Le iniezioni intrafemorali semplificate con topi vivi consentono un'analisi continua del midollo osseo
10 novembre 2023
Questo protocollo descrive l'iniezione intrafemorale di alcune cellule staminali ematopoietiche o leucemiche, comprese le cellule geneticamente modificate, in modelli murini di xenotrapianto, che consentiranno non solo il trapianto rapido e sicuro di cellule, ma anche analisi seriali del midollo osseo.
Questa tecnica ha lo scopo di aiutarci a comprendere meglio la biologia della normale emopoiesi e della malattia nel midollo osseo iniettando e trapiantando in modo sicuro campioni di pazienti preziosi nei topi per via intraorale, seguiti dall'aspirazione del midollo osseo. È noto da tempo che è più efficiente trapiantare piccole quantità di campioni preziosi direttamente nel midollo osseo dei topi per esperimenti eseguiti mediante iniezione endovenosa. Tuttavia, non ci sono video tecnici veri e propri, quindi era generalmente considerata una tecnica ad alto ostacolo.
Il nostro protocollo consente di innestare facilmente e in sicurezza qualsiasi campione prezioso nel topo con un numero ridotto di cellule. C'è una forte domanda per questa tecnologia e, con l'aiuto di questo video, chiunque può impararla rapidamente. Ci auguriamo che tutti possano padroneggiare questa tecnologia e contribuire in modo significativo al progresso della scienza.
Per iniziare, preparare le sospensioni cellulari con un massimo di 3 milioni di cellule campione utilizzando 20 microlitri di tampone FACS o terreno di scongelamento. Tenerli sul ghiaccio prima dell'iniezione. Disinfettare la gamba contenente il femore da iniettare con tre serie di scrub alternati utilizzando uno scrub allo iodio povidone o alla clorexidina e spugne di garza imbevute di etanolo al 70%.
Stabilizzare la gamba pizzicando il femore con il pollice e l'indice. Spingi la tibia con l'anulare o il quinto dito per mantenere la tibia piegata dal femore. Assicurarsi che il posizionamento sia corretto per una corretta iniezione.
Usa il bordo di un ago sterile da 27 G vuoto per beccare il tendine rotuleo sopra il femore. Per garantire il miglior punto di inserimento, inserire l'ago 27G con una siringa attaccata appena sotto il tendine rotuleo. Alloggiandolo saldamente tra i due condili del femore, ruotare l'ago verso l'esterno e verso l'alto per allinearlo parallelamente all'asta del femore.
Ruotare l'ago in cerchio mentre lo si avanza nella cavità del midollo femorale. Inserire l'ago fino a quando non si verifica una notevole riduzione della resistenza. Confermare il corretto posizionamento dell'ago con un movimento laterale.
Creare una pressione negativa tirando indietro lo stantuffo dell'ago mentre si sposta l'ago all'interno della cavità del midollo osseo. Controllare la presenza di sangue o midollo nella siringa per assicurarsi che l'ago sia nella cavità del midollo osseo. Dopo essersi assicurati del corretto posizionamento dell'ago, rimuoverlo lentamente e inserire la cellula contenente la siringa attraverso la stessa radice.
È importante ricordare la radice e l'angolo della prima iniezione quando si passa a un nuovo ago. Una volta che le cellule sono state iniettate con successo nel femore, rimuovere con cautela l'ago e la siringa, mantenendo la pressione sulla siringa. Quindi rimuovere il mouse dal cono del naso e posizionarlo su un tovagliolo di carta pulito per evitare l'aspirazione della biancheria da letto.
Per il recupero, tenere il mouse su un termoforo o su un'altra superficie controllata. Assicurarsi che si riprenda dall'anestesia prima di rimetterli sul supporto per mouse. Osserva i topi per segni di angoscia o infezione nelle prossime 24 ore.
Inizia preparandoti per la procedura prima di aspirare il midollo osseo, bagna una siringa da 0,5 millilitri da 27 G con CSM riempiendo ed espellendo CSM due o tre volte. Quindi aspirare delicatamente il midollo osseo dal topo anestetizzato, producendo da 20 a 50 microlitri di midollo osseo. Quindi rimuovere completamente l'ago dal femore e sospendere il campione aspirato in 500 microlitri di CSM.
Rimuovi il mouse dal cono del naso e posizionalo su un tovagliolo di carta pulito per evitare l'aspirazione della biancheria da letto durante il recupero. Monitora tutti i mouse per verificare il recupero dall'anestesia prima di posizionarli sul retro del supporto per mouse. Pellet di cellule dal midollo osseo con una centrifuga di cinque minuti a 300G a quattro gradi Celsius.
Aspirare il surnatante e aggiungere il tampone di lisi ACK a ciascuna provetta. Agitare le cellule per risospenderle e metterle sul ghiaccio per 5-10 minuti. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon in un nuovo tubo.
Sciacquare il tubo originale con il tampone FACS e passarlo nuovamente attraverso la rete di nylon, le celle del pellet centrifugando per cinque minuti a 300 G a quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante dalle celle pellettate e aggiungere la soluzione colorante contenente gli anticorpi desiderati. Tenere i tubi sul ghiaccio per 20 minuti.
Lavare le cellule e procedere ad analizzarle secondo la configurazione sperimentale. Le tecniche di trapianto possono essere facilmente valutate con un'invasione minima di topi utilizzando un'immagine a bioluminescenza. Qui è stato osservato il trapianto di una linea cellulare K562 di derivazione umana con Acalook in un modello murino xenotrapianto sul lato del femore iniettato.
Il trapianto di HSPC CD34 positivi ha comportato oltre il 10-20% dell'attecchimento di cellule umane a otto settimane dal trapianto. Allo stesso modo, il trapianto di HSC derivate dal sangue del cordone ombelicale ha portato a un attecchimento umano fino al 10% a otto settimane dopo il trapianto. Utilizzando questa procedura è stato ottenuto un ulteriore trapianto di HSPC derivati da midollo osseo adulto, cellule staminali leucemiche, HSPC derivate da sangue cordonale modificate CRISPR Cas9 e iPSC AML derivate da pazienti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive la tecnica per l'iniezione intrafemorale di cellule staminali ematopoietiche o leucemiche in modelli murini. Questo metodo consente un trapianto sicuro e permette analisi seriali del midollo osseo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ematopoiesi
- Biologia delle cellule staminali
- Modelli di xenotrapianto
Sfondo
- Comprendere l'emopoiesi normale e le malattie correlate è fondamentale per far progredire la scienza medica.
- L'iniezione diretta nel midollo osseo è più efficiente rispetto ai metodi intravenosi.
- Le tecniche precedenti non disponevano di risorse didattiche accessibili.
- Questo protocollo ha lo scopo di semplificare il processo per i ricercatori.
Scopo dello studio
- Per consentire un'innesto sicuro ed efficiente di campioni preziosi di pazienti nei topi.
- Per fornire una guida chiara e pratica ai ricercatori.
- Per migliorare la comprensione delle malattie ematopoietiche.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di sospensioni cellulari con buffer FACS.
- Disinfezione e stabilizzazione del sito di iniezione.
- Tecnica di iniezione intrafemorale mediante ago sterile.
- Aspirazione del midollo osseo per l'analisi dopo l'iniezione.
Risultati principali
- Attecchimento riuscito di cellule staminali di origine umana in modelli murini.
- Tassi elevati di attecchimento delle cellule umane dimostrati a otto settimane.
- Trapianto riuscito di diversi tipi di cellule staminali, inclusi cellule modificate geneticamente.
- Il protocollo consente un'invasività minima nei topi e un monitoraggio efficace.
Conclusioni
- Questa tecnica fornisce un metodo affidabile per il trapianto di cellule staminali nella ricerca.
- Permette di soddisfare la richiesta di protocolli accessibili nella ricerca ematopoietica.
- Studi futuri potranno basarsi su questo metodo per esplorare diverse condizioni ematologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'iniezione diretta intrafemorale e l'aspirazione seriale del midollo osseo in topi vