Name: Monitoraggio della disseminazione delle cellule tumorali dalle metastasi polmonari utilizzando la fotoconversione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Scopri un metodo chirurgico per la fotoconversione selettiva delle metastasi polmonari nel cancro al seno. Questa tecnica consente di tracciare la redisseminazione delle cellule tumorali in vivo e di identificare i fattori che influenzano la progressione metastatica.

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Gli autori desiderano ringraziare Wade Koba per la sua assistenza con la micro tomografia computerizzata (S10RR029545), Vera DesMarais e Hillary Guzik dell'Analytical Imaging Facility per la loro formazione e assistenza con la microscopia, l'Einstein Montefiore Cancer Center, il National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), il Gruss Lipper Biophotonics Center, l'Integrated Imaging Program for Cancer Research, una borsa di studio post-dottorato Sir Henry Wellcome (221647/Z/20/Z) e un premio per lo sviluppo della carriera METAvitor.

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti per l'uso di animali vertebrati, inclusa la previa approvazione da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Albert Einstein College of Medicine.
Prima dell'intervento chirurgico, le metastasi polmonari devono essere generate nei topi utilizzando cellule tumorali che esprimono una proteina fotoconvertibile/fotocommutabile; Sono stati pubblicati diversi protocolli per la generazione di metastasi polmonari 26,27,28.
1. Preparazione all'intervento chirurgico
<ol><li>Preparare aree di lavoro distinte per la preparazione del topo (depilazione e intubazione), chirurgia e recupero.</li>
	<li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave. NOTA: Poiché per questo intervento chirurgico viene utilizzata una tecnica di sola punta, è possibile utilizzare uno sterilizzatore a microsfere calde per risterilizzare gli strumenti per le procedure successive.</li>
	<li>Accendere la piattaforma chirurgica riscaldata e lasciarla raggiungere e stabilizzare a 37-40 °C.</li>
	<li>Indurre l'anestesia con isoflurano al 5%, quindi abbassare l'isoflurano al 3%. Eseguire periodicamente test di pizzicamento delle dita dei piedi durante la procedura per valutare l'adeguatezza dell'anestesia.</li>
	<li>Posizionare il topo anestetizzato in una posizione di decubito laterale destro. Rimuovere i peli della parte superiore sinistra del torace/lato del corpo (vedere la Figura 1A) applicando una crema depilatoria sulla zona. Inumidisci un pezzo di garza o un tovagliolo di carta con acqua e pulisci i capelli e la crema depilatoria. Ripetere se necessario fino a quando tutti i peli non sono stati rimossi dal campo operatorio. NOTA: Non lasciare la crema depilatoria sul topo per più di 20 secondi, poiché ciò può danneggiare la pelle.</li>
	<li>Fare un doppio nodo ~3 mm sopra la base di un catetere da 22 G con sutura di seta 2-0. Lascia code lunghe 2 pollici.</li>
	<li>Intubare il topo con questo catetere come descritto in precedenza29,30. Per confermare l'esito positivo dell'intubazione, collegare un bulbo di gonfiaggio all'estremità del catetere e premere delicatamente. NOTA: I topi che sono stati intubati con successo sperimenteranno un aumento bilaterale del torace con compressione del bulbo.</li>
	<li>Fissare saldamente la sutura di seta 2-0 attorno al muso del topo con un doppio nodo per mantenere il catetere per intubazione in posizione.</li>
</ol>2. Intervento chirurgico per esporre il polmone
NOTA: Eseguire tutte le fasi dell'intervento chirurgico (Figura 1), compresa la fotoconversione, in una cappa o in una cabina a flusso laminare per evitare la contaminazione del campo operatorio.
<ol><li>Lavarsi le mani con sapone antisettico e indossare guanti sterili nuovi. NOTA: Poiché per questo intervento chirurgico viene utilizzata una tecnica di sola punta, è possibile utilizzare anche guanti non sterili. Si consiglia di igienizzare guanti non sterili con un disinfettante a base alcolica.</li>
	<li>Preparare una dose di 0,1 mg/kg di buprenorfina (0,03 mg/ml) e iniettare per via sottocutanea per analgesia. NOTA: L'analgesia multimodale, compresi i bloccanti del dolore locali e i farmaci antinfiammatori non steroidei, deve essere utilizzata in combinazione con buprenorfina se non si prevede che interferiscano con la biologia di interesse.</li>
	<li>Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi del topo per prevenire danni alla cornea.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella posizione di decubito laterale destra sulla piattaforma chirurgica riscaldata.</li>
	<li>Collegare il ventilatore al catetere per intubazione. Fare attenzione a tenere fermo il catetere, poiché anche lievi movimenti possono disturbare il posizionamento del catetere e portare a una scarsa ventilazione.</li>
