Name: Riprogrammazione delladenocarcinoma duttale pancreatico alla pluripotenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Impara a riprogrammare cellule di adenocarcinoma duttale pancreatico in cellule staminali pluripotenti indotte. Questo protocollo dettagliato utilizza lentivirus per generare linee iPSC stabili e studiare la progressione del cancro.

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A.S e J.K desiderano ringraziare Cancer Research UK e OHSU per il finanziamento (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S è supportato da un premio per lo sviluppo della carriera MRC (MR/N024028/1). A.A è finanziato da una borsa di dottorato di ricerca (Scholarship ref. 1078107040) della King Abdulaziz City for Science and Technology. J.K è finanziato da MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) e Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Ringraziamo il Prof. Keisuke Kaji per averci gentilmente fornito il vettore di riprogrammazione pSIN4-EF1a-O2S e pSIN4-CMV-K2M. Ai fini dell'accesso aperto, l'autore ha applicato una licenza Creative Commons Attribution (CC BY) a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore derivante da questa presentazione.

Riprogrammazione del PDAC e delle cellule pancreatiche in cellule staminali pluripotenti indotte

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Per facilitare l'uso della riprogrammazione delle iPSC per lo studio della progressione del cancro, è stato stabilito un robusto protocollo per la riprogrammazione delle cellule tumorali del pancreas. La riprogrammazione delle cellule tumorali in pluripotenza si è dimostrata finora molto impegnativa, poiché solo pochi studi hanno generato con successo iPSC da cellule tumorali 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. La maggior parte di questi studi ha utilizzato linee cellulari tumorali immortalizzate per generare linee iPSC, non cellule primarie derivate da pazienti 36,37,38,40,42,43,44,46. Ad esempio, è stata tentata la riprogrammazione di quattro diverse linee cellulari di cancro al fegato utilizzando l'introduzione retrovirale di fattori OSKM, ma solo una singola linea cellulare è stata riprogrammata con successo41. Tuttavia, la linea iPSC generata per il cancro del fegato ha mostrato una perdita di staminalità dopo pochi passaggi, evidenziando l'elevata resistenza delle cellule tumorali alla riprogrammazione OSKM41. In precedenza, sono stati fatti tentativi di riprogrammare le cellule PDAC utilizzando la somministrazione lentivirale di OSKM individualmente; tuttavia, è stata generata una sola linea iPSC, dipendente dall'espressione esogena di OSKM e quindi non completamente riprogrammata37. Un altro studio ha utilizzato vettori episomiali per fornire fattori OSKM senza integrazione genomica, ma è riuscito a generare solo un singolo clone di iPSC da PDAC39. Il limitato successo nella riprogrammazione delle cellule tumorali si aggiunge alle molte sfide che ostacolano l'uso della tecnologia iPSC nella ricerca sul cancro.
Qui, viene spiegata la generazione di iPSC da campioni primari di PDAC derivati da due diversi pazienti e da una linea cellulare PDAC consolidata (BxPc3). Inoltre, le iPSC sono state generate anche da H6c7, una linea cellulare epiteliale duttale pancreatica. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo rapporto di linee iPSC stabili derivate con successo da BxPc3 e H6c7. Seguendo questo protocollo, le iPSC sono state generate con successo anche da fibroblasti umani primari derivati da individui sani, ampliando l'applicabilità del metodo oltre la ricerca sul cancro.
Uno degli elementi chiave alla base del successo del protocollo è l'uso di vettori lentivirali bicistronici per co-esprimere i fattori OS e KM. Questi vettori contengono il sito di ingresso del ribosoma interno 2 (IRES2) per esprimere OCT4 e SOX2 in un vettore e KLF4 e cMYC nell'altro. Diversi studi che utilizzano vettori monocistronici in cui ogni fattore di riprogrammazione è stato fornito individualmente hanno dimostrato che l'assorbimento di ciascun vettore è diverso, influenzando la stechiometria OSKM e l'efficienza di riprogrammazione47. L'uso di vettori bicistronici può aiutare a mitigare questo problema. Inoltre, l'utilizzo di IRES in vettori lentivirali ha mostrato un significativo aumento dell'efficienza di riprogrammazione48. In questo sistema lentivirale, l'espressione di OS è guidata dal promotore EF1a, mentre l'espressione di KM è sotto il controllo di un promotore di CMV. È noto che il promotore del CMV può essere sottoposto a silenziamento altamente efficiente mediante metilazione del DNA e deacetilazione degli istoni, a differenza di EF1a49,50. Pertanto, il silenziamento precoce di KM prima di OS durante la riprogrammazione può essere un fattore chiave per il successo del protocollo. Ciò è coerente con studi precedenti che mostrano l'importanza delle dinamiche di espressione di OSKM durante la riprogrammazione 51,52,53,54,55. Pertanto, il vettore bicistronico è anche più vantaggioso del vettore policistronico, in cui tutti i fattori OSKM sono espressi da un singolo promotore56. Altri fattori che contribuiscono al successo del protocollo includono le dosi di infezione da lentivirus e il numero di cellule infette utilizzate per la riprogrammazione, che sono state personalizzate per ogni tipo di cellula.
In sintesi, viene presentato un metodo ottimizzato per la riprogrammazione delle cellule PDAC primarie insieme ad altre linee cellulari e cellule normali. Questo metodo aiuterà ad espandere l'uso della riprogrammazione delle iPSC per modellare la progressione del cancro e, in questo caso, scoprire i primi biomarcatori PDAC.

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una delle neoplasie maligne più fatali e la diagnosi precoce rimane difficile a causa della natura asintomatica della malattia. La maggior parte dei pazienti affetti da PDAC viene diagnosticata in fase metastatica avanzata, quando sono disponibili opzioni terapeutiche molto limitate 1,2. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di biomarcatori affidabili per le fasi iniziali, come quelli che potrebbero essere comodamente rilevati come proteine rilasciate nel flusso sanguigno.
Il PDAC può diffondersi molto presto durante la sua progressione e una prognosi migliore è stata collegata alla diagnosi precoce del cancro quando il PDAC è localizzato nel pancreas3. Tuttavia, a meno di un decimo dei pazienti con PDAC viene diagnosticata una prognosi favorevole, consentendo la resezione chirurgica. Tuttavia, i pochi con tumori resecabili sono anche inclini alla recidiva del tumore entro 12 mesi4.
Negli ultimi cinquant'anni sono stati apportati notevoli miglioramenti alle tecniche chirurgiche, alla cura del paziente e alle modalità di trattamento 5,6. Tuttavia, il tasso di sopravvivenza a 5 anni nei pazienti PDAC resecati chirurgicamente è salito a malapena al 17%. Ciononostante, questo dato è ancora migliore di quello dei pazienti non resecati, che è rimasto pressoché invariato (0,9%)4,7. La chemioterapia è l'unico altro trattamento alternativo per la PDAC. Tuttavia, questa opzione è molto limitata in quanto la grande maggioranza dei pazienti con PDAC mostra una forte resistenza ai farmaci chemioterapici come la gemcitabina 7,8. Altri farmaci, come l'erlotinib, sono disponibili solo per un piccolo gruppo di pazienti affetti da PDAC con mutazioni specifiche, la maggior parte dei quali mostra resistenza all'erlotinib9. Gli effetti collaterali avversi associati alla chemioterapia nella maggior parte dei pazienti con PDAC sono un altro svantaggio di questo trattamento10. Recentemente, strategie promettenti hanno dimostrato che gli inibitori del checkpoint immunitario (ICI) e gli inibitori delle chinasi a piccole molecole (SMKI) possono essere efficaci nel trattamento del PDAC, ma le risposte durature a queste terapie mirate rimangono limitate a una minoranza di pazienti11,12. Nel complesso, la scoperta di biomarcatori precoci specifici per PDAC può aprire nuove strade per la diagnosi e il trattamento precoci.
La PDAC si sviluppa da lesioni precursori delle neoplasie intraepiteliali pancreatiche (PanIN) che derivano da proliferazioni epiteliali del dotto pancreatico non invasive13,14. Mentre la formazione di PanIN è iniziata da mutazioni oncogeniche come KRAS, sono necessarie ulteriori alterazioni genetiche ed epigenetiche per la progressione verso PDAC. È stato previsto che la progressione di PanIN attraverso i diversi stadi in PDAC invasivo richieda circa 10 anni 13,15,16,17. Questo lasso di tempo offre una grande opportunità per trarre vantaggio dalla diagnosi precoce del PDAC. Pertanto, sono state condotte ricerche approfondite per stabilire modelli animali di xenotrapianto tumorale e colture di organoidi per studiare la progressionedel PDAC 18,19,20,21. Questi modelli sono stati molto utili per studiare gli stadi invasivi del PDAC, anche se non la transizione dalle prime fasi di PanIN. È quindi importante sviluppare modelli sperimentali in grado di ricapitolare la progressione precoce degli stadi di PanIN per consentire la scoperta di biomarcatori di diagnosi precoce.
