Isolamento ottimizzato dei nuclei da campioni di tumore solido freschi e congelati per il sequenziamento di più omi
13 ottobre 2023
Il protocollo fornisce un approccio affidabile e ottimizzato all'isolamento dei nuclei da campioni di tumore solido per il sequenziamento multioma utilizzando la piattaforma 10x Genomics, comprese le raccomandazioni per le condizioni di dissociazione tissutale, la crioconservazione delle sospensioni a singola cellula e la valutazione dei nuclei isolati.
Man mano che la nostra conoscenza della biologia dei tumori cresce e l'interesse per comprendere le complessità di come le cellule interagiscono all'interno del tumore e influenzano gli esiti dei pazienti, è aumentata anche l'importanza di analizzare cellule eterogenee nel microambiente tumorale. Il sequenziamento multiomico, che consente l'acquisizione di RNA a singola cellula e il sequenziamento dell'attacco dalla stessa cellula in modo accoppiato, fornisce un progresso significativo verso questo scopo. Tuttavia, la qualità dei dati ottenuti da questi esperimenti dipende fortemente dalla qualità delle condizioni sperimentali e del materiale biologico inserito.
Questo protocollo fornisce un approccio affidabile e ottimizzato all'isolamento di nuclei da campioni di tumore solido per il sequenziamento di più omi utilizzando la piattaforma 10x Genomics. Questo protocollo è affidabile utilizzando sospensioni a singola cellula fresche o congelate. Forniamo raccomandazioni per le condizioni di dissociazione tissutale, la crioconservazione di sospensioni unicellulari e la valutazione di nuclei isolati.
In questo protocollo, abbiamo utilizzato campioni di adenocarcinoma duttale pancreatico umano, che sono un tipo di tessuto primario di focus nel nostro laboratorio. Il cancro del pancreas rappresenta un tipo di tumore altamente desmoplastico, che fa presagire tessuti e cellule relativamente appiccicosi. Inoltre, poiché anche i campioni di tumore del pancreas disponibili per la ricerca tendono ad essere relativamente piccoli, vengono fatti sforzi per massimizzare la quantità di cellule catturate.
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Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo affidabile e ottimizzato per l'isolamento dei nuclei da campioni di tumore solido per il sequenziamento multi-om utilizzando la piattaforma 10x Genomics. Include raccomandazioni per le condizioni di dissociazione dei tessuti e la crioconservazione di sospensioni di cellule singole.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Oncologia
- Genomica
Sfondo
- Comprendere la biologia del tumore è cruciale per migliorare i risultati dei pazienti.
- Analizzare le cellule eterogenee nel microambiente tumorale è sempre più importante.
- Il sequenziamento multi-om permette l'acquisizione abbinata di RNA e sequenziamento ATAC a singola cellula.
- La qualità dei dati dipende fortemente dalle condizioni sperimentali e dal materiale biologico.
Obiettivo dello studio
- Fornire un protocollo affidabile per l'isolamento dei nuclei dai tumori solidi.
- Migliorare la qualità dei dati di sequenziamento multi-om.
- Facilitare l'analisi dei microambienti tumorali.
Metodi utilizzati
- Isolamento di nuclei da campioni di tumore solido.
- Utilizzo di sospensioni di cellule singole fresche o congelate.
- Raccomandazioni per le condizioni di dissociazione dei tessuti.
- Tecniche di crioconservazione per sospensioni di cellule singole.
Risultati principali
- È stato stabilito un approccio ottimizzato per l'isolamento dei nuclei.
- Sono stati ottenuti risultati affidabili sia da campioni freschi che congelati.
- Miglioramento della qualità dei dati per il sequenziamento multi-om.
- Sono state fornite linee guida per la lavorazione dei tessuti e la crioconservazione.
Conclusioni
- Il protocollo migliora l'affidabilità dell'isolamento dei nuclei dai tumori.
- Supporta l'avanzamento delle tecniche di sequenziamento multi-om.
- Gli studi futuri possono beneficiare di condizioni sperimentali migliorate.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Optimized nuclei isolation from solid tumor specimens is critical for generating high-quality multiome sequencing data, directly impacting the reliability of tumor heterogeneity analyses in translational oncology. This protocol addresses the challenge of extracting intact nuclei from both fresh and frozen desmoplastic tumor tissues, supporting robust single-cell multiomic profiling. Reliable nuclei preparation at this stage enhances predictive confidence in downstream discovery and biomarker development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity interrogation of tumor cell heterogeneity at the single-cell level.
- Supports functional target validation by preserving diverse cell populations during isolation.
- Facilitates mechanistic de-risking through accurate representation of the tumor microenvironment.
Screening & Assay Development
- Provides standardized nuclei preparations for reproducible multiome sequencing assays.
- Ensures quantitative and qualitative consistency in input material for downstream workflows.
- Improves assay readiness by accommodating both fresh and cryopreserved tumor samples.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling paired RNA and chromatin accessibility profiling.
- Maintains disease relevance by capturing the complexity of solid tumor microenvironments.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by standardizing input quality.
Pipeline & Workflow Integration
This nuclei isolation protocol is positioned at the interface of tissue processing and multiomic data generation, bridging early discovery and translational research workflows.
- Discovery Biology: Maximizes hypothesis testing power by preserving cell diversity and integrity.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality nuclei for scalable multiome sequencing assays.
- Analytics: Enables robust quantitative readouts for comparing tumor cell states and chromatin landscapes.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by supporting paired single-cell RNA and ATAC-seq analyses.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, adaptable protocol for diverse solid tumor types and sample conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tumor biology and target validation studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability across fresh and frozen tumor samples.
- Strategic Value: Reduces risk of data loss or artifact introduction at the sample preparation stage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of oncology discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissociation and nuclei handling for optimal yield and quality.
- Demands access to specialized reagents, cell strainers, and quantitative assessment tools.
- Necessitates cross-team standardization of digestion and lysis conditions for reproducibility.
- Must be adapted for varying tumor types and sample sizes, especially for desmoplastic tissues.
- Careful monitoring of nuclear integrity is essential to avoid downstream sequencing artifacts.
