Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi
13 ottobre 2023
Il protocollo fornisce un approccio affidabile e ottimizzato all'isolamento dei nuclei da campioni di tumore solido per il sequenziamento multioma utilizzando la piattaforma 10x Genomics, comprese le raccomandazioni per le condizioni di dissociazione tissutale, la crioconservazione delle sospensioni a singola cellula e la valutazione dei nuclei isolati.
Man mano che la nostra conoscenza della biologia dei tumori cresce e l'interesse per comprendere le complessità di come le cellule interagiscono all'interno del tumore e influenzano gli esiti dei pazienti, è aumentata anche l'importanza di analizzare cellule eterogenee nel microambiente tumorale. Il sequenziamento multiomico, che consente l'acquisizione di RNA a singola cellula e il sequenziamento dell'attacco dalla stessa cellula in modo accoppiato, fornisce un progresso significativo verso questo scopo. Tuttavia, la qualità dei dati ottenuti da questi esperimenti dipende fortemente dalla qualità delle condizioni sperimentali e del materiale biologico inserito.
Questo protocollo fornisce un approccio affidabile e ottimizzato all'isolamento di nuclei da campioni di tumore solido per il sequenziamento di più omi utilizzando la piattaforma 10x Genomics. Questo protocollo è affidabile utilizzando sospensioni a singola cellula fresche o congelate. Forniamo raccomandazioni per le condizioni di dissociazione tissutale, la crioconservazione di sospensioni unicellulari e la valutazione di nuclei isolati.
In questo protocollo, abbiamo utilizzato campioni di adenocarcinoma duttale pancreatico umano, che sono un tipo di tessuto primario di focus nel nostro laboratorio. Il cancro del pancreas rappresenta un tipo di tumore altamente desmoplastico, che fa presagire tessuti e cellule relativamente appiccicosi. Inoltre, poiché anche i campioni di tumore del pancreas disponibili per la ricerca tendono ad essere relativamente piccoli, vengono fatti sforzi per massimizzare la quantità di cellule catturate.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo affidabile e ottimizzato per l'isolamento di nuclei da campioni di tumori solidi per il sequenziamento multi-omica mediante la piattaforma 10x Genomics. Include raccomandazioni sulle condizioni di dissociazione del tessuto e sulla criopreservazione delle sospensioni cellulari singole.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncologia
- Genomica
Sfondo
- Comprendere la biologia tumorale è fondamentale per migliorare i risultati nei pazienti.
- L'analisi delle cellule eterogenee nel microambiente tumorale è sempre più importante.
- Il sequenziamento multi-om consente l'acquisizione accoppiata di RNA singola cellula e sequenziamento ATAC.
- La qualità dei dati dipende fortemente dalle condizioni sperimentali e dal materiale biologico.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo affidabile per l'isolamento di nuclei da tumori solidi.
- Migliorare la qualità dei dati di sequenziamento multi-omico.
- Facilitare l'analisi dei microambienti tumorali.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di nuclei da campioni di tumori solidi.
- Utilizzo di sospensioni cellulari singole fresche o congelate.
- Raccomandazioni per le condizioni di dissociazione dei tessuti.
- Tecniche di criopreservazione per sospensioni cellulari singole.
Risultati principali
- È stato stabilito un approccio ottimizzato per l'isolamento dei nuclei.
- Risultati affidabili ottenuti sia da campioni freschi che congelati.
- Qualità dei dati migliorata per il sequenziamento multi-om.
- Sono state fornite linee guida per la lavorazione dei tessuti e la criopreservazione.
Conclusioni
- Il protocollo migliora l'affidabilità dell'isolamento dei nuclei dai tumori.
- Permette lo sviluppo di tecniche di sequenziamento multi-om.
- Studi futuri potranno trarre vantaggio da condizioni sperimentali migliorate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'isolamento ottimizzato di nuclei da campioni di tumori solidi è fondamentale per generare dati di sequenziamento multiomico di alta qualità, influenzando direttamente l'affidabilità delle analisi dell'eterogeneità tumorale nell'oncologia traslazionale. Questo protocollo affronta la sfida dell'estrazione di nuclei integri da tessuti tumorali desmoplastici sia freschi che congelati, supportando un profilo multiomico singola-cellula robusto. Una preparazione affidabile dei nuclei in questa fase migliora la sicurezza predittiva nei flussi di scoperta successivi e nello sviluppo di biomarcatori.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette un'analisi ad alta fedeltà dell'eterogeneità delle cellule tumorali a livello singola-cellula.
- Supporta la validazione funzionale dei bersagli preservando popolazioni cellulari diverse durante l'isolamento.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico attraverso una rappresentazione accurata del microambiente tumorale.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce preparazioni standardizzate di nuclei per saggi di sequenziamento multiomico riproducibili.
- Garantisce coerenza quantitativa e qualitativa del materiale in ingresso per flussi di lavoro successivi.
- Migliora la prontezza del saggio consentendo l'utilizzo sia di campioni tumorali freschi che criopreservati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Permette l’allineamento alla scoperta di biomarcatori traslazionali consentendo il profilo appaiato di RNA e accessibilità della cromatina.
- Mantiene la rilevanza per la patologia catturando la complessità dei microambienti dei tumori solidi.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica standardizzando la qualità dell’input.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di isolamento dei nuclei si colloca all'interfaccia tra il trattamento dei tessuti e la generazione di dati multiomici, fungendo da ponte tra le fasi iniziali della scoperta e i flussi di lavoro della ricerca traslazionale.
- Biologia della scoperta: Massimizza la potenza del test delle ipotesi preservando la diversità e l'integrità cellulare.
- Screening: Fornisce nuclei riproducibili e di alta qualità per saggi di sequenziamento multiomico scalabili.
- Analisi: Consente letture quantitative robuste per confrontare stati cellulari tumorali e paesaggi della cromatina.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'allineamento dei biomarcatori supportando analisi accoppiate di RNA a singola cellula e ATAC-seq.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato e adattabile per diversi tipi di tumori solidi e condizioni di campione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva negli studi sulla biologia tumorale e sulla validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità su campioni tumorali freschi e congelati.
- Valore strategico: Riduce il rischio di perdita di dati o introduzione di artefatti nella fase di preparazione del campione.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce l'avanzamento calibrato sui rischi dei programmi di scoperta e traslazionali in oncologia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissociazione dei tessuti e nella manipolazione dei nuclei per ottenere un rendimento e una qualità ottimali.
- Necessita dell'accesso a reagenti specializzati, filtri cellulari e strumenti di valutazione quantitativa.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro delle condizioni di digestione e lisi per garantire la riproducibilità.
- Deve essere adattato a seconda del tipo di tumore e delle dimensioni del campione, in particolare per tessuti desmoplastici.
- È essenziale un attento monitoraggio dell'integrità nucleare per evitare artefatti nella sequenziazione successiva.
