Name: Estrazione del DNA di diatomee da campioni dacqua e tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 20 s
Description: Impara un protocollo di estrazione del DNA di diatomee modificato per ricerche forensi sui casi di annegamento. Questo metodo semplice ed economico migliora le pratiche investigative forensi.

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Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) e dall'Academician Innovation Platform Scientific Research Project della provincia di Hainan (YSPTZX202134).

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Medicina di Hainan. I campioni di tessuto utilizzati in questo studio non sono considerati studi che coinvolgono soggetti umani. Questi campioni sono stati ottenuti ai fini della diagnosi patologica forense e il resto è stato utilizzato per l'estrazione del DNA delle diatomee in questo esperimento. I ricercatori non sono in grado di identificare prontamente gli individui per ottenere il consenso informato dalle parti interessate.
NOTA: Per garantire l'applicabilità generale del metodo di ricerca riportato in questo esperimento, questo esperimento ha sostanzialmente seguito le istruzioni operative del kit utilizzato, e solo alcuni passaggi sono stati modificati. I campioni d'acqua utilizzati in questo esperimento sono stati prelevati in modo casuale da stagni vicino al laboratorio (Figura supplementare 1A). In questo esperimento, il tessuto polmonare del corpo annegato è stato confermato come il tessuto di ricerca per dimostrare il protocollo di estrazione (Figura supplementare 1B). Nella pratica forense, a volte è anche necessario utilizzare altri organi e tessuti di corpi annegati (come fegato, milza, rene, midollo osseo, ecc.) per estrarre il DNA delle diatomee, il che richiede piccoli miglioramenti corrispondenti a questo metodo sperimentale, che saranno spiegati nella sezione corrispondente dell'esperimento. I campioni di tessuto polmonare utilizzati in questo esperimento provenivano da cadaveri che erano stati chiaramente annegati in casi forensi. Sono stati condotti test morfologici per dimostrare che il tessuto polmonare contiene diatomee (Figura 2 supplementare).
1. Pretrattamento dei campioni
<ol><li>Pretrattamento dei campioni d'acqua<ol><li>Prelevare 10 ml di campione d'acqua nella provetta da centrifuga e centrifugare a 13.400 x g per 5 minuti. Scartare con cautela 9,8 mL di surnatante con una pistola a pipetta e trasferire circa 200 μL di campione di acqua di diatomee arricchita rimasto sul fondo in una provetta da centrifuga da 2 mL. NOTA: Il pre-esperimento può essere eseguito prima e la quantità iniziale può essere aumentata se un campione di acqua da 10 ml non è sufficiente per l'arricchimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Pretrattamento di campioni di tessuto<ol><li>Prelevare 0,5 g di tessuto del margine polmonare dal corpo annegato, tritare o macinare completamente il tessuto polmonare fino a quando non diventa fangoso. Prevenire la contaminazione delle diatomee esogene è il fulcro di questa fase. Taglia ripetutamente il tessuto a pezzi usando le forbici.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Estrazione del DNA
NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione vengono completate a temperatura ambiente. Utilizzando una centrifuga da tavolo con una forza centrifuga di 14.500 x g; prima dell'inizio dell'esperimento è necessario preparare un bagno d'acqua (o un bagno metallico) preriscaldato a 70 °C. Tutte le fasi devono seguire rigorosamente i principi del funzionamento asettico.
<ol><li>Assemblaggio di campioni d'acqua e tessuti NOTA: Il campione d'acqua e il metodo di estrazione del DNA delle diatomee tissutali sono gli stessi.<ol><li>Aggiungere le perle di vetro a una provetta da centrifuga da 2 mL contenente il campione di acqua pretrattata. Invertire 10x-15x per mescolare bene. Le perle di vetro aggiunte sono composte da perle di vetro grandi e piccole mescolate in un rapporto di massa di 1:1. Il diametro delle perle di vetro grandi è di 1,5-2,0 mm e quello delle perle di vetro piccole è di 0,4-0,6 mm.</li>
		<li>Prelevare 0,5 g di tessuto tritato finemente, aggiungere le perle di vetro in una provetta da centrifuga da 2 mL contenente il tessuto come descritto sopra. Invertire 10x-15x per mescolare.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere 40 μL di proteinasi K (20 mg/mL) alle provette. Mettere a temperatura ambiente per 15 minuti, durante questo periodo, capovolgere e mescolare 10 volte ogni 3 minuti. NOTA: Se il tessuto non è completamente digerito, la quantità di proteinasi K può essere opportunamente aumentata fino a quando la soluzione non diventa limpida.</li>
	<li>Aggiungere 200 μL di tampone di legame alle provette da centrifuga, vorticare immediatamente e mescolare per 4 minuti (frequenza di miscelazione dell'oscillazione: 3000 giri/min). NOTA: In questa fase, l'intensità e il tempo di agitazione devono essere rigorosamente controllati per garantire un'intensità e un tempo di miscelazione sufficienti.</li>