	<li>Osservare l'alzarsi e l'abbassarsi bilaterale del torace in modo stabile, controllato dal ventilatore.</li>
	<li>Fissare gli arti alla piattaforma chirurgica con nastro adesivo. Stabilizzare il campo chirurgico posizionando un altro pezzo di nastro adesivo lungo la schiena del topo e fissando la pelle dorsale e il pelo alla piattaforma chirurgica (Figura 1A).</li>
	<li>Aprire gli strumenti chirurgici sterilizzati.</li>
	<li>Applicare la soluzione di clorexidina sulla pelle del topo per sterilizzare il sito chirurgico.</li>
	<li>Identificare l'area ~7 mm a sinistra dello sterno e ~7 mm sopra il margine sottocostale. Sollevare la pelle su quest'area con una pinza e praticare un'incisione circolare di ~10 mm utilizzando forbici affilate per microdissezione, avendo cura di tagliare solo la pelle.</li>
	<li>Rimuovere i tessuti molli sopra la gabbia toracica (Figura 1B). Cauterizzare tutti i vasi principali ad entrambe le estremità con una penna per cauterizzazione. NOTA: Oltre all'asportazione di tutti i tessuti molli sottostanti l'incisione circolare di 10 mm nella pelle, la rimozione di alcuni tessuti molli non muscolari aggiuntivi dal perimetro facilita le fasi future della procedura.</li>
	<li>Con una mano, usa le pinze per sollevare la 6ao la 7a costola. Con l'altra mano, utilizzare una singola lama delle forbici da micro-dissezione smussate - angolata parallelamente alla parete toracica, bordo arrotondato rivolto verso il basso - e perforare con cautela il 6° o 7° muscolo intercostale per entrare nella cavità toracica (Figura 1C). Ruotare delicatamente le forbici secondo necessità e tagliare per praticare un'incisione di ~10 mm nello spazio intercostale, facendo attenzione a non toccare il tessuto polmonare e tagliare le costole.</li>
	<li>Scaricare delicatamente l'aria compressa verso l'incisione intercostale per aumentare lo spazio tra il polmone e la parete toracica. Scaricare l'aria prima dal polso o dalla mano per trovare la forza di flusso appropriata e liberare l'ugello da eventuali detriti, quindi in brevi raffiche sull'incisione per prevenire lesioni polmonari.</li>
	<li>Con una mano, usa le pinze per sollevare la 6ao la 7a costola. Con l'altra mano, tenere chiuso il divaricatore e inserirlo nell'incisione intercostale. Orientare le lame del divaricatore in modo che siano parallele alla parete toracica, facendo attenzione a non toccare il polmone stesso (Figura 1D).</li>
	<li>Una volta posizionato il divaricatore, rilasciare lentamente la maniglia, consentendo al divaricatore di aprirsi ed esporre il polmone (Figura 1E). La Figura 2A mostra immagini rappresentative delle metastasi polmonari esposte prima della fotoconversione, compreso il loro aspetto ad occhio nudo e nei canali fluorescenti FITC (verde, non fotoconvertito) e TRITC (rosso, fotoconvertito) durante l'utilizzo dell'illuminazione ad ampio campo.</li>
</ol>3. Fotoconversione delle metastasi polmonari
NOTA: I dettagli e le variazioni sui seguenti passaggi sono disponibili nella Discussione.
<ol><li>Applicare delicatamente 2-3 gocce di PBS sterile riscaldato a 37 °C sul tessuto polmonare esposto per evitare che si secchi.</li>
	<li>Posiziona un pezzo di foglio di alluminio sterile con un piccolo ritaglio sopra il mouse. Posizionare il ritaglio direttamente sul tessuto polmonare esposto e dimensionarlo in modo da esporre solo la porzione aperta del torace e alcuni millimetri di tessuto molle e pelle circostanti per garantire la fotoconversione del solo polmone esposto.</li>
	<li>Posiziona una scatola con un ritaglio sopra il mouse e un foglio di alluminio. Assicurarsi che l'apertura sia direttamente sopra il polmone esposto.</li>
	<li>Posizionare la lampada di fotoconversione direttamente sopra l'apertura sulla scatola (Figura 1F).</li>
	<li>Accendere la lampada di fotoconversione e lasciare 6 minuti di illuminazione continua del tessuto polmonare esposto. NOTA: Monitorare i segni vitali del topo utilizzando i programmi di monitoraggio fisiologico sul ventilatore.</li>
	<li>Dopo la fotoconversione, spegnere la lampada e rimuovere la lampada, la scatola e la maschera di alluminio dal mouse.</li>
</ol>4. Procedura per chiudere la parete toracica
<ol><li>Ripetere il passaggio 2.13 per separare il polmone dalla parete toracica.</li>
	<li>Afferrare con cautela la maniglia del divaricatore e premere per chiudere le lame.</li>
	<li>Manovrare il divaricatore chiuso fuori dallo spazio intercostale, facendo attenzione a non toccare il tessuto polmonare.</li>
	<li>Utilizzando la sutura di seta 5-0, chiudere l'incisione intercostale con un semplice schema di sutura continuo che incorpora la costola su entrambi i lati dell'incisione (Figura 1G). Stringere la sutura per assicurarsi che i bordi della ferita siano apposizionali e ristabilire l'integrità della parete toracica (Figura 1H). Fare attenzione a non stringere eccessivamente la sutura in quanto ciò potrebbe strappare i muscoli intercostali.</li>
	<li>Fissare la sutura annodando insieme le due estremità della sutura 4 volte. Taglia le code di sutura il più vicino possibile al nodo.</li>
	<li>Chiudere la pelle con graffette chirurgiche.</li>
	<li>Rimuovere l'aria in eccesso dalla cavità toracica con una siringa da insulina da 1 mL con un ago da 28 G attaccato. Localizzare il processo xifoideo tattilmente e inserire l'ago appena sotto, avanzando verso la spalla sinistra per entrare nella cavità toracica attraverso il diaframma. Tirare indietro la siringa a ~1 mL; Rimuovere l'ago dal mouse e scaricare l'aria dalla siringa. Ripeti questo processo 3-4 volte. NOTA: Fare attenzione a non forare gli organi interni. Inoltre, è importante utilizzare una siringa da 1 mL e ripetere la procedura 3-4 volte piuttosto che utilizzare una siringa di volume maggiore e cercare di rimuovere tutta l'aria in una volta. L'uso di una siringa di volume maggiore può provocare un vuoto eccessivo nella cavità toracica e portare a distensione e danni al tessuto polmonare.</li>
	<li>Spegnere l'isoflurano.</li>
	<li>Continuare la ventilazione con ossigeno al 100% fino a quando il topo non mostra segni di risveglio.</li>
	<li>Una volta che il topo mostra segni di risveglio, scollegare il catetere per intubazione dal ventilatore, tagliare la sutura intorno al muso ed estubare il topo.</li>
	<li>Sblocca il mouse e trasferiscilo in una gabbia pulita posizionata ~ 2 piedi sotto una lampada riscaldante. Monitorare fino a completo ripristino. Se il topo mostra segni di difficoltà respiratoria o mancanza di mobilità, anestetizzarlo con isoflurano al 5% per 5 minuti, garantire un'anestesia adeguata osservando una perdita di riflessi al momento del pizzicamento delle dita dei piedi e praticare l'eutanasia tramite lussazione cervicale.</li>
	<li>Una volta che il topo si è completamente risvegliato dall'anestesia e inizia a muoversi, preparare un'altra dose di 0,1 mg/kg di buprenorfina e iniettarla per via sottocutanea per l'analgesia postoperatoria.</li>
	<li>Dopo l'intervento, assicurarsi che i topi siano alloggiati individualmente. Fornire antibiotici nell'acqua potabile (enrofloxacina, concentrazione finale 0,4 mg/mL).</li>
	<li>Nei 3 giorni successivi all'intervento, controllare il topo due volte al giorno per segni di sofferenza. Per la gestione del dolore, somministrare 0,1 mg/kg di buprenorfina (0,03 mg/ml) per via sottocutanea ogni 4-6 ore. Sopprimere il topo se mostra segni di infezione, immobilità o difficoltà respiratorie. Dopo il terzo giorno, i topi possono essere controllati una volta al giorno.</li>
</ol>5. Elaborazione del campione e rilevamento di cellule fotoconvertite mediante pulizia dei tessuti
<ol><li>Tra 3 e 5 giorni (o il periodo di tempo desiderato) dopo l'intervento di fotoconversione, anestetizzare il topo con isoflurano al 5%, ridurre l'isoflurano dal 5% al 2,5% dopo l'induzione, garantire un'anestesia adeguata osservando una perdita di riflessi al momento del pizzicamento delle dita dei piedi ed eseguire una perfusione transcardica terminale con 10 mL di PBS a temperatura ambiente, seguita da 10 mL di paraformaldeide al 4% raffreddata a 4 °C come descrittoin precedenza 31.</li>
	<li>Raccogliere gli organi di interesse e pulirli otticamente come descritto in precedenza31.</li>
	<li>Visualizzare i tessuti puliti con un microscopio a foglio ottico come descrittoin precedenza 31. In alternativa, posizionare i tessuti puliti in una capsula con fondo di vetro e visualizzare l'immagine nei canali FITC e TRITC per visualizzare le cellule verdi (non fotoconvertite) e rosse (fotoconvertite) utilizzando un microscopio confocale, a disco rotante o multifotone.</li>
</ol>6. Elaborazione del campione e rilevamento di cellule fotoconvertite mediante disaggregazione tissutale
<ol><li>Anestetizzare il topo con isoflurano al 5% per 5 minuti, garantire un'anestesia adeguata osservando una perdita di riflessi al momento del pizzicamento delle dita dei piedi e sacrificare tramite lussazione cervicale 3-5 giorni dopo la fotoconversione.</li>
	<li>Raccogliere e digerire gli organi di interesse come descritto in precedenza13.</li>
	<li>Impiattare i tessuti digeriti e metterli in un'incubatrice per farli aderire per una notte come descritto in precedenza13.</li>
	<li>Il giorno seguente, eseguire l'imaging delle cellule piastrate nei canali FITC e TRITC per visualizzare le celle verdi (non fotoconvertite) e rosse (fotoconvertite) come descritto in precedenza13.</li>
</ol>

