Name: Biobanking di biopsie umane acquose e vetrose per analisi molecolari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Scopri il biobanking di biopsie liquide oculari umane per analisi molecolari. Questo protocollo standardizza la raccolta di umore acqueo e vitreo durante chirurgia intraoculare, abilitando studi proteomici, glicomici e metabolomici.

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VBM è supportato da sovvenzioni NIH (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 e P30EY026877), dallo Stanford Center for Optic Disc Drusen e dalla ricerca per prevenire la cecità, New York, USA. JW e DR sono supportati dalla VitreoRetinal Surgery Foundation, USA. DR è supportato dalla DARE Fellowship, sponsorizzata dalla Lundbeck Foundation.

Il protocollo segue le linee guida dell'Institutional Review Board for Human Subjects Research (IRB) della Stanford University, USA.
ATTENZIONE: Questo protocollo è una guida per chirurghi oftalmici qualificati. Nel contesto delle neoplasie intraoculari, non può essere esclusa la semina di tumori extraoculari nel contesto dell'umore acqueo o delle biopsie liquide vitreali. Tuttavia, il rischio di estensione extraoculare e coinvolgimento orbitale è estremamente basso nella biopsia tumorale coroideale transvitreale, che viene eseguita in modo sicuro e con un'attenta considerazione del sito di ingresso6. Questo protocollo non copre e può essere controindicato nei casi di retinoblastoma o tumori ad alto rischio metastatico.
1. Prima della raccolta del campione
<ol><li>Approvazione del comitato di revisione istituzionale
	<ol><li>Ottenere le approvazioni dall'IRB locale prima dell'inizio dell'esperimento ed eseguire la raccolta dei campioni di conseguenza.</li>
	</ol></li>
	<li>Popolazione dello studio
	<ol><li>Criteri di inclusione: Includere tutti i pazienti (di età compresa tra 0 e 99 anni) sottoposti a chirurgia intraoculare presso l'istituto che fornirà una quantità adeguata di umore acqueo o liquido vitreo superiore a quella richiesta per gli esami diagnostici appropriati per valutare le condizioni del paziente e i pazienti che desiderano partecipare.</li>
		<li>Criteri di esclusione: escludere i pazienti che rifiutano di partecipare e le donne in gravidanza.</li>
	</ol></li>
</ol>
<ol start="3"><li>Consenso informato
	<ol><li>Ottenere il consenso informato scritto da ciascun paziente seguendo il protocollo approvato dall'IRB.</li>
		<li>Archiviare il consenso firmato in un database protetto.</li>
		<li>Formare il personale coinvolto (chirurghi, tecnici di laboratorio, personale della sala operatoria (OR), scienziati) come descritto in questo protocollo.</li>
		<li>Impostare un database di gestione di esempio. Utilizzare REDCap come database di esempio basato sul Web conforme HIPAA progettato per supportare l'acquisizione dei dati per studi di ricerca5. Nota : in questo articolo viene descritto l'utilizzo dell'interfaccia basata sul Web fornita da REDCap per progettare moduli, definire campi, impostare la logica di diramazione e applicare regole di convalida dei dati senza la necessità di conoscenze approfondite di programmazione. In alternativa, altri software, come le applicazioni di fogli di calcolo standard, possono anche essere adatti.</li>
		<li>Garantire la disponibilità di una scatola di raffreddamento, ghiaccio secco, siringa per la raccolta dei campioni e crioviali (vedere la tabella dei materiali). Utilizzare crioviali con codici a barre incisi in modo permanente sulle fiale. Ciò elimina la necessità di aggiungere identificatori del paziente sulla fiala e la possibilità di perdere un'etichetta in condizioni di congelamento.</li>
		<li>Informare il chirurgo sul caso e il tecnico di laboratorio che aiuterà con la raccolta del campione in sala operatoria almeno 24 ore prima dell'intervento chirurgico programmato.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Acquisizione di campioni chirurgici in sala operatoria
<ol><li>Interfaccia laboratorio sala operatoria mobile (MORLI)
	<ol><li>Stabilire un MORLI in sala operatoria. MORLI include una superficie piana del banco da laboratorio, un computer/tablet con uno scanner di codici a barre con accesso al database REDCap e una scatola di raffreddamento con ghiaccio secco (vedi Tabella dei materiali). ATTENZIONE: Il ghiaccio secco è estremamente freddo. Indossare sempre i guanti quando si maneggia ghiaccio secco ed evitare di toccarlo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della raccolta dei campioni in sala operatoria
	<ol><li>Accedere al computer/tablet su MORLI e aprire il database REDCap.</li>
		<li>Verificare che il consenso informato sia stato firmato dal paziente e confermarlo con il chirurgo. Ricordategli che è necessario un campione non diluito.</li>
		<li>Indossare guanti. Ottenere il numero appropriato di crioviali con codice a barre (0,5 ml per l'umore acqueo e 1,9 ml per i campioni vitreali) e posizionarli dove sono facilmente accessibili.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccolta di biopsie liquide dell'umore acqueo ATTENZIONE: Considerare i campioni di tessuto umano come materiale biopericoloso, che richiede precauzioni appropriate come un camice da laboratorio e guanti per garantire la sicurezza del personale coinvolto. NOTA: i seguenti passaggi devono essere eseguiti solo da un chirurgo oftalmico qualificato. Le biopsie liquide dell'umore acqueo possono essere ottenute, ad esempio, all'inizio della chirurgia della cataratta, uno degli interventi chirurgici più frequenti in tutto il mondo. NOTA: Un campo sterile viene mantenuto secondo i protocolli standard di cura in sala operatoria. Le procedure preoperatorie relative all'anestesia del paziente seguono le fasi standard di cura per gli interventi chirurgici in camera anteriore e vitreoretinica.<ol><li>Preparare e drappeggiare l'occhio per l'intervento chirurgico e posizionare uno speculum sterile per una visualizzazione ottimale del campo sterile.</li>
		<li>Utilizzare un microscopio operatorio per eseguire una paracentesi della camera anteriore perpendicolare al limbus utilizzando un ago da 30-32 G collegato a una siringa da 1 ml. Utilizzare una punta di cotone o una piccola pinza per stabilizzare l'occhio durante questa procedura. NOTA: Assicurarsi che l'ago e la siringa siano bloccati e che non vi sia pressione nella siringa (muovendo lo stantuffo). Assicurarsi che la punta dell'ago rimanga sopra l'iride periferica nella camera medio-anteriore per evitare danni alle strutture intraoculari. Nel caso della chirurgia della cataratta, l'ago per ottenere la biopsia liquida può anche entrare nella camera anteriore attraverso una delle paracentesi che vengono create per l'intervento di cataratta.</li>
		<li>Sotto visualizzazione diretta tramite il microscopio, aspirare manualmente circa 100 μL di umore acqueo non diluito utilizzando una siringa da 1 ml. Spostare lo stantuffo della siringa con la mano non dominante del chirurgo o con un assistente addestrato senza muovere l'ago. NOTA: Ottenere meno di 100 μL di umore acqueo nel caso in cui la camera anteriore dovesse collassare.</li>
		<li>Rimuovere con cautela l'ago dalla camera anteriore. NOTA: In un occhio fachico, tenere l'ago sopra l'iride per evitare di toccare la lente. La pressione positiva sul globo può aumentare il reflusso. Rilasciare la punta di cotone prima che l'ago venga estratto aiuta a ridurre il reflusso.</li>
		<li>Tirare indietro lo stantuffo e vedere come si muovono l'aria e il fluido raccolto.</li>
		<li>Iniettare la siringa nel crioviale. L'aria in eccesso libera lo spazio morto della siringa.</li>
		<li>Utilizzare il codice a barre sul crioviale per eseguire la scansione del campione nel modulo REDCap su un computer in sala operatoria (maggiori dettagli nei passaggi da 3.1 a 3.9).</li>
		<li>Trasferire immediatamente il crioviale su ghiaccio secco nella scatola di raffreddamento.</li>
		<li>Continuare con l'intervento chirurgico programmato per il paziente (ad esempio, un intervento di cataratta come descritto in precedenza7 ).</li>
	</ol></li>
	<li>Raccolta di biopsie liquide vetrose NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti solo da un chirurgo vitreoretinico qualificato. Le biopsie liquide vitreali possono essere ottenute all'inizio di una vitrectomia8. Poiché l'obiettivo è quello di raccogliere un campione vitreo non diluito, il cutter per vitrectomia non verrà innescato con fluido1. NOTA: Un campo sterile viene mantenuto secondo i protocolli standard di cura in sala operatoria. Le procedure preoperatorie relative all'anestesia del paziente seguono le fasi standard di cura per gli interventi chirurgici in camera anteriore e vitreoretinica.<ol><li>Preparare e drappeggiare l'occhio per l'intervento chirurgico e posizionare uno speculum sterile per una visualizzazione ottimale del campo sterile.</li>
		<li>Creare sclerotomie con una cannula trocar da 23, 25 o 27 G, seguendo le procedure standard di cura. Inserire la cannula per infusione e confermare visivamente il posizionamento appropriato nella cavità vitreale.</li>
		<li>Nella cavità vitreale, attivare la fresa vitreale senza infusione per raccogliere un campione vitreo non diluito. Aspirare manualmente da 0,5 a 1,0 ml di vitreo utilizzando una siringa collegata alla cannula di estrusione vitreale1.</li>
		<li>Rimuovere la fresa vitrea dall'occhio e accendere l'infusione di liquido.</li>
		<li>Aspirare il fluido rimanente all'interno del tubo nella siringa.</li>
		<li>Scollegare la siringa.</li>
		<li>Elaborare il campione come descritto per un campione di umore acqueo nella sezione 2.3 (dal punto 2.3.5 al punto 2.3.9).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Elaborazione dei campioni in sala operatoria e aggiunta di campioni al database
<ol><li>Chiedere al tecnico di laboratorio di prendere il crioviale preparato (0,5 ml per l'umore acqueo e 1,9 ml per i campioni vitreali) e camminare dal chirurgo senza toccare alcuna attrezzatura sterile OR.</li>
	<li>Chiedi al tecnico di laboratorio di aprire il crioviale.</li>
	<li>Scaricare la siringa direttamente nel crioviale.</li>
	<li>Chiedi al tecnico di laboratorio di ricapitolare immediatamente il crioviale.</li>
	<li>Chiedere al tecnico di laboratorio di tornare al MORLI e trasferire immediatamente il campione su ghiaccio secco nella scatola di raffreddamento (-80 °C). Chiudere il coperchio della scatola.</li>
	<li>Aprire un nuovo modulo di raccolta di campioni. Inserire le seguenti informazioni nel rispettivo campo del modulo: caso chirurgo, luogo e data di raccolta, numero identificativo del paziente e altre informazioni di base, come età, sesso, occhio destro o sinistro, diagnosi, storia preoperatoria (testo libero), informazioni sulla procedura (ad esempio, tipo di intervento chirurgico), nonché informazioni sui campioni, come il numero di campioni raccolti, tipo di campioni (umore acqueo, vitreo) e altri dettagli come i volumi. Aggiungere il codice a barre del tubo utilizzando lo scanner di codici a barre.</li>
	<li>Fare clic su Invia / Avanti.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.7 se vengono raccolti altri campioni.</li>
	<li>Quando tutti i campioni sono protetti, fare clic su Salva e inviare nel modulo di raccolta dei campioni REDCap. Quindi disconnettersi dal database e dal computer / tablet.</li>
</ol>4. Trasferimento dei crioviali allo stoccaggio
<ol><li>Trasportare i campioni su ghiaccio secco nella scatola di raffreddamento dalla sala operatoria al laboratorio e posizionarli su un banco da laboratorio accanto a un computer di laboratorio.</li>
	<li>Accedere a REDCap sul computer di laboratorio utilizzando l'ID di accesso e la password.</li>
	<li>Indossare guanti. Prelevare uno dei campioni raccolti e scansionare il codice a barre del crioviale nel database (maggiori dettagli nella sezione 5). Riposizionare immediatamente il campione su ghiaccio secco.</li>
	<li>Procurarsi un secondo contenitore pieno di ghiaccio secco.</li>
	<li>Procurarsi una griglia per i crioviali dal congelatore a -80 °C. Mettilo nel secondo contenitore su ghiaccio secco. NOTA: sarà necessario un rack in formato 96 per i tubi di umore acqueo da 0,5 ml e un rack in formato 48 per i tubi vitrei da 1,9 ml.</li>
	<li>Scansione del codice a barre del rack nel database (maggiori dettagli nella sezione 5).</li>
	<li>Trasferire il campione nel rack.</li>
	<li>Aggiungere la posizione dei flaconcini nel rack al database (maggiori dettagli nella sezione 5).</li>
	<li>Fai clic su Salva e invia.</li>
	<li>Trasportare il rack con i flaconcini su ghiaccio secco in frigorifero per la conservazione a -80 °C. Aggiungere il rack in una posizione specifica nel frigorifero utilizzando un sistema di coordinate. Ciò consentirà in seguito di recuperare facilmente i campioni per l'analisi a valle.</li>
</ol>5. Modulo di conservazione del campione
<ol><li>Compilare un modulo di archiviazione per ogni campione raccolto durante la fase del modulo di iscrizione. Fare clic sul cerchio vuoto o sul "+" sotto Sample Storage per creare e aprire un nuovo modulo di archiviazione.</li>
	<li>Immettere la data di compilazione del modulo in Data di archiviazione record.</li>
	<li>Scansiona o digita il codice a barre del tubo sotto Codice a barre del tubo campione. Riposizionare immediatamente il campione su ghiaccio secco.</li>
	<li>Selezionare se un campione viene trasferito all'esterno o se il campione sta andando nella memoria interna del biorepository.</li>
	<li>Verifica che il consenso informato scritto sia stato ottenuto dal paziente e seleziona la casella sotto Verifica conformità del consenso e inserisci il tuo nome in Consenso verificato da.</li>
	<li>Selezionare una posizione libera e adatta per il crioviale nel rack. Trasferire il crioviale in questa posizione nel rack (ad esempio, posizione A1). Tenere il rack su ghiaccio asciutto.</li>
	<li>Nella fase di posizione, inserire le seguenti informazioni: la posizione del congelatore sotto Congelatore, il numero di scaffale in cui il campione verrà conservato sotto Scaffale, il codice a barre della scatola sotto Codice a barre della scatola, la posizione del tubo nella scatola per riga (Posizione tubo (Riga)) e colonna (Posizione tubo (colonna)). NOTA: Facoltativamente, è possibile inserire un'etichetta della scatola anche sotto Etichetta della scatola, che può facilitare la ricerca della scatola nel congelatore.</li>
	<li>Nella sezione Utilizzo immettere le seguenti informazioni: il nome del progetto per cui viene utilizzato l'esempio (Nome progetto), il volume campione in una delle seguenti categorie: pieno, parziale, quasi vuoto o vuoto (Volume campione) e note di archiviazione, se applicabili, in Note di archiviazione. NOTA: la data, l'ora e l'ultimo utente che ha effettuato l'accesso al modulo vengono compilati automaticamente per garantire una catena di custodia che può essere esaminata e verificata in base alle esigenze.</li>
	<li>Verificare che il modulo sia stato compilato facendo clic su Completa in Completa?.</li>
	<li>Fai clic su Salva ed esci dal modulo. Questo ti riporterà alla panoramica del paziente.</li>
	<li>Per ogni provetta raccolta, generare un altro modulo di raccolta dei campioni facendo clic sul "+" sotto Conservazione dei campioni. Quindi ripetere i passaggi da 5.1 a 5.10.</li>
	<li>Fare clic su Salva ed esci per completare il modulo e disconnettersi dal database e dal computer/tablet.</li>
	<li>Trasferire il portacampioni (su ghiaccio secco) in frigorifero nella posizione prestabilita.</li>
</ol>6. Prelievo di campioni chirurgici per analisi a valle
NOTA: I campioni vengono spesso archiviati per diversi anni prima di essere analizzati. I crioviali con codice a barre e il sistema di database REDCap ricercabile consentono di trovare e localizzare facilmente ogni campione per l'analisi a valle.
<ol><li>Identificare i campioni di interesse per l'esperimento utilizzando la funzione di ricerca del database. Ciò consentirà di trovare, ad esempio, tutti i campioni di umore acqueo di pazienti tra i 20 ei 40 anni con retinopatia diabetica.</li>
	<li>Ottenere la posizione dei crioviali di interesse (congelatore, scaffale/scaffale, rack di campioni, coordinate all'interno del rack). Annotarli, stamparli o averli disponibili su un computer portatile / tablet per facilitare il reperimento dei campioni nel congelatore.</li>
	<li>Contrassegnare gli esempi come utilizzati nel database.</li>
	<li>Fare clic su Salva ed esci per completare il modulo e disconnettersi da REDCap e dal computer/tablet.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I campioni chirurgici dei pazienti consentono la caratterizzazione molecolare diretta della malattia negli esseri umani viventi 2,3,4,14 e possono aiutare a superare i limiti dei modelli di malattia cellulare e animale che non ricapitolano completamente la malattia umana 15,16. L'analisi molecolare del tessuto umano potrebbe migliorare la selezione di nuovi bersagli farmacologici e potrebbe contribuire a un più alto tasso di successo delle sperimentazioni cliniche e dell'approvazione dei farmaci17. Inoltre, questo approccio offre il potenziale per la medicina personalizzata, poiché il tessuto ottenuto conserva l'impronta genomica, epigenomica, metabolomica, glicomica e proteomica unica di ogni individuo 2,18,19.
Una qualità del campione elevata e costante è fondamentale per tutte le applicazioni di analisi molecolare. Studi precedenti hanno dimostrato che il congelamento immediato dopo il prelievo del campione e l'evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento sono fondamentali per un'elevata qualità del campione 9,20. La conservazione a lungo termine per diversi anni a -70 °C non ha influito significativamente sull'integrità del profilo proteomico9. Un protocollo standardizzato è una base importante per ridurre i pregiudizi e migliorare la comparabilità dei dati scientifici, specialmente quando diverse persone (chirurghi, tecnici e altri) o diverse istituzioni sono coinvolte nel processo di campionamento. Oltre alla qualità del campione, l'annotazione dei campioni è un altro fattore importante che richiede la standardizzazione per consentire la correlazione dei risultati molecolari con i dati clinici. Il nostro protocollo si basa su tre principi essenziali per raggiungere questo obiettivo: 1) una procedura di campionamento standardizzata per l'umore acqueo e le biopsie liquide vitreali da parte di un chirurgo oftalmico, 2) l'elaborazione immediata e il congelamento istantaneo dei campioni in sala operatoria da parte del personale di laboratorio e 3) un'annotazione dei metadati di ciascun campione in un database basato sul web che consente ai ricercatori di trovare rapidamente campioni per esperimenti successivi.
Oltre ai campioni vitreali20, questo flusso di lavoro stabilisce anche la raccolta standardizzata di biopsie liquide dell'umore acqueo per l'analisi molecolare. L'umore acqueo è un fluido complesso altamente accessibile nella camera anteriore dell'occhio che non riflette solo le malattie oculari della parte anteriore ma anche del segmento posteriore dell'occhio, compresa la malattia della retina18,21. Oltre al fatto che un numero elevato di campioni di umore acqueo potrebbe essere raccolto, ad esempio, durante la chirurgia della cataratta, uno degli interventi chirurgici più frequentemente eseguiti in tutto il mondo, queste caratteristiche lo rendono una fonte interessante per biopsie liquide dall'occhio umano. L'annotazione standardizzata dei metadati di ciascun campione stabilita in questo flusso di lavoro potrebbe anche consentire la correlazione dei dati del proteoma con i dati prospettici di follow-up clinico. Ciò offre l'entusiasmante opportunità di identificare nuovi biomarcatori prognostici che possono aiutare a stimare la prognosi per i futuri pazienti.
Tuttavia, l'analisi molecolare di campioni chirurgici umani ha anche importanti limiti. Ad esempio, manipolazioni sperimentali complesse sono spesso possibili solo in modelli animali e cellulari. Una soluzione potrebbe essere quella di confrontare il profilo molecolare di modelli animali o cellulari con quello di malattie umane. Questa strategia può identificare biomarcatori proteici sovrapposti e bersagli terapeutici che possono essere convalidati in animali o modelli cellulari per identificare i candidati più promettenti che sono correlati con la malattia umana e che hanno probabilità di successo negli studi clinici 4,16.
In conclusione, il nostro flusso di lavoro stabilisce un'interfaccia pratica tra la sala operatoria e il laboratorio di ricerca che consente la raccolta, l'annotazione e la conservazione standardizzate e ad alta produttività di campioni chirurgici di alta qualità per l'analisi molecolare a valle, fornendo una base preziosa per la futura ricerca traslazionale.

La profilazione molecolare delle biopsie liquide dall'occhio umano può catturare fluidi arricchiti localmente contenenti molecole come DNA, RNA, proteine, glicani e metaboliti da tessuti oculari altamente specializzati. Le biopsie liquide dal vitreo nella camera posteriore dell'occhio umano si sono dimostrate una procedura generalmente sicura1. Permettono la caratterizzazione molecolare delle malattie oculari nell'uomo vivente e offrono il potenziale per identificare nuove strategie diagnostiche e terapeutiche 2,3,4. L'umore acqueo nella camera anteriore dell'occhio ha un'accessibilità chirurgica ancora più elevata e potrebbe essere ottenuto in gran numero, ad esempio, durante la chirurgia della cataratta, che è uno degli interventi chirurgici più frequentemente eseguiti. Tuttavia, nessun protocollo standardizzato per la raccolta, l'annotazione e la biobanca dell'umore acqueo umano e delle biopsie liquide vitreali per le analisi molecolari a valle, tra cui proteomica, metabolomica e glicomica, è disponibile fino ad ora.
Qui, abbiamo sviluppato un protocollo per la raccolta e la biobanca di biopsie liquide di alta qualità per analisi molecolari da pazienti sottoposti a chirurgia oculare. Una Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) consente a un ricercatore di congelare immediatamente i campioni raccolti in crioviali con codice a barre su ghiaccio secco a -80 °C in sala operatoria (OR). Questa procedura garantisce una qualità del campione elevata e costante per l'analisi molecolare a valle. Oltre all'eccellente qualità dei campioni, l'annotazione accurata dei campioni in una biobanca è fondamentale. Utilizzando un database REDCap (Research Electronic Data Capture) conforme al web HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act)5, il nostro flusso di lavoro consente l'archiviazione di metadati dettagliati per ciascun campione, tra cui età, sesso, malattia, stadio della malattia, tipo di campione e caratteristiche uniche dell'intervento chirurgico. Ciò consentirà un'accurata capacità di ricerca futura, ad esempio per campioni provenienti da una malattia specifica o da un particolare gruppo di pazienti. Inoltre, la posizione esatta di ciascun campione nel congelatore viene archiviata utilizzando un sistema a griglia cartesiana, che consente un recupero efficiente dei campioni per gli esperimenti a valle. Mostriamo esempi di analisi di DNA, proteine, glicani e metaboliti.
Il nostro flusso di lavoro rappresenta un collegamento pratico ed efficace tra la sala operatoria e il laboratorio di ricerca e fornisce una base preziosa per la ricerca traslazionale.

<table><tbody><tr><td>Provetta a triplo codice da 0,5 ml, formato 96, filettatura esterna</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td><td>68-0703-12</td><td>utilizzata per campioni di umor acqueo</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>di grado chirurgico, qualsiasi cosa disponibile in ospedale</td><td></td> <td>per biopsie di umor acqueo Provetta</td></tr> a <tr><td>tre codici da 1,9 ml, formato 48, filettatura esterna</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td><td>65-7643</td><td>utilizzata per campioni vitrei</td></tr><tr><td>Siringa da 3 mL</td><td>di grado chirurgico, qualunque cosa disponibile in ospedale</td><td></td> <td>- per biopsie vitreali Grado</td></tr><tr>chirurgico con<td>ago calibro 30-32</td><td>, qualsiasi cosa disponibile in ospedale</td> <td>-</td> <td>per biopsie di umore acqueo</td></tr><tr><td>Elettroforesi capillare accoppiata con spettrometria di massa trasformata di Fourier (CE-FTMS)</td><td>Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Giappone</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Sistema di vitrectomia Constellation con sistema di cannule trocar calibro 23, 25 o 27</td><td>Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX,</td> <td>USA-per</td> <td>biopsie vitreali</td></tr><tr><td>Scatola di raffreddamento</td><td>Scatola di polistirolo standard, qualunque cosa disponibile in laboratorio</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Ghiaccio secco</td><td>Qualunque cosa disponibile in laboratorio</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Kit scanner a gamma standard vivavoce con cavo USB schermato</td><td>Simbolo zebra</td><td>DS9208-SR4NNU21Z</td><td>Scanner di codici a barre</td></tr><tr><td>Array di anticorpi di glicosilazione umana L3&nbsp;</td><td>RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA</td><td>GAH-GCM-L3-Mac</td><td></td></tr> <tr><td>mini</td><td>Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA-</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>MetaboAnalyst software</td><td>Pang et al., 2021, PMID: 34019663</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Rack per provette da 0,5 ml, formato 96</td><td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td><td>66-51026</td><td>per campioni di umorismo acqueo</td></tr><tr><td>Rack per provette da 1,9 ml, formato</td> <td>48Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td><td>65-9451</td><td>per campioni vitrei</td></tr><tr><td>Database di campioni basato su browser REDCap REDCap</td><td>Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

biobanking di biopsie umane acquose e vetrose per analisi molecolari

Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses

Una sfida critica nella ricerca traslazionale è stabilire un'interfaccia praticabile ed efficiente tra la cura del paziente in sala operatoria (sala operatoria) e il laboratorio di ricerca. Qui, abbiamo sviluppato un protocollo per l'acquisizione di biopsie liquide di alta qualità per analisi molecolari dall'umore acqueo e dal vitreo da pazienti sottoposti a chirurgia oculare. In questo flusso di lavoro, un carrello Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) dotato di computer, scanner di codici a barre e strumenti di laboratorio, inclusa la conservazione a freddo a bordo, viene utilizzato per ottenere e archiviare campioni biologici umani. Un database basato sul web conforme alla privacy dei dati consente di annotare ogni campione nel corso della sua durata e un sistema di coordinate cartesiane consente di tracciare ogni campione con codice a barre in deposito, consentendo un recupero rapido e accurato dei campioni per le analisi a valle. La caratterizzazione molecolare di campioni di tessuto umano non serve solo come strumento diagnostico (ad esempio, per distinguere tra endoftalmite infettiva e altre infiammazioni intraoculari non infettive), ma rappresenta anche una componente importante della ricerca traslazionale, consentendo l'identificazione di nuovi bersagli farmacologici, lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici e terapie personalizzate.

I campioni di biopsia liquida raccolti possono essere sottoposti a una varietà di analisi molecolari, tra cui l'analisi di DNA, proteine, glicani e metaboliti. È stato dimostrato in precedenza che la conservazione a lungo termine per diversi anni a -70 °C non ha influenzato significativamente l'integrità del profilo proteomico9. Il database REDCap consente un recupero semplice e rapido dei campioni. Il database può essere cercato per campioni da un gruppo specifico di pazienti, ad esempio, tutti i pazienti con retinopatia diabetica. Il database fornirà quindi i codici a barre dei tubi e le posizioni in deposito. Fino ad ora, abbiamo raccolto e archiviato più di 1.000 biopsie liquide. Il database ci ha permesso di trovare rapidamente i campioni per le analisi a valle 3,10 e ci ha aiutato a eseguire i seguenti esperimenti.
Una donna di 17 anni presentava un'infiammazione della retina e del nervo ottico. Era immunocompromessa e c'era una preoccupazione per l'infezione. L'umore acqueo è stato raccolto dal suo occhio destro e inviato per l'analisi del DNA PCR. I risultati sono stati positivi per il citomegalovirus e negativi per il virus dell'herpes simplex e la toxoplasmosi. Questi risultati illustrano che le biopsie liquide dell'umore acqueo possono aiutare a distinguere le forme infettive da quelle non infettive di infiammazione intraoculare, che è fondamentale per selezionare la terapia appropriata.
La cromatografia liquida-spettrometria di massa consente un'analisi imparziale e semi-quantitativa del proteoma. In una biopsia liquida dal vitreo di un paziente sottoposto a vitrectomia, la tecnica è stata in grado di identificare 484 proteine uniche, tra cui Complemento C3 (C3), Ottica (OPTC) e Collagene di Tipo II Alfa 1 (COL2A1) (Figura 1A).
Sono state analizzate tre biopsie liquide vetrose utilizzando un ELISA multiplex di glicoproteomica (vedi Tabella dei materiali)11. Il test ha rilevato i profili di glicosilazione di 500 proteine umane, catturando una varietà di percorsi biologici, come il metabolismo, la risposta immunitaria, l'adesione cellulare e l'organizzazione dell'actina (Figura 1B).
Uno screening metabolomico utilizzando elettroforesi capillare accoppiato con spettrometria di massa trasformata di Fourier12 (vedi Tabella dei materiali) ha identificato 292 diversi metaboliti in tre campioni di biopsia liquida dell'umore acqueo. Un'analisi dei percorsi (vedi Tabella dei materiali)13 ha identificato una varietà di vie metaboliche, tra cui il metabolismo degli aminoacidi, il ciclo dell'urea e la sintesi della carnitina (Figura 1C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65804/65804fig01.jpg"> Figura 1: Risultati rappresentativi . (A) L'analisi proteomica dell'umore vitreo umano mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) ha identificato 484 proteine uniche in una singola biopsia liquida. I livelli di proteine sono mostrati e classificati in base alla conta spettrale. Le proteine rappresentative sono evidenziate in blu. (B) Un ELISA multiplex di glicoproteomica ha rilevato livelli di glicosilazione di 500 proteine uniche in tre biopsie liquide vitreali. Un'analisi di interazione delle proteine STRING ha identificato cluster di interazioni proteiche (sono mostrati cluster con almeno 10 proteine). Il percorso più significativamente arricchito è mostrato per ciascun cluster. (C) L'analisi metabolomica mediante spettrometria di massa ha identificato 292 diversi metaboliti in tre biopsie liquide dell'umore acqueo. Ogni punto rappresenta un campione. L'altezza della barra corrisponde al numero medio di metaboliti, la barra di errore rappresenta la deviazione standard. Il pannello di destra mostra percorsi significativamente arricchiti. Viene mostrato il numero di metaboliti rilevati (numeratore) e il numero totale di metaboliti in ciascuna via (denominatore). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65804/65804fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Questo protocollo presenta una piattaforma integrata di biorepository per la raccolta, l'annotazione e la biobanca standardizzate di umori acquei umani di alta qualità e biopsie liquide vetrose per analisi molecolari a valle, tra cui proteomica, metabolomica e glicomica.

Biobanking di biopsie umane acquose e vetrose per analisi molecolari

A critical challenge in translational research is establishing a viable and efficient interface between patient care in the operating room (OR) and the ...

La profilazione molecolare delle biopsie liquide dall'occhio umano può catturare fluidi arricchiti localmente contenenti migliaia di molecole diverse da tessuti oculari altamente specializzati. Consentono la caratterizzazione molecolare delle malattie oculari nell'uomo vivente e di ulteriori potenziali per identificare nuove strategie diagnostiche e terapeutiche. Qui abbiamo sviluppato un protocollo per la raccolta standardizzata e la biobanca di umori acquei di alta qualità e biopsie liquide vitreali durante la chirurgia intraoculare.Parte del protocollo è un database basato sul web conforme alla privacy dei dati per annotare ogni campione nel corso della sua vita e l'uso di un sistema di coordinate che consente di tracciare la posizione di ciascun campione con codice a barre in deposito, che consente un recupero efficiente del campione per esperimenti a valle come l'analisi di proteine, glicani e metaboliti. Utilizzare un microscopio operatorio per eseguire una paracentesi della camera anteriore perpendicolare al limbus utilizzando un ago da 30 a 32 gauge collegato a una siringa da un ml. Una punta di cotone può essere utilizzata per stabilizzare l'occhio durante questa procedura.Assicurarsi che la punta dell'ago rimanga sopra l'iride periferica nella camera anteriore media per evitare danni alle strutture intraoculari. Sotto visualizzazione diretta al microscopio, aspirare manualmente circa un centinaio di microlitri di umore acqueo non diluito usando una siringa da un ml. L'ago viene quindi accuratamente rimosso dalla camera anteriore.In un occhio fachico, tenere l'ago sopra l'iride per evitare di toccare la lente. La pressione positiva sul globo può aumentare il reflusso. Rilasciare la punta di cotone prima che l'ago venga estratto aiuta a ridurre il reflusso.Tira indietro l'idraulico e guarda come si muove l'aria e il fluido raccolto. Iniettare la siringa nel flaconcino di crio. L'aria extra libera lo spazio morto della siringa.Qui puoi vedere il codice a barre che è inciso in modo permanente sulla fiala. Il codice a barre viene quindi utilizzato per scansionare il campione nel modulo REDCap su un computer in sala operatoria. Il flaconcino criogenico verrà immediatamente trasferito su ghiaccio secco nella scatola di raffreddamento.Le biopsie liquide vitreali possono essere ottenute all'inizio di una vitrectomia da un chirurgo vitreoretinico addestrato. Si noti che il cutter per vitrectomia non sarà innescato con liquido. Nella cavità vitreale, attivare la fresa vitreale senza infusione per raccogliere un campione vitreo non diluito.Aspirare manualmente da 0,5 a un ml di vitreo utilizzando una siringa collegata alla cannula di estrusione vitreale. Il campione viene quindi elaborato come abbiamo dimostrato per un campione omerale accurato. Questo video è una procedura dettagliata di un modulo di raccolta di esempi compilato in REDCap nella visualizzazione sondaggio.Una volta che un paziente completa il consenso elettronico con l'assistenza di un coordinatore della ricerca clinica, questo modulo viene compilato. È possibile accedervi dallo stesso dispositivo su cui il paziente ha ottenuto il consenso elettronico oppure è possibile accedervi utilizzando qualsiasi altro dispositivo approvato. Una copia del consenso elettronico che è stato completato è accessibile qui per verificare le firme.Il coordinatore compila quindi le altre sezioni pertinenti, incluso il tipo di consenso e in questa sezione blu, i dettagli sul caso stesso, come il caso chirurgo, dove è stato eseguito, la data della raccolta e altre informazioni pertinenti. In questa prossima sezione verde del paziente, abbiamo dati demografici del paziente, tra cui un campione MRN, il nome e il cognome del paziente, il sesso, la data di nascita con un calcolo automatico dell'età, la lateralità dell'occhio interessato e la categoria diagnostica. Questo modulo presenta una logica di diramazione, pertanto quando viene selezionata una casella di controllo influisce sull'aspetto delle caselle di controllo sottostanti.In questo caso, questo è un segmento anteriore e un caso di retina. Quindi, per prima cosa, la scatola della retina di diagnosi è popolata. Il coordinatore ha selezionato che si tratta di un foro maculare ed è stata popolata anche la casella di diagnosi del segmento anteriore.In questo caso, sembra che sia una cataratta. Un modulo di cronologia pre-operazione viene anche popolato come casella di testo libero. Qui, le informazioni dall'EMR possono essere copiate e incollate o nuove informazioni sulla cronologia pre-operatoria possono essere inserite per riferimento futuro.Successivamente, in questa sezione rossa, abbiamo la casella della procedura. In questo caso, sembra che sia stata selezionata una vitrectomia pars plana insieme alla IOL phaco. Tutto ciò che non è popolato qui in nessuna di queste caselle di controllo può essere immesso in testo libero utilizzando queste altre caselle che sono disseminate in tutto il modulo.Vengono inoltre completati i dettagli rilevanti sul caso stesso. Infine, in questa sezione d'oro, abbiamo un'area di raccolta. Il nome del coordinatore che raccoglie il campione e il numero di provette utilizzate sono stati inseriti qui.Ancora una volta, utilizzando la logica di ramificazione, siamo in grado di raccogliere tutti i campioni necessari per il caso. In questo caso, sono stati raccolti due campioni, sembra un nucleo vitreo e un campione di fluido della camera anteriore. I codici a barre di ciascuno di questi campioni sono stati scansionati qui e registrati nel modulo.Infine, c'è una sezione di note di raccolta di campioni in cui il coordinatore può digitare i dettagli pertinenti, inclusi i volumi e la qualità del fluido prelevato. In questa sezione finale di caricamento dei file, tutte le foto, i video o la documentazione rilevanti possono essere caricati nel modulo stesso e collegati. Infine, una volta completato tutto, il coordinatore può fare clic su invia avanti e il modulo viene salvato con tutte le informazioni rilevanti memorizzate, collegando correttamente il campione con il paziente.Trasportare i campioni su ghiaccio secco dalla sala operatoria al laboratorio. Accedere a REDCap sul computer di laboratorio. Prendi uno dei campioni raccolti e scansiona il codice a barre nel database.Ora è necessario un secondo contenitore con ghiaccio secco e un rack per le fiale criogeniche. Anche il codice a barre del rack verrà scansionato nel database e i campioni verranno trasferiti nel rack. La posizione delle fiale nel rack viene aggiunta al database e la voce viene salvata e chiusa.Il rack con le fiale viene quindi trasportato su ghiaccio secco al frigorifero per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Il rack viene aggiunto a una posizione specifica nel frigorifero utilizzando un sistema di coordinate. Ciò consentirà in seguito di recuperare facilmente i campioni per l'analisi a valle.Questo video è una procedura dettagliata del modulo di archiviazione di esempio. Qui, vediamo il record di panoramica del paziente. Questo cerchio verde indica che il modulo di inserimento della raccolta di campioni è già stato completato.Questo cerchio vuoto indica che un modulo di archiviazione deve essere completato. Un modulo di conservazione deve essere compilato per ogni campione raccolto durante la fase del modulo di iscrizione. Facendo clic su questo cerchio si accede al primo modulo di archiviazione di esempio.Qui possiamo vedere che è stato generato un PID e l'MRN è stato mascherato. Tali informazioni sono ancora accessibili e sono accessibili utilizzando la pagina precedente facendo clic sul cerchio verde nel modulo di iscrizione. Qui verrà generata un'istantanea del campione una volta completata questa pagina.Sotto le note di raccolta, vediamo che le informazioni sono state importate automaticamente dal modulo di iscrizione. Successivamente, in Data di archiviazione record, possiamo inserire la data in cui questo modulo è in fase di completamento. Sotto il codice a barre del tubo campione, eseguiamo la scansione o reinseriamo il codice a barre del tubo che viene archiviato.In tempo reale, questa istantanea del campione viene aggiornata. In questa sezione, è possibile selezionare se un campione viene trasferito. Qui inseriamo queste informazioni rilevanti.Per il bene di questo esempio, indicheremo che questo è un campione che va nella memoria interna del biorepository. In fase di verifica, un coordinatore di ricerca può tornare indietro e verificare che il consenso elettronico o cartaceo sia stato completato correttamente e all'interno dei protocolli. Viene inserito il nome della persona che completa questa verifica e utilizzando questo menu a discesa, il verificatore abbina il codice a barre qui con quello appena digitato.Ciò garantisce la precisione. Successivamente, in questa fase di localizzazione, vediamo il congelatore in cui verrà conservato il campione. Possiamo indicare lo scaffale in cui verrà conservato il campione e registrare il codice a barre della scatola, che può essere scansionato o digitato.Un'etichetta della scatola può anche essere digitata qui e l'etichetta può essere posizionata sulla scatola per un'ulteriore corrispondenza. Quindi le due posizioni per riga e colonna vengono entrambe registrate. Ciò garantisce che ogni codice a barre sia associato a una posizione all'interno della scatola che viene registrata per un facile recupero in futuro.In questa sezione di utilizzo, possiamo inserire il nome del nostro progetto o selezionarne uno da una casella a discesa. Registrare il volume del campione. E qui, la data e l'ora, nonché l'ultimo utente che ha effettuato l'accesso a questo modulo vengono compilati automaticamente per garantire una catena di custodia che può essere rivista e verificata secondo necessità.La persona che archivia il modulo inserisce qui il proprio nome e indica qui eventuali note pertinenti che potrebbero essere coerenti con ciò che desidera registrare all'interno di questo modulo di registrazione per la conservazione. Infine, c'è un'altra sezione per caricare un file e, una volta completato tutto questo, questo modulo può essere completato e inviato facendo clic su salva ed esci, il che ci riporta alla panoramica del paziente. Per ogni modulo aggiuntivo che deve essere completato, per ogni tubo che deve essere memorizzato, possiamo fare clic su questo pulsante più per tornare al modulo di archiviazione del campione e generare un altro record.Questa panoramica fornisce un accesso al modulo di iscrizione che è stato generato, nonché a tutti i moduli di archiviazione successivi per questa cartella del paziente. In questo modo, è facilmente recuperabile e accessibile da chiunque abbia accesso backend o altre autorizzazioni all'interno di un REDCap. Le biopsie liquide raccolte possono essere sottoposte a una varietà di analisi molecolari tra cui proteomica, glicomica e metabolomica.Il database REDCap consente un recupero semplice e rapido dei campioni, ad esempio cercando campioni di pazienti con una malattia specifica. Questo è un caso di una paziente di 17 anni che era immunocompromessa e che presentava infiammazione della retina e del nervo ottico. Essendo preoccupato per un'infezione, è stata eseguita una biopsia liquida dell'umore acqueo e inviata per l'analisi PCR del DNA.I risultati sono stati positivi per CMV e negativi per HSV e toxoplasmosi e sono stati fondamentali per distinguere le forme infettive da quelle non infettive di infiammazione intraoculare e selezionare la terapia appropriata. La spettrometria di massa per cromatografia liquida consente un'analisi imparziale e semi-quantitativa del proteoma. In una biopsia liquida dal vitreo di un paziente sottoposto a vitrectomia, la tecnica è stata in grado di identificare 484 proteine uniche, tra cui il complemento C3, l'ottica e il collagene di tipo 2.Tre biopsie liquide vetrose sono state analizzate utilizzando un analizzatore multiplex glicoproteomica. Il test ha rilevato i profili di glicosilazione di 500 proteine umane, catturando una varietà di percorsi biologici come il metabolismo, la risposta immunitaria, l'adesione cellulare e l'organizzazione dell'actina. Abbiamo anche analizzato il profilo metabolomico delle biopsie liquide dell'umore acqueo utilizzando una speciale forma di spettrometria di massa.Abbiamo identificato 292 diversi metaboliti in tre biopsie liquide umane acquose. Un'analisi del percorso ha identificato una varietà di percorsi metabolici tra cui il metabolismo degli aminoacidi, il ciclo dell'uria e la sintesi della carnitina. In conclusione, il nostro flusso di lavoro ha stabilito un'interfaccia pratica tra la sala operatoria e il laboratorio di ricerca che consente la raccolta, l'annotazione e la conservazione standardizzate e ad alta produttività di campioni chirurgici di alta qualità.I campioni possono essere utilizzati per analisi molecolari a valle, tra cui studi di proteomica, glicomica e metabolomica. Il nostro protocollo fornisce una base preziosa per la futura ricerca traslazionale.

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