	<li>Mettere le provette da centrifuga a bagnomaria a 70 °C per 10 minuti e la soluzione diventa limpida.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di isopropanolo alle provette da centrifuga, vorticare e mescolare per 15 s, in questo momento potrebbe apparire una precipitazione flocculante. NOTA: È molto importante mescolare bene con la forza appropriata nelle fasi operative di cui sopra, ma l'agitazione vigorosa dovrebbe essere evitata per prevenire il taglio del DNA.</li>
	<li>Mettere la soluzione ottenuta nella fase precedente insieme al precipitato flocculante nella colonna di adsorbimento (la colonna di adsorbimento è posta nella provetta di raccolta). La lunghezza della colonna di adsorbimento è di 3,0 cm, il diametro è di 1,0 cm e la matrice di adsorbimento è una membrana a matrice di silicio.</li>
	<li>Centrifugare a 8.000 x g per 30 s, scartare il liquido di scarto nella provetta di raccolta e reinserire la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di tampone per la rimozione dell'inibitore alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.</li>
	<li>Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta. NOTA: Aggiungere la quantità specificata di etanolo assoluto al flacone tampone di lavaggio prima del primo utilizzo.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio alla colonna di adsorbimento. Centrifugare a 13.400 x g per 30 s ed eliminare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.</li>
	<li>Rimettere la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta vuota. Centrifugare a 14.500 x g per 2 minuti e rimuovere il più possibile il tampone di lavaggio, per evitare che l'etanolo residuo nel tampone di lavaggio inibisca le reazioni a valle.</li>
	<li>Estrarre la colonna di adsorbimento e inserirla in una provetta da centrifuga pulita. Aggiungere 100 μL di tampone di eluizione alla parte centrale della membrana di adsorbimento.</li>
	<li>Posizionare la colonna di adsorbimento a temperatura ambiente per 3-5 minuti e centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto.</li>
	<li>Aggiungere nuovamente la soluzione ottenuta nel passaggio precedente alla colonna di adsorbimento centrifugo. Posizionare la colonna di adsorbimento centrifugo a temperatura ambiente per 2 minuti e centrifugare a 13.400 x g per 1 minuto. NOTA: Il tampone di eluizione deve essere preriscaldato a bagnomaria a 70 °C per circa 10 minuti. Il volume di eluizione non deve essere inferiore a 50 μL; in caso contrario, la resa del DNA sarà ridotta.</li>
	<li>Conservare il DNA di diatomee estratto a 2-8 °C per un uso futuro. Se la soluzione di DNA deve essere conservata per lungo tempo, conservarla a -20 °C.</li>
</ol>3. Test PCR
NOTA: Poiché il contenuto di diatomee nei campioni forensi è spesso basso, gli estratti di campioni di tessuto dei corpi annegati possono anche contenere vari gradi di tessuto e organi (come i polmoni in questo esperimento) con il proprio DNA. Pertanto, il rilevamento diretto del DNA totale negli estratti di DNA non riflette la situazione dell'estrazione del DNA delle diatomee. In questo esperimento, sono stati selezionati primer specifici per le diatomee e sono stati utilizzati prodotti PCR per valutare l'estrazione del DNA delle diatomee nell'estratto. I prodotti possono essere osservati e analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio e possono anche essere analizzati mediante curva di fusione PCR quantitativa fluorescente in tempo reale, che ha una maggiore sensibilità.
<ol><li>Aggiungere 2 μL di DNA estratto da campioni d'acqua e tessuti come stampo. Scegliere uno dei due metodi seguenti per l'ispezione.</li>
	<li>Test PCR convenzionale<ol><li>Utilizzare primer22 in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S. Per i dettagli, vedere la Tabella 1.</li>
		<li>Stabilire il sistema di reazione PCR e le condizioni di amplificazione in base alle caratteristiche dei primer. Per i dettagli, vedere la tabella 2.</li>
		<li>Eseguire i prodotti di amplificazione PCR su gel di agarosio al 2%. Osservare e analizzare l'imaging con un gel imager.</li>
	</ol></li>
	<li>Test PCR quantitativo fluorescente<ol><li>Utilizzare i primer di cui sopra in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S per preparare un sistema di reazione di PCR quantitativa fluorescente in tempo reale. Per i dettagli, vedere la tabella 3.</li>
		<li>Eseguire l'amplificazione PCR e analizzare la curva di amplificazione ottenuta e i valori di Ct. Allo stesso tempo, impostare un programma, fondere gradualmente i doppi filamenti dei prodotti amplificati in singoli filamenti attraverso la tecnologia della curva di fusione PCR quantitativa fluorescente, quindi analizzare le curve di fusione ottenute.</li>
	</ol></li>
</ol>

Estrazione economica del DNA di diatomee utilizzando un kit modificato

<ol><li>Liu, C., Cong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+prospect+of+diagnosis+of+drowning+deaths+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Fa+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).</li>
<li>Frisoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forensic+diagnosis+of+freshwater+or+saltwater+drowning+using+the+marker+aquaporin+5%3A+An+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study.</a> Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458(2022).</li>
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<li>Pfister, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terrestrial+diatoms+as+tracers+in+catchment+hydrology%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Water%22%5BJournal%5D)">Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review.</a> WIREs Water. 4, 1241(2017).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+automated+diatom+detection+method+based+on+YOLOv5+framework+and+its+preliminary+study+for+taxonomy+recognition+in+the+forensic+diatom+test%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test.</a> Front Microbiol. 13, 963059(2022).</li>
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<li>Kihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+water+injection+into+lungs+using+an+animal+model%3A+Verification+of+the+diatom+concentration+test+to+diagnose+drowning%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning.</a> Forensic Sci Int. 327, 110983(2021).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+false-positive+results+of+diatom+test+in+the+diagnosis+of+drowning-would+not+be+an+impediment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment.</a> Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).</li>
<li>Manoylov, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+identification+of+algae+%28morphological+and+molecular%29%3A+species+concepts%2C+methodologies%2C+and+their+implications+for+ecological+bioassessment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phycol%22%5BJournal%5D)">Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment.</a> J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).</li>
<li>Uchiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+molecular+approach+to+help+conclude+drowning+as+a+cause+of+death%3A+simultaneous+detection+of+eight+bacterioplankton+species+using+real-time+PCR+assays+with+TaqMan+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes.</a> Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).</li>
<li>Kakizaki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+diverse+aquatic+microbes+in+blood+and+organs+of+drowning+victims%3A+first+metagenomic+approach+using+high-throughput+454-pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing.</a> Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).</li>
<li>Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Progress+of+High-Throughput+Sequencing+Technology+in+Forensic+Diatom+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Fa+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).</li>
<li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+multiplex+PCR+system+for+drowning+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis.</a> Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Yarimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+absolute+quantification+method+for+ribosomal+RNA+gene+copy+numbers+per+eukaryotic+single+cell+by+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae%22%5BJournal%5D)">Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR.</a> Harmful Algae. 103, 102008(2021).</li>
<li>Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diatom+shell+incorporated+PHBV%2FPCL-pullulan+co-electrospun+scaffold+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).</li>
<li>Malviya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+global+diatom+distribution+and+diversity+in+the+world%27s+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).</li>
<li>Brunner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+studies+of+silica+biomineralization%3A+towards+an+understanding+of+silica+processing+by+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).</li>
<li>Annunziata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+method+for+intact+nuclei+isolation+from+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms.</a> Sci Rep. 11 (1), 1681(2021).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+value+of+quantitative+assessment+of+diatom+test+for+drowning%3A+An+analysis+of+128+water-related+death+cases+using+microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy.</a> J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le cellule di diatomee sono protette da pareti cellulari silicee dure17 e questa struttura deve essere distrutta per estrarre il DNA delle diatomee. I kit ordinari non distruggono facilmente il guscio siliceo delle diatomee; quindi è difficile estrarre con successo il DNA21 delle diatomee. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit di estrazione del DNA sanguigno più comunemente usato, aggiungendo perle di vetro di diversi diametri e diversi rapporti di massa nel processo d...

Nella pratica forense, determinare se un cadavere trovato in acqua annegava o è stato gettato in acqua dopo la morte è essenziale per la corretta risoluzione del caso1. È anche una delle questioni difficili che devono essere risolte con urgenza nella pratica forense2. Le diatomee sono abbondanti nell'ambiente naturale (soprattutto nell'acqua)3,4. Nel processo di annegamento, a causa dell'ipossia e della risposta allo stress, le persone avranno intensi movimenti respiratori e inaleranno una grande quantità di liquido di annegamento. Pertanto, le diatomee nell'acqua entrano nel polmone con il liquido di annegamento e alcune diatomee possono entrare nella circolazione sanguigna attraverso la barriera alveolare-capillare e diffondersi agli organi interni con il flusso sanguigno 5,6. Il rilevamento di diatomee nei tessuti interni e negli organi come il polmone, il fegato e il midollo osseo è una forte evidenza di annegamento prima della morte 7,8. Attualmente, l'analisi forense delle diatomee si basa principalmente su metodi di analisi morfologici. Dopo una serie di pre-digestioni del tessuto, vengono effettuate al microscopio le stime morfologiche qualitative e quantitative delle diatomee non digerite. Durante questo periodo, è necessario utilizzare reagenti pericolosi e dannosi per l'ambiente come l'acido nitrico. Questo processo richiede molto tempo e richiede ai ricercatori una solida competenza tassonomica e una vasta esperienza. Tutto ciò comporta alcune sfide per il personale forense9. La tecnologia di test del DNA delle diatomee è una nuova tecnologia per il test delle diatomee sviluppata negli ultimi anni 10,11,12. Questa tecnologia realizza l'identificazione delle specie delle diatomee analizzando la composizione specifica della sequenza di DNA delle diatomee13,14. La tecnologia PCR e la tecnologia di sequenziamento sono metodi tecnici comunemente usati, ma la loro base è l'estrazione di successo del DNA dalle diatomee. Tuttavia, le diatomee hanno una struttura speciale diversa da quella di altri organismi, rendendo diverse anche le loro tecniche di estrazione del DNA.
La parete cellulare della diatomea ha un alto grado di silicizzazione e il suo componente principale è il biossido di silicio 15,16,17. La parete cellulare silicea è molto dura e deve essere distrutta prima di estrarre il DNA. I normali kit di estrazione del DNA sono spesso difficili da utilizzare direttamente per l'estrazione del DNA delle diatomee perché non possono distruggere il guscio siliceo delle diatomee18. Pertanto, la distruzione del guscio siliceo delle diatomee è uno dei principali problemi tecnici da risolvere nell'estrazione del DNA delle diatomee.
Allo stesso tempo, poiché il numero di diatomee contenute nei campioni di ricerca forense, che si tratti di campioni d'acqua o di organi e tessuti di corpi annegati, è spesso limitato, è necessario arricchire le diatomee. L'essenza dell'arricchimento è la separazione delle sostanze. Mentre si cerca di raccogliere le diatomee, ridurre al minimo il contenuto di altri componenti materiali (componenti interferenti). Nel lavoro forense, i laboratori utilizzano spesso metodi di arricchimento della centrifugazione o della filtrazione a membrana per separare le cellule delle diatomee19. Tuttavia, poiché le apparecchiature di pompaggio del vuoto non sono ampiamente utilizzate, il metodo di arricchimento della membrana non viene spesso utilizzato nei normali laboratori forensi primari. Quindi, il metodo di centrifugazione è ancora comunemente l'arricchimento di diatomee nei laboratori forensi20.
L'estrazione del DNA dalle diatomee è attualmente utilizzata principalmente nella pratica forense e ci sono limitazioni significative alla sua applicazione. Attualmente, ci sono pochi kit di estrazione del DNA di diatomee utilizzati nella scienza forense sul mercato e sono generalmente costosi21. Questo articolo fornisce un metodo di estrazione del DNA delle diatomee migliorato, rendendo l'estrazione del DNA delle diatomee semplice, conveniente ed economica. Ciò aumenta l'applicazione dei successivi test di biologia molecolare delle diatomee e può risolvere meglio i problemi legati all'annegamento in medicina legale attraverso il test delle diatomee. Questo metodo rompe le pareti cellulari silicee delle diatomee aggiungendo perle di vetro e impostando un tempo appropriato per il vortice. In questo modo, la proteinasi K e la soluzione di legame lisano rapidamente le cellule e inattivano vari enzimi nelle cellule. Il DNA genomico viene assorbito nella membrana della matrice nella colonna di adsorbimento e infine eluito dal tampone di eluizione. Un kit di estrazione genica del sangue intero così migliorato migliora l'effetto di estrazione del DNA delle diatomee del kit di sangue nei materiali di esame forense, riduce il costo dell'estrazione del DNA delle diatomee nella pratica forense e può essere applicato meglio alla ricerca forense di base.