Esame della disseminazione delle cellule tumorali da metastasi polmonari

<ol><li>Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+90%25+of+deaths+from+cancer+caused+by+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Are 90% of deaths from cancer caused by metastases.</a> Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).</li>
<li>Gupta, G. P., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The distribution of secondary growths in cancer of the breast.</a> Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-seeding+circulating+tumor+cells+promote+the+proliferation+and+metastasis+of+human+osteosarcoma+by+upregulating+interleukin-8%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8.</a> Cell Death & Disease. 10 (8), 575(2019).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomes+promote+tumor+self-seeding+in+hepatocellular+carcinoma+by+transferring+miRNA-25-5p+to+enhance+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility.</a> Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).</li>
<li>Kim, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+self-seeding+by+circulating+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor self-seeding by circulating cancer cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+self-seeding+by+circulating+tumor+cells+in+nude+mouse+models+of+human+osteosarcoma+and+a+preliminary+study+of+its+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).</li>
<li>Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromogranin+A+regulates+tumor+self-seeding+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination.</a> Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).</li>
<li>Brown, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+blood+vessels+provide+exit+routes+for+metastatic+tumor+cell+dissemination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice.</a> Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).</li>
<li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels%2C+exit+the+node%2C+and+colonize+distant+organs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li>
<li>Coste, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematogenous+dissemination+of+breast+cancer+cells+from+lymph+nodes+is+mediated+by+tumor+microenvironment+of+metastasis+doorways%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways.</a> Frontiers in Oncology. 10, 571100(2020).</li>
<li>Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+re-dissemination+from+lung+metastases-a+mechanism+for+enhancing+metastatic+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340(2021).</li>
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<li>Kalhor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+barcoding+of+whole+mouse+via+homing+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR.</a> Science. 361 (6405), eaat9804(2018).</li>
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<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+microenvironment+invigorates+metastatic+seeds+for+further+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination.</a> Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).</li>
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<li>Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mice+mammary+fat+pad%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).</li>
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<li>Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+promotes+epithelial-to-mesenchymal+transition+and+metastasis+of+bladder+cancer+cells+through+HIF-1%CE%B1-%CE%B2-catenin%2FNotch1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways.</a> Life Sciences. 258, 118154(2020).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

In questo articolo, descriviamo un protocollo chirurgico per la fotoconversione selettiva delle cellule tumorali nel polmone. Questa tecnica consente ai ricercatori di contrassegnare selettivamente le cellule tumorali nel polmone e di monitorarne il destino reidentificandole in tutto il corpo in un secondo momento, facilitando lo studio delle metastasi da metastasi polmonari. Utilizzando questo protocollo, è stato possibile visualizzare le cellule fotoconvertite nel cervello, nel fegato e nel polmone destro non fotoconve...

Le metastasi sono la principale causa di decessi correlati al cancro1. Il cancro metastatico insorge quando le cellule del tumore primario si diffondono in tutto il corpo e proliferano in tumori clinicamente rilevabili in organi distanti 2,3.
Sebbene le metastasi siano comunemente considerate come un processo unidirezionale in cui le cellule tumorali si disseminano dal tumore primario e colonizzano organidistanti, l'aumento delle evidenze cliniche e sperimentali suggerisce che è in gioco un processo più complesso e multidirezionale. È stato dimostrato che le cellule tumorali circolanti possono riseminare il tumore primario (se ancora in sede)5,6,7,8,9 e le cellule tumorali provenienti da focolai metastatici esistenti possono viaggiare verso i siti terziari e dare origine a nuove lesioni 10,11,12,13. In effetti, l'evidenza di recenti analisi genomiche suggerisce che alcune lesioni metastatiche non derivano dal tumore primario, ma da altre metastasi, un fenomeno noto come "metastasi da metastasi" o "semina da metastasi a metastasi"14,15,16. La semina da metastasi a metastasi può perpetuare il processo patologico anche dopo la rimozione del tumore primario, aumentando il carico metastatico e diminuendo la qualità della vita e la sopravvivenza del paziente. Pertanto, la comprensione dei processi alla base della semina da metastasi a metastasi è fondamentale per perfezionare le strategie di trattamento per i pazienti con malattia metastatica.
Nonostante le implicazioni cliniche potenzialmente gravi, poco si sa sulla semina da metastasi a metastasi, in parte a causa di limitazioni logistiche e tecnologiche. Gli studi sull'uomo sono limitati dalla scarsità di campioni clinici. La resezione clinica e la biopsia delle lesioni metastatiche sono rare, così come la biopsia di organi apparentemente sani, dove possono annidarsi singole cellule tumorali disseminate. Ciò significa che gli studi sull'uomo sono in genere possibili solo utilizzando campioni autoptici di individui i cui tumori primari sono ancora in atto o sono stati precedentemente resecati ma sono ancora disponibili per i ricercatori. Quando tali campioni sono disponibili, le analisi del lignaggio della progressione del cancro devono essere eseguite utilizzando metodi di sequenziamento14. Tuttavia, il sequenziamento di massa di tumori primari e metastasi abbinati non ha la sensibilità necessaria per un tracciamento completo del lignaggio. Ad esempio, il sequenziamento di massa di una lesione può rivelare un subclone che non è rilevabile in nessuna delle sue lesioni corrispondenti. In questo caso, non si sarebbe in grado di determinare l'origine di questo subclone. Può essere stata presente nel tumore primitivo o in un'altra metastasi con una frequenza inferiore al limite di rilevamento, oppure può essere insorta dopo la colonizzazione iniziale della lesione metastatica in cui è stata trovata. Il sequenziamento a singola cellula fornisce una maggiore sensibilità, ma il suo costo elevato limita l'applicazione su larga scala di questa tecnica. La natura retrospettiva di questi studi significa anche che forniscono una visione limitata degli eventi metastatici transitori e del panorama della malattia in diversi punti temporali.
Nei modelli animali, i recenti progressi tecnologici consentono ora una mappatura filogenetica prospettica con un'elevata risoluzione spaziale e temporale 17,18,19,20. Queste tecniche utilizzano l'editing del genoma CRISPR/Cas9 per ingegnerizzare le cellule con un codice a barre in evoluzione, mutazioni ereditabili che si accumulano nel tempo. Al momento del sequenziamento, il lignaggio di ciascuna cellula può essere tracciato in base al profilo mutazionale del suo codice a barre 17,18,19,20. In effetti, tale tecnologia viene già utilizzata per mappare la semina da metastasi a metastasi. In un recente articolo, Zhang et al. hanno dimostrato che le cellule tumorali della mammella e della prostata nelle metastasi ossee si ridisseminano dall'osso per seminare metastasi secondarie in più organi21.
Sebbene questi nuovi metodi abbiano un grande potenziale per generare mappe filogenetiche dettagliate e ad alta risoluzione della progressione del cancro, sono altamente impraticabili per coloro che studiano l'esatta tempistica degli eventi di semina da metastasi a metastasi e ciò che li promuove o li previene. Colmare queste lacune di conoscenza è fondamentale per perfezionare la nostra comprensione e il trattamento del cancro metastatico, ma c'è una notevole mancanza di tecnologie per facilitare tali studi. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo recentemente sviluppato - e presentiamo qui - una nuova tecnica che ci consente di marcare in modo specifico le cellule tumorali tramite fotoconversione in un sito metastatico (il polmone) e successivamente reidentificarle negli organi terziari. Utilizzando questa tecnica, abbiamo recentemente dimostrato che le cellule del cancro al seno si ridisseminano dalle metastasi polmonari e seminano gli organi terziari13. Questa tecnica può anche essere utilizzata per determinare la tempistica degli eventi di ridisseminazione all'interno di una finestra ristretta e quantificare le cellule tumorali disseminate, facilitando lo studio dell'organotropismo delle cellule disseminate e di ciò che promuove/previene la ridisseminazione.
Mentre la fotoconversione e i sistemi cre/lox localmente inducibili che sostituiscono permanentemente una proteina fluorescente con un'altra sono stati precedentemente utilizzati per marcare e tracciare le cellule tumorali 11,22,23, per quanto ne sappiamo, nessun approccio per la marcatura spazio-temporale delle cellule tumorali è stato ottimizzato per colpire il polmone - uno dei siti più comuni di metastasi tra uomini e donne a cui è stato diagnosticato uno dei 14 tumori più comuni 24. Qualsiasi tipo di cellula tumorale e qualsiasi protocollo per la generazione di metastasi polmonari può essere utilizzato con la nostra procedura, rendendola ampiamente utile per i ricercatori di metastasi. Tutte le cellule tumorali utilizzate per generare metastasi polmonari dovrebbero esprimere una proteina fotoconvertibile o fotocommutabile e i ricercatori possono scegliere quale proteina utilizzare in base alle loro esigenze e risorse specifiche. In questo studio, abbiamo utilizzato cellule di carcinoma mammario 6DT1 che esprimevano stabilmente la proteina fluorescente fotoconvertibile da verde a rosso Dendra2 (cellule 6DT1-Dendra2)25 marcata con l'istone H2B. Abbiamo iniettato 5,0 ×10 4 cellule 6DT1-Dendra2 nel quarto cuscinetto adiposo mammario di topi femmina Rag2-/-. I tumori primari erano palpabili tra 12 e 16 giorni dopo l'iniezione e non sono stati resecati per tutta la durata dell'esperimento. Le metastasi polmonari spontanee si sono sviluppate tra 19 e 26 giorni dopo l'iniezione di cellule tumorali. Gli interventi chirurgici di fotoconversione sono stati eseguiti tra 26 e 29 giorni dopo l'iniezione di cellule tumorali. I topi sono stati sacrificati entro 72 ore dall'intervento chirurgico a causa del carico di metastasi polmonari.

<table><tbody><tr><td>Alimentazione 0-30 V, 0-3 A</td><td>MPJA</td><td>9616 PS</td><td></td></tr><tr><td>12 VDC, 1,2 A Alimentazione a spina non regolata</td><td>MPJA</td><td>17563 PD</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 mL BD Siringa per insulina</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>Lampada array di diodi a emissione luminosa da 400 nm</td><td>LedEngin Inc.</td><td>897-LZPD0UA00</td><td>Lampada di fotoconversione, costruita su misura (singole parti incluse di seguito)</td></tr><tr><td>Sutura in seta intrecciata 5-0 con ago da taglio RB-1</td><td>Ethicon, Inc.</td><td>774B</td><td></td></tr><tr><td>Cravatta in seta 9 cm 2-0</td><td>Ethicon, Inc.</td><td>LA55G</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 100 (enrofloxacina)</td><td>Bayer (Santa Cruz Biotechnology)</td><td>sc-362890Rx</td><td>Antibiotico utilizzato nell'acqua potabile</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Hospira</td><td>0409-2012-32</td> Cavi <td>analgesici</td></tr><tr><td>(assemblaggi di cavi) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD</td><td>Mouser</td><td>172-0250</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di clorexidina</td><td>Durvet</td><td>7-45801-10258-3</td><td>Clorexidina Soluzione disinfettante</td></tr><tr><td>Contenitore di aria compressa</td><td>Falcon</td><td>DPSJB-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da microdissezione extra fini 4" Dritto Affilato/Affilato 24 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5912</td><td>Sharp Micro Forbici da dissezione</td></tr><tr><td>Illuminatore a fibre ottiche</td><td>O.C. White Company</td><td>FL3000</td><td>Utilizzato durante l'intubazione del topo</td></tr><tr><td>Kit di cauterizzazione Gemini</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726067</td><td>Penna cauterica</td></tr><tr><td>Germinatore 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER&nbsp; 5287-120V</td><td>Sterilizzatore di perline</td></tr><tr><td>Pinze Graefe</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>LED ad alta potenza - ultravioletti monocolore 90 watt</td><td>Mouser</td><td>LZP-D0UA00</td><td></td></tr><tr><td>Lampada termica a infrarossi</td><td>Braintree Scientific</td><td>HL-1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano SOL 250 mL PVL</td><td>Covetrus</td><td>29405</td> Vaporizzatore <td>anestetico</td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>SurgiVet</td><td>VCT302</td><td></td></tr><tr><td>Portaaghi Jacobson con blocco</td> Nastro per etichettatura <td>Kalson Surgical</td><td>T1-140</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>S68702</td><td></td></tr><tr><td>Riflettori per illuminazione a LED CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN</td><td>Mouser</td><td>928-C11395TM</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone lungo</td><td>Medline Industries</td><td>MDS202055</td><td></td></tr><tr><td>Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron fino a 3,4 GHz / Cuscinetto a sfere / Nucleo in rame / Ventola di raffreddamento CPU</td><td>CompUSA</td><td>#S457-1023</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per micro dissezione da 4" Dritte smussate / smussate</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5980</td><td></td></tr><tr><td>ventilatore murino</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-02</td><td>PhysioSuite</td></tr><tr><td>Nair Lozione depilatoria</td><td>Amazon</td><td>B001RVMR7K</td><td>Crema depilatoria</td></tr><tr><td>Personnet mini divaricatore</td><td>Roboz</td><td>RS-6504</td><td>Divaricatore</td></tr><tr><td>Fosfato Soluzione salina tamponata 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>PBS</td></tr><tr><td>pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W</td><td>Addgene</td><td>51005</td><td>Dendra2 lentivirus</td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>008897</td><td>Lubrificante per gli occhi</td></tr><tr><td>Supporto per intubazione per roditori</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>Bulbo di gonfiaggio polmonare per piccoli animali</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>72-9083</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma chirurgica multifunzionale SurgiSuite per topi, con riscaldamento</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M02</td><td>Piattaforma chirurgica riscaldata</td></tr><tr><td>Puntali 48" TEST LEAD BANANA - Nero</td><td>Mouser</td><td>565-1440-48-0</td><td></td></tr><tr><td>Puntali 48" PUNTALE A BANANA - Rosso</td><td>Mouser</td><td>565-1440-48-2</td><td></td></tr><tr><td>Catetere tracheale&nbsp;</td><td>Exelint International</td><td>26746</td><td>Catetere da 22 G</td></tr><tr><td>Kit veterinario per sistema di chiusura delle ferite</td><td>Clay Adams</td><td>IN015</td><td>Kit di pinzatura chirurgica veterinaria</td></tr></tbody></table>

monitoraggio della disseminazione delle cellule tumorali dalle metastasi polmonari utilizzando la fotoconversione

Tracking Tumor Cell Dissemination from Lung Metastases Using Photoconversion

Le metastasi - la diffusione sistemica del cancro - sono la principale causa di decessi correlati al cancro. Sebbene le metastasi siano comunemente considerate come un processo unidirezionale in cui le cellule del tumore primario si disseminano e seminano metastasi, le cellule tumorali nelle metastasi esistenti possono anche ridisseminarsi e dare origine a nuove lesioni nei siti terziari in un processo noto come "metastasi da metastasi" o "semina da metastasi a metastasi". La semina da metastasi a metastasi può aumentare il carico metastatico e diminuire la qualità della vita e la sopravvivenza del paziente. Pertanto, la comprensione dei processi alla base di questo fenomeno è fondamentale per perfezionare le strategie di trattamento per i pazienti con cancro metastatico.
Poco si sa sulla semina da metastasi a metastasi, in parte a causa di limitazioni logistiche e tecnologiche. Gli studi sulla semina da metastasi a metastasi si basano principalmente su metodi di sequenziamento, che potrebbero non essere pratici per i ricercatori che studiano l'esatta tempistica degli eventi di semina da metastasi a metastasi o ciò che li promuove o li previene. Ciò evidenzia la mancanza di metodologie che facilitino lo studio del seeding da metastasi a metastasi. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato - e descriviamo qui - un protocollo chirurgico murino per la fotoconversione selettiva delle metastasi polmonari, consentendo la marcatura specifica e il monitoraggio del destino delle cellule tumorali che si ridisseminano dal polmone ai siti terziari. Per quanto ne sappiamo, questo è l'unico metodo per studiare la ridisseminazione delle cellule tumorali e la semina da metastasi a metastasi dai polmoni che non richiede l'analisi genomica.

Le fasi dell'intervento chirurgico descritte in questo protocollo sono illustrate nella Figura 1. In breve, il topo viene anestetizzato e i peli vengono rimossi dal torace sinistro. Il topo viene quindi intubato e ventilato, il che consente al topo di ricevere ossigeno mentre la cavità toracica è aperta. I tessuti molli vengono rimossi per esporre la gabbia toracica e viene praticata un'incisione nel 6° o 7° muscolo intercostale. Un divaricatore viene inserito nella bre...

Presentiamo un metodo per lo studio della ridisseminazione delle cellule tumorali da metastasi polmonari che prevede un protocollo chirurgico per la fotoconversione selettiva delle metastasi polmonari, seguito dall'identificazione di cellule tumorali ridisseminate negli organi terziari.

Monitoraggio della disseminazione delle cellule tumorali dalle metastasi polmonari utilizzando la fotoconversione

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional ...

Recenti evidenze suggeriscono che le lesioni metastatiche esistenti possono fungere da fonte di disseminazione di cellule tumorali che danno origine a nuove lesioni. Questo processo è chiamato semina da metastasi a metastasi e può aumentare il carico tumorale e diminuire la qualità della vita e la sopravvivenza dei pazienti oncologici. Il nostro metodo è stato sviluppato per studiare la semina da metastasi a metastasi e i fattori che la influenzano.Questa tecnica ha aiutato il nostro laboratorio a stabilire che le cellule del cancro al seno possono diffondersi dalle metastasi polmonari e ci ha permesso di studiare i fattori che promuovono o prevengono le metastasi. Questi risultati possono guidare la ricerca futura sul rallentamento della progressione del cancro metastatico. I polmoni sono un sito comune di metastasi, ma pochissime tecniche consentono lo studio della dinamica delle cellule tumorali in vivo.Questa tecnica consente il tracciamento delle cellule tumorali in topi vivi, facilitando lo studio delle metastasi polmonari, delle specifiche vie di disseminazione e delle terapie. Il cancro metastatico è spesso una malattia incurabile e fatale. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare modi per ridurne la diffusione, portando a terapie che prolungano la vita dei pazienti.

tracking-tumor-cell-dissemination-from-lung-metastases-using

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Qui si descrivono i metodi per costruire, visualizzare e quantificare le reazioni bioluminescenti sia lucciola e Renilla enzimi luciferasi espressi in cellule metastatiche di cancro al seno durante la loro crescita e le...

