiplex è abbastanza accessibile, il che lo rende uno strumento attraente per più istituzioni e ricercatori e, quindi, più adatto per l'implementazione futura in un contesto diagnostico. Con la standardizzazione dei pannelli di cellule immunitarie IHC multiplex per diversi tipi di tumore e le pipeline di analisi a valle, è stato possibile acquisire maggiori conoscenze sulle differenze nel TME tra pazienti e tipi di tumore. Ciò può, ad esempio, portare a maggiori informazioni sul ruolo del TME nella risposta antitumorale a trattamenti specifici. Ciò potrebbe anche dare origine a nuovi biomarcatori per prevedere fattori come la risposta al trattamento e la sopravvivenza attesa. Nel complesso, ciò può consentire all'IHC multiplex di diventare uno strumento clinico per aiutare nel processo decisionale clinico, in un approccio di medicina personalizzata. Certo, più fasi della procedura di analisi dovrebbero probabilmente essere automatizzate e standardizzate per essere fattibili per l'uso in un contesto diagnostico quotidiano, quindi per ora è per lo più una prospettiva futuristica.
L'analisi di più marcatori su un singolo vetrino campione può essere uno strumento molto potente nonostante le sue sfide tecniche. Con protocolli sperimentali standardizzati e un metodo di analisi robusto, come abbiamo descritto qui utilizzando ImmuNet, la quantificazione di più marcatori lo rende più informativo rispetto all'IHC classico, mentre l'IHC multiplex rimane relativamente ad alto rendimento rispetto ai nuovi metodi sperimentali a plesso superiore.

Le cellule immunitarie svolgono un ruolo cruciale nella protezione contro agenti patogeni come virus e batteri, ma anche contro le cellule cancerose1. Pertanto, il sistema immunitario all'interno del microambiente tumorale (TME) è molto promettente per la scoperta di biomarcatori prognostici e predittivi2. Gli infiltrati di cellule immunitarie sono stati correlati alla prognosi in vari tipi di cancro, sebbene ciò non sia stato ancora implementato nell'assistenza clinica 3,4. Nella maggior parte dei tipi di tumore, un numero elevato di cellule T citotossiche e di cellule T helper 1 e/o un basso numero di cellule T regolatorie sono legati a buone prognosi. Sono in corso sforzi per incorporare un cosiddetto "Immunoscore" nella stadiazione TNM del cancro del colon-retto, trasformandolo in stadiazione TNM-I 5,6. L'Immunoscore è derivato dal numero totale di cellule T (rilevate con CD3) e cellule T citotossiche (rilevate con CD8) in due diverse regioni tumorali: il nucleo tumorale rispetto al margine invasivo (IM) dei tumori. È stato anche proposto che l'Immunoscore abbia un valore prognostico in altri tipi di cancro, come il melanoma, il cancro ai polmoni e il cancro al seno 6,7,8,9. Inoltre, gli infiltrati di cellule immunitarie possono anche essere correlati alla risposta all'immunoterapia con blocco del checkpoint10. Tuttavia, questi biomarcatori predittivi devono essere convalidati in studi prospettici prima di poter essere implementati di routine nella pratica clinica. Inoltre, è stato anche proposto che un singolo biomarcatore sarà insufficiente per una previsione significativa11. Pertanto, la creazione di una mappa completa di un campione di paziente combinando diversi biomarcatori è stata proposta come biomarcatore predittivo più completo in un cosiddetto "immunogramma del cancro"12.
Tra i metodi per lo studio delle cellule immunitarie nell'ambito della TME, la tecnica più antica e conosciuta è l'immunoistochimica (IHC), utilizzata di routine per i test diagnostici in diverse malattie, in particolare il cancro13. Questa tecnica è stata limitata all'uso di uno o solo pochi marcatori14 per lungo tempo e quindi è stata superata in contesti di ricerca da altre tecniche come la citometria a flusso e il profilo di espressione genica (GEP). Tuttavia, i tessuti tumorali fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) tipicamente utilizzati nella diagnostica e nella ricerca di routine non sono (in modo ottimale) adatti per la citometria a flusso e la GEP. Inoltre, sebbene la GEP e la citometria a flusso forniscano molte informazioni sul fenotipo e sulla funzione cellulare, la mancanza di informazioni spaziali è un grave svantaggio. Pertanto, l'eterogeneità all'interno di un campione, come le differenze nelle aree di un tumore infiltrate da cellule immunitarie rispetto a quelle escluse dalle cellule immunitarie, potrebbe non essere rilevata15. Sono state sviluppate nuove piattaforme per l'analisi multiplex dei tessuti FFPE, come l'IHC multiplex, la citometria di massa per imaging e il rilevamento di CO mediante indEXing (CODEX) che possono essere utilizzate per rilevare più marcatori contemporaneamente all'interno di una sezione tissutale16. Le cellule immunitarie contenute nel TME sono oggetto di studi approfonditi per trovare i migliori biomarcatori per l'immunoterapia. Tuttavia, le tecniche multiplex e l'analisi automatizzata delle immagini pongono dei propri ostacoli.
Il nostro laboratorio ha una vasta esperienza nella colorazione IHC multiplex utilizzando il metodo di amplificazione del segnale opalino/tiramide (TSA) e lo ha automatizzato su una piattaforma IHC (vedi la tabella dei materiali)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. Abbiamo ottimizzato i pannelli di cellule immunitarie per il rilevamento di diversi sottogruppi di linfociti, cellule mieloidi e cellule dendritiche (DC). I tessuti che contengono aree di cellule immunitarie dense - per i linfociti o le morfologie cellulari complesse (ad esempio, cellule mieloidi e DC) - sono particolarmente difficili da analizzare, con il rischio di sovrastimare o sottostimare il numero di cellule immunitarie presenti. Per superare questo problema, il nostro gruppo32 ha sviluppato il software di analisi ImmuNet e questa pipeline di apprendimento automatico ha migliorato enormemente la qualità del rilevamento di questi diversi tipi di cellule immunitarie. Qui viene descritto un protocollo dettagliato dall'ottenimento del materiale FFPE all'analisi della densità delle cellule immunitarie in diversi compartimenti tissutali e delle distanze tra i tipi di cellule immunitarie.
Questo protocollo delinea le modalità di esecuzione dei pannelli IHC multiplex presso il Radboud University Medical Center dall'implementazione dell'imager di patologia digitale nel 2022. I pannelli IHC multiplex descritti possono essere utilizzati per diversi carcinomi (ad es. polmone, prostata, colon-retto, vescica, mammella) con l'uso di un anticorpo pan-citocheratina come marcatore tumorale o per il melanoma con l'uso di anticorpi associati ai melanociti come marcatori tumorali. Questi protocolli IHC multiplex sono stati accuratamente ottimizzati in termini di concentrazione di anticorpi primari, combinazioni di fluorofori e sequenza della procedura di colorazione. Noi e altri abbiamo descritto l'ottimizzazione del pannello IHC multiplex in precedenza 17,33,34,35. I pannelli IHC multiplex possono essere adattati, ma le pipeline di analisi descritte devono essere valutate ed eventualmente regolate o riaddestrate di conseguenza. I protocolli IHC multiplex a sette colori descritti utilizzano i fluorofori opalini Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 e 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), in modo che la scansione facile e veloce sull'imager sia abilitata con "Multispectral One Touch ImmunoFluorescence" (MOTiF). La colorazione e la scansione a nove colori non sono descritte in questo protocollo, in quanto ciò richiede una messa a punto ancora maggiore della configurazione sperimentale e un'altra modalità di scansione sull'imager che utilizza il filtro sintonizzabile a cristalli liquidi.

<table><tbody><tr><td>Tendone cellulare anti-CD14</td><td></td><td>114R-16</td><td>sezione 3, clone EPR3653</td></tr><tr><td>anti-CD163</td><td>Cell Marque&nbsp;</td><td>163M-15</td><td>sezione 3, clone MRQ-26</td></tr><tr><td>anti-CD19</td><td>Abcam</td><td>ab134114</td><td>sezione 3, clone EPR5906</td></tr><tr><td>anti-CD1c (BDCA1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA505411</td><td>sezione 3, clone OTI2F4</td></tr><tr><td>anti-CD20</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-340-S</td><td>sezione 3, clone L26</td></tr><tr><td>anti-CD3</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9107</td><td>sezione 3, clone sp7</td></tr><tr><td>anti-CD303/ Dendritici BDCA2</td><td>tramite Enzo Lifesciences/Axxora</td><td>DDX0043</td><td>sezione 3, clone 124B3.13</td></tr><tr><td>anti-CD56</td><td>Cell Marque&nbsp;</td><td>156R-94</td><td>sezione 3, clone MRQ-42</td></tr><tr><td>anti-CD66b</td><td>BD Biosciences</td><td>555723</td><td>sezione 3, clone G10F5</td></tr><tr><td>anti-CD68</td><td>Dako Agilent</td><td>M087601</td><td>sezione 3, clone PG-M1</td></tr><tr><td>anti-CD8</td><td>Dako Agilent</td><td>M7103</td><td>sezione 3, clone C8/144B</td></tr><tr><td>anti-Foxp3</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-4777</td><td>sezione 3, clone 236A/E7</td></tr><tr><td>anti-Gp100</td><td>Dako Agilent</td><td>M063401</td><td>sezione 3, clone HMB45</td></tr><tr><td>anti-HLA-DR, DP, DQ</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53302</td><td>sezione 3, clone CR3/43</td></tr><tr><td>anti-MART-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-799</td><td>sezione 3, clone A103</td></tr><tr><td>anti-pan citocheratina</td><td>Abcam</td><td>ab86734</td><td>sezione 3, clone AE1/AE3 + 5D3</td></tr><tr><td>anti-SOX10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383R</td><td>sezione 3, clone EP268</td></tr><tr><td>anti-tirosinasi</td><td>Sanbio</td><td>MONX10591</td><td>sezione 3, clone T311</td></tr><tr><td>anti-XCR1</td><td>Cell Signaling Technologies via Biok&eacute;</td><td>44665S</td><td>sezione 3, diluente anticorpo clone D2F8T</td></tr><tr><td></td><td>Akoya BioSciences</td><td>SKU&nbsp; ARD1001EA</td><td>sezione 3, da Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 vetrini (può essere sostituito opzionalmente anche da TBST con 10% BSA)</td></tr><tr><td>Bond Aspirating Probe</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.0605</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Bond Aspirating Probe Cleaning</td><td>Leica Biosciences</td><td>CS9100</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Bond Dewax Solution</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9222</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Bond Objectglas etichetta + lanugine di stampa</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4564.A</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Sistema di rilevamento della ricerca sui legami 2</td><td>Leica Biosciences</td><td>DS9777</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Autocoloratore Bond RX&nbsp;</td><td>Leica Biosciences-sezione</td><td></td> <td>3, piattaforma automatizzata</td></tr><tr><td>Bond TM Recupero dell'epitopo 1 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9961</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Bond TM Recupero dell'epitopo 2 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9640</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Bond TM Soluzione di lavaggio 10x - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9590</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>BOND Copribile universale</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4611</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Kit di titolazione Bond(TM)</td><td>Leica Biosciences</td><td>OPT9049</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti 24 x 32 mm #1 (0,13-0,16 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15717592</td><td>sezione 2</td></tr><tr><td>vetrino coprioggetti 24 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td>sezione 2</td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-20</td><td>sezione 3, ogni volta che i vetrini monoplex devono essere controllati rapidamente, non per l'analisi ufficiale, quindi DAPI viene colorato separatamente per risultati migliori</td></tr><tr><td>Eosina</td><td></td><td></td><td>sezione 2, fatto in casa</td></tr><tr><td>Etanolo 99,5%</td><td>VWR</td><td>4099.9005</td><td>sezione 2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-01</td><td>sezione 3&nbsp;</td></tr><tr><td>ematossilina-sezione</td><td></td><td></td> 2, pipeline di rilevamento e fenotipizzazione delle cellule immunitarie <td>ImmuNet</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> fatta in casa <tr><td>Software inForm 2.4.10</td><td>Akoya BioSciences-sezione</td><td></td> <td>4 e 6</td></tr><tr><td>Pacchetto di reagenti OPAL 480</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1500001KT</td><td>sezione 3</td>Pacchetto</tr> di <tr><td>reagenti OPAL 520</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1487001KT</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Confezione di reagenti OPAL 570</td><td>FP1488001KT</td><td>sezione 3</td><td>Confezione</td></tr> di <tr><td>reagenti OPAL 620 Confezione di reagenti</td><td>FP1495001KT</td><td></td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>di OPAL 690 Confezione di reagenti</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1497001KT</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Confezione di reagenti OPAL 780</td><td>Sezione 3 Akoya BioSciences</td><td>FP1501001KT</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 diapositiva</td><td>Akoya BioSciences</td><td>NEL821001KT</td><td>sezione 3</td></tr><tr><td>PhenoChart 1.1.0</td><td>Akoya BioSciences-sezione</td><td></td> <td>5</td></tr><tr><td>PhenoImagerHT</td><td>Akoya BioSciences</td><td>CLS143455</td><td>sezione 4, imager patologico digitale con visualizzatore di diapositive e software di imaging (precedentemente noto come Vectra Polaris)</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Quick-D</td><td>Klinipath</td><td>7280</td><td>sezione 2</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>piattaforma software per l'analisi dell'immagine dell'intero vetrino</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scatole per vetrini</td><td>VWR</td><td>631-0737</td><td>sezione 1</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Thermo Scientific fino a VWR</td><td>631-9483</td><td>sezione 1</td></tr><tr><td>Software Vectra Polaris 1.0.13</td><td>Akoya BioSciences-sezione</td><td></td> <td>4</td></tr><tr><td>Xilene</td><td>VWR</td><td>4055-9005</td><td>Sezione 2</td></tr></tbody></table>

analisi immunoistochimica multiplex del panorama spaziale delle cellule immunitarie del microambiente tumorale

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

Il panorama delle cellule immunitarie del microambiente tumorale contiene potenzialmente informazioni per la scoperta di biomarcatori prognostici e predittivi. L'immunoistochimica multiplex è uno strumento prezioso per visualizzare e identificare diversi tipi di cellule immunitarie nei tessuti tumorali, conservando le informazioni spaziali. Qui forniamo protocolli dettagliati per analizzare le popolazioni di cellule linfocitarie, mieloidi e dendritiche in sezioni di tessuto. A partire dal taglio di sezioni fissate in formalina e incluse in paraffina, alle procedure automatiche di colorazione multiplex su una piattaforma automatizzata, alla scansione dei vetrini su un microscopio per immagini multispettrale, fino all'analisi delle immagini utilizzando un algoritmo di apprendimento automatico sviluppato internamente ImmuNet. Questi protocolli possono essere applicati a una varietà di campioni tumorali semplicemente cambiando i marcatori tumorali per analizzare le cellule immunitarie in diversi compartimenti del campione (tumore contro margine invasivo) e applicare l'analisi del vicino più vicino. Questa analisi non si limita ai campioni tumorali, ma può essere applicata anche ad altri tessuti (non) patogeni. I miglioramenti apportati alle apparecchiature e al flusso di lavoro negli ultimi anni hanno ridotto significativamente i tempi di produzione, facilitando l'applicazione futura di questa procedura in ambito diagnostico.

Questo protocollo descrive in dettaglio come viene effettuata la caratterizzazione delle cellule immunitarie del microambiente tumorale utilizzando l'immunoistochimica multiplex.

Analisi immunoistochimica multiplex del panorama spaziale delle cellule immunitarie del microambiente tumorale

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

Il nostro obiettivo è identificare la quantità, il tipo e la posizione delle cellule immunitarie all'interno dei microambienti tumorali. Nel campo dell'immunochimica, negli ultimi anni ci sono stati grandi progressi tecnologici. I progressi nella tecnologia immunochimica multiplex consentono di studiare in modo affidabile un maggior numero di marcatori.Le attuali sfide sperimentali consistono nella visualizzazione di tipi specifici di cellule immunitarie all'interno di campioni tumorali, che sono state superate utilizzando i metodi di immunochimica multiplex. Tuttavia, un'analisi automatica accurata di queste immagini è ancora una sfida su cui stiamo lavorando. Le differenze tra il panorama delle cellule immunitarie tra tumori primari e metastatici generano domande come: quali proprietà intrinseche del tumore guidano queste differenze e cosa significano queste differenze per le terapie che prendono di mira il sistema immunitario?Accanto al nostro lavoro esplorativo, ci concentreremo anche su questioni clinicamente rilevanti come il modo in cui il panorama delle cellule immunitarie del tumore è influenzato da diversi tipi di terapie antitumorali e se il panorama delle cellule immunitarie potrebbe prevedere l'esito della terapia.

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Imaging a immunofluorescenza multiplexato per analizzare sottopopolazioni di cellule T resistenti all'immunoterapia

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