<table><tbody><tr><td>Tampone legante</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>cellule a lisi rapida</td></tr><tr><td>ChemoHS qPCR Mix</td><td>Monad</td><td>00007547-120506</td><td>qPCR Mix</td></tr><tr><td>D2000 Scala del DNA</td><td>Real-Times(Beijing) Biotechnology</td><td>RTM415</td><td>Misura la posizione delle bande elettroforetiche</td></tr><tr><td>D512</td><td>Taihe Biotechnology</td><td>TW21109196</td><td>primer per parole</td></tr><tr><td>D978</td><td>Taihe Biotecnologia</td><td>TW21109197</td><td>primer inverso</td></tr><tr><td>Tampone di eluizione</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Un tampone di eluizione a basso contenuto di sale lava via il DNA</td></tr><tr><td>Perla di vetro</td><td>Yingxu Chemical Machinery (Shanghai)&nbsp;</td><td>70181000</td><td>Perle di vetro speciali per la dispersione e la macinazione</td></tr><tr><td>Colonna di adsorbimento per importazione</td><td>BioTeke</td><td>B2008006022</td><td>Colonna di adsorbimento con membrana in matrice di silice</td></tr><tr><td>Tampone per la rimozione degli inibitori</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Rimozione degli inibitori nell'estrazione del DNA</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Precipitare o isolare il DNA</td></tr><tr><td>MIX-30S Mini Mixer</td><td>Miulab</td><td>MUC881206</td><td>azione oscillatoria</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Inattivazione di nucleasi intracellulari e altre proteine</td></tr><tr><td>Rotor-Gene Q 5plex HRM</td><td>Qiagen</td><td>R1116175</td><td>quantificazione della fluorescenza in tempo reale PCR</td></tr><tr><td>Speed Micro-centrifuga</td><td>Scilogex</td><td>centrifuga 9013001121</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 3500R Gel Imager</td><td>Tanon</td><td>16T5553R-455</td><td>imaging su gel</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>PCR Mix</td></tr><tr><td>Thermo Cycler</td><td>Zhuhai Hema</td><td>VRB020A</td><td>normale</td></tr><tr><td>tampone di lavaggio</td><td>PCR BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Rimuovere le impurità come i metaboliti cellulari</td></tr></tbody></table>

estrazione del dna di diatomee da campioni d'acqua e tessuti

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Il test delle diatomee è un mezzo ausiliario essenziale nella pratica forense per determinare se il cadavere è annegato in acqua e per dedurre il luogo dell'annegamento. Il test delle diatomee è anche un importante contenuto di ricerca nel campo dell'ambiente e del plancton. La tecnologia di analisi della biologia molecolare delle diatomee, che si concentra sul DNA delle diatomee come oggetto di ricerca primario, è un nuovo metodo di test delle diatomee. L'estrazione del DNA delle diatomee è alla base dei test molecolari delle diatomee. Attualmente, i kit comunemente usati per l'estrazione del DNA delle diatomee sono costosi, il che aumenta il costo della ricerca correlata. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit generale di estrazione rapida del DNA genomico del sangue intero e ha ottenuto un effetto soddisfacente di estrazione del DNA delle diatomee, fornendo così una soluzione alternativa economica e conveniente per l'estrazione del DNA basata su perle di vetro per la ricerca correlata. Il DNA di diatomee estratto utilizzando questo protocollo potrebbe soddisfare molte applicazioni a valle, come la PCR e il sequenziamento.

Poiché la soluzione di DNA estratta con il metodo di estrazione del DNA attualmente utilizzato contiene tutti i componenti del DNA provenienti da diverse fonti nel campione, il DNA ottenuto con questo protocollo non ha fatto eccezione. Quindi, la soluzione del DNA non era solo una soluzione del DNA genomico delle diatomee. I primer in grado di amplificare in modo specifico i frammenti di rDNA della diatomea 18S sono stati selezionati consultando la letteratura 22,23,24.<sup class="xref"...

Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione del DNA delle diatomee utilizzando un kit di estrazione del DNA comune modificato.

Estrazione del DNA di diatomee da campioni d'acqua e tessuti

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

La nostra ricerca si concentra principalmente sul tema dell'annegamento. Volevamo rispondere alla domanda se il corpo trovato in acqua fosse morto per annegamento, così come rispondere a un'altra domanda su dove la persona fosse caduta in acqua. Ciò significa conoscere il luogo dell'annegamento.Rispetto ad altre tecnologie, forniamo un protocollo di estrazione del DNA di diatomee semplice, conveniente ed economico che possiamo utilizzare meglio nella ricerca forense, in particolare nella pratica forense di base. Il nostro laboratorio si concentrerà ulteriormente sui problemi legati all'annegamento in base al modello nell'acqua, come il motivo della morte, l'intervallo post mortem e così via. Inoltre, portiamo avanti la ricerca attraverso l'entomologia forense e alcuni fenomeni speciali nella medicina legale tropicale.

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Medicina

Descriviamo un metodo per l'estrazione di alto peso molecolare del DNA genomico da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 micron Sterivex, seguita da centrifugazione in gradiente di cesio cloruro di densità per la purificazione.

Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente

Una metodologia per isolare ad alto peso molecolare del DNA genomico e di alta qualità da parte della comunità microbica del suolo è descritta.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

Questo video dimostra il protocollo per l'estrazione del DNA da fissati in formalina materiale in paraffina. Questa è una di più giorni procedura di sezioni di tessuto in cui sono deparaffinate con xilene, reidratato con etanolo e trattati con proteinasi K per purificare e isolare il DNA per le successive analisi del gene-specifici o genoma.

Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

Forniamo un protocollo migliore per l'estrazione del DNA alto peso molecolare da stuoie microbica hypersaline. Cellule microbiche sono separate dalla matrice tappetino prima dell'estrazione del DNA e la purificazione. Questo aumenta la concentrazione, la qualità e le dimensioni del DNA. Il protocollo può essere utilizzato per altri campioni refrattari.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare da Mats microbica

Viene fornito un protocollo per quantificare i geni rRNA 16S batterici e i trascritti dai sedimenti costieri tramite PCR in tempo reale. La metodologia comprende la co-estrazione di DNA e RNA; preparazione di RNA privo di DNA; e quantificazione del gene e della trascrizione dell'rRNA 16S tramite RT-q-PCR, inclusa la costruzione di curve standard.

DNA-RNA simultanea Estrazione da sedimenti costieri e la quantificazione dei geni 16S rRNA e trascrizioni da Real-time PCR

La criosfera offre l'accesso a organismi conservati che persiste in condizioni ambientali del passato. Un protocollo è presentato per raccogliere e decontaminare nuclei permafrost di suoli e ghiaccio. L'assenza di colonie esogeni e del DNA suggeriscono che i microrganismi rilevate rappresentano il materiale, piuttosto che la contaminazione da perforazione o di trasformazione.

Rimozione di materiali esogene dalla parte esterna della congelati core per Indagare sulla antica comunità biologiche ospitava Dentro

Descriviamo un protocollo per la filtrazione di campioni d'acqua con una cartuccia filtrante e l'estrazione del DNA ambientale (eDNA) senza dover aprire l'alloggiamento per rimuovere il filtro. Questo protocollo è stato sviluppato per il metabarcoding dell'eDNA dei pesci, ma è applicabile anche all'eDNA di altri organismi.

L&#39;utilizzo di una cartuccia filtrante per filtrazione di acqua campioni ed estrazione di DNA ambientale

Analisi del contenuto intestinale più comune di macroinvertebrati sono visive. Che richiedono intensa conoscenza diversità morfologica degli organismi di preda, essi perdere morbido corposo preda e, grazie alla forte comminuzione della preda, sono quasi impossibile per alcuni organismi, tra cui anfipodi. Forniamo dettagliati, romanzo approcci genetici per macroinvertebrati preda identificazione nella dieta di anfipodi.

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Il protocollo rileva i geni chiave del ciclo del metano nelle zone umide costiere del Texas meridionale e visualizza la loro distribuzione spaziale per migliorare la comprensione della regolazione del metano e dei suoi impatti ambientali in questi ecosistemi dinamici.

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Forme affidabili e accurate di analisi del DNA dispiegabile sul campo sono fondamentali per molti settori. Questo articolo offre due metodi per l'analisi microbica ambientale sul campo: 1) l'isolamento del DNA microbico da campioni ambientali utilizzando un kit di estrazione biologica sul campo, e 2) l'analisi del DNA tramite l'unità qPCR di campo.

Analisi del DNA microbico sul campo utilizzando un kit di estrazione biologica sul campo e un'unità qPCR sul campo

Impara un protocollo di estrazione del DNA di diatomee modificato per ricerche forensi sui casi di annegamento. Questo metodo semplice ed economico migliora le pratiche investigative forensi.

Estrazione del DNA di diatomee da campioni d'acqua e tessuti

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