In vivo doppio substrato Bioluminescent Imaging

Diffuse la tomografia di fluorescenza offre un approccio relativamente a basso costo e potenzialmente ad alta dappertutto per...

Tomografia Computerizzata guidata nel dominio del tempo Tomography Diffuse fluorescenza in animali di piccola taglia per la localizzazione dei biomarcatori tumorali

Il nuovo protocollo riportato nel presente studio permette la rilevazione selettiva delle metastasi polmonari con una risoluzione singola cellula nei topi...

Una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari a risoluzione singola cella in Mouse di combinata<em&gt; In-situ</emPerfusione&gt; del tessuto polmonare e X-Gal colorazione del<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged cellule tumorali

Descriviamo un metodo relativamente semplice per ex vivo l'imaging dal vivo del tumore interazioni cellula-stroma all'interno di metastasi polmonari, utilizzando i reporter fluorescenti nei topi. Utilizzando la microscopia confocale spinning-disk, questa tecnica consente la visualizzazione di cellule vive per almeno 4 ore e potrebbe essere adattato per studiare altre malattie polmonari infiammatorie.

Ex vivo dal vivo Imaging di polmone metastasi e il loro micro

Descriviamo un metodo per l'etichettatura stabile di xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) con particelle lentivirali che esprimono proteina fluorescente verde e reporter di luciferasi. Questo metodo consente di monitorare la crescita dei PDX nel sito primario, nonché di rilevare metastasi spontanee e sperimentali utilizzando sistemi di imaging in vivo.

Etichettatura di cancro al seno xenotrapianti derivati ​​da pazienti con tracciabili Reporter per crescita tumorale e metastasi Studi

Un modello animale è necessario per decifrare il ruolo di fare circolare le cellule del tumore (CTCs) nel promuovere la colonizzazione del polmone durante la metastasi del cancro. Qui, abbiamo stabilito ed effettuato con successo un in vivo analisi specificamente prova il requisito dell'Assemblea polimerici fibronectina (polyFN) su CTCs per colonizzazione del polmone.

L'istituzione di un'analisi di colonizzazione del polmone per la visualizzazione di cellule del tumore nei tessuti polmonari di circolazione

Descriviamo un protocollo per il rilevamento di preclinici in vivo della metastasi del cancro. Si basa su un reporter del radionuclide-fluorescenza combinando lo symporter dello ioduro di sodio, rilevato da non-invasiva [18F] tetrafluoroborate-PET e una proteina fluorescente per semplificata ex vivo conferma. Il metodo è applicabile per preclinici in vivo delle cellule di rilevamento di là di biologia del tumore.

Del radionuclide-fluorescenza Reporter Gene Imaging per monitorare la progressione del tumore nei modelli del roditore del tumore

Qui, noi dimostrare i metodi per la quantificazione in vivo d'uscita del leucocita da ingenuo, infiammato e maligni della pelle murino. Eseguiamo un confronto testa a testa tra due modelli: transdermico FITC applicazione ed in situ fotoconversione. Inoltre, dimostriamo l'utilità di fotoconversione per servizi esterni del leucocita di rilevamento da tumori cutanei.

Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori

L'approccio descritto combina saggi sperimentali di metastasi della vena della coda con immagini animali vive in vivo per consentire il monitoraggio in tempo reale della formazione e della crescita della metastasi del cancro al seno, oltre alla quantificazione del numero e delle dimensioni delle metastasi nei polmoni.

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Qui presentiamo un protocollo per l'impianto chirurgico di una finestra ottica permanentemente a dimora per il torace murino, che consente l'imaging intravitale ad alta risoluzione del polmone. La permanenza della finestra la rende adatta allo studio dei processi cellulari dinamici nel polmone, in particolare quelli che si stanno lentamente evolvendo, come la progressione metastatica delle cellule tumorali disseminate.

Una finestra permanente per indagare sulle metastasi del cancro al polmone

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Scopri un metodo chirurgico per la fotoconversione selettiva delle metastasi polmonari nel cancro al seno. Questa tecnica consente di tracciare la redisseminazione delle cellule tumorali in vivo e di identificare i fattori che influenzano la progressione metastatica.

Monitoraggio della disseminazione delle cellule tumorali dalle metastasi polmonari utilizzando la fotoconversione

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