La riprogrammazione delle cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando i quattro fattori di trascrizione OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC (OSKM) ha illustrato l'estensione della plasticità cellulare22. La plasticità delle cellule tumorali è stata ben documentata e la riprogrammazione delle cellule tumorali umane in iPSC è stata utilizzata con successo per riportare le cellule al loro stato cellulare originale, rimuovendo molti degli insulti epigenetici che si sono accumulati durante la progressione del cancro 23,24,25,26,27,28,29. La possibilità di utilizzare questa strategia di riprogrammazione per manipolare l'identità delle cellule tumorali ha, quindi, presentato una grande promessa nel trattamento del cancro30,31. Infatti, abbiamo precedentemente dimostrato che la differenziazione delle iPSC derivate dai PDAC può ricapitolare la progressione del PDAC attraverso i primi stadi PanIN32. Identificando i geni e i percorsi specifici per gli stadi preco-intermedi del PDAC, sono stati identificati biomarcatori candidati che possono essere utilizzati clinicamente per la diagnosi precoce del PDAC32,33. Tuttavia, i biomarcatori scoperti utilizzando una singola linea di iPSC hanno mostrato una copertura limitata nella maggior parte dei pazienti con PDAC32. Le sfide legate alla generazione di linee di iPSC da altri pazienti affetti da PDAC hanno interrotto la capacità di scoprire biomarcatori più affidabili. Ciò è dovuto a molti fattori tecnici, tra cui l'eterogeneità della somministrazione di OSKM, poiché solo una piccola porzione di cellule PDAC primarie umane conteneva tutti e quattro i fattori e rispondeva con successo alla riprogrammazione. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la riprogrammazione delle cellule PDAC primarie utilizzando una doppia somministrazione lentivirale più efficiente e coerente di OSKM.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo (50 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-umano TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Estratto ipofisario bovino (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Tossina del colera da Vibrio cholerae</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Collagene, soluzione di tipo I da coda di ratto</td><td>Merck</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Completato Definito K-SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp; 10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Piastre a pozzetti multipli trattate</td> TC <td>Merck</td><td></td><td></td>CLS3516</tr><tr><td>Filtri per siringhe Corning</td><td>Merck</td><td></td><td></td>CLS431231</tr><tr><td>Piastre di coltura trattate con coltura tissutale Corning</td><td>Merck</td><td></td><td></td>CLS430599</tr><tr><td>Giorno Impex&nbsp; Virkon Disinfettante Compresse Virucide</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello (FCS)&nbsp;</td><td>Reagente di</td> trasfezione Thermo Fisher <td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>&nbsp; E2312</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di gelatina, Tipo B, 2% in H2O</td><td>Merck</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td><td>Merck</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Proteina ricombinante EGF umana</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Proteina ricombinante umana FGF-basica (FGF-2/bFGF) (154 aa), PeproTech</td><td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare epiteliale del dotto pancreatico umano (H6c7)</td>Cellule feeder <td>Kerafast</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>iMEF&nbsp;</td><td>iXcells Biotechnologies</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>Terreni privi di siero per cheratinociti (KSFM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut siero di ricambio&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0,45 &mu; M siringa Unità filtro (sterile)</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>SLHP033RS</tr><tr><td>Opti-MEM Siero Ridotto Medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>Polibrene (bromuro di esadimetrina)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (modifica ATCC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Sodym Piruvato</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe sterili per uso singolo (60 mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (dicloridrato)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

riprogrammazione dell'adenocarcinoma duttale pancreatico alla pluripotenza

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

La generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando fattori di trascrizione è stata ottenuta da quasi tutti i tipi di cellule differenziate e si è dimostrata molto preziosa per la ricerca e le applicazioni cliniche. È interessante notare che la riprogrammazione iPSC delle cellule tumorali, come l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), ha dimostrato di invertire il fenotipo PDAC invasivo e di ignorare l'epigenoma del cancro. La differenziazione delle iPSC derivate da PDAC può ricapitolare la progressione di PDAC dal suo precursore precoce della neoplasia intraepiteliale pancreatica (PanIN), rivelando i cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano precocemente durante la progressione di PDAC. Pertanto, le iPSC derivate da PDAC possono essere utilizzate per modellare le prime fasi di PDAC per la scoperta di marcatori diagnostici di diagnosi precoce. Ciò è particolarmente importante per i pazienti con PDAC, che in genere vengono diagnosticati nelle fasi metastatiche tardive a causa della mancanza di biomarcatori affidabili per le fasi iniziali di PanIN. Tuttavia, la riprogrammazione delle linee cellulari tumorali, incluso il PDAC, in pluripotenza rimane impegnativa, laboriosa e altamente variabile tra le diverse linee. Qui, descriviamo un protocollo più coerente per la generazione di iPSC da varie linee cellulari PDAC umane utilizzando vettori lentivirali bicistronici. Le linee di iPSC risultanti sono stabili e non mostrano alcuna dipendenza dall'espressione esogena di fattori di riprogrammazione o farmaci inducibili. Nel complesso, questo protocollo facilita la generazione di un'ampia gamma di iPSC derivate da PDAC, che è essenziale per scoprire biomarcatori precoci che sono più specifici e rappresentativi dei casi di PDAC.

Nella Figura 1 sono mostrate immagini rappresentative che mostrano la morfologia delle colonie di iPSC derivate da cellule PDAC, BXPc3, H6C7 e hFib. Le colonie PDAC-iPSC hanno iniziato a formarsi il giorno 25 della riprogrammazione. Colonie di iPSC robuste con una morfologia più consolidata simile a quella delle ESC sono state identificate al 40° giorno di riprogrammazione (Figura 1). Allo stesso modo, la formazione di BxPc3-iPSC è iniziata il giorno 23 ed è diventata più consolidata il giorno 35. La formazione di H6C7-iPSC era simile a quella delle PDAC-iPSC e ha iniziato a stabilirsi il giorno 45. Le colonie di hFib-iPSC hanno iniziato a formarsi il giorno 15 della riprogrammazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figura 1: Immagini rappresentative delle colonie di iPSC. Le immagini mostrano una morfologia simile a hESC derivata da (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 e (D) hFib. I giorni di riprogrammazione sono indicati sopra ogni immagine. Barre di scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 
Le linee clonali di iPSC sono state stabilite da ogni riprogrammazione di cellule PDAC, BxPc3, H6C7 e hFib. Tutte le linee di iPSC consolidate sono risultate positive per TRA-1-60, un marcatore indifferenziato della superficie cellulare hESC, confermando la loro riprogrammazione alla pluripotenza (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig2.jpg"> Figura 2: Immagini rappresentative di linee clonali di iPSC. Le immagini sono derivate da (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 e (D) hFib che mostrano una morfologia simile a ESC (pannelli superiori) e una colorazione positiva per TRA-1-60 (pannello inferiore). Barre di scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Il presente protocollo descrive la riprogrammazione dell'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) e delle cellule epiteliali duttali pancreatiche normali in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Forniamo una procedura ottimizzata e dettagliata, passo dopo passo, dalla preparazione dei lentivirus alla creazione di linee iPSC stabili.

Riprogrammazione dell'adenocarcinoma duttale pancreatico alla pluripotenza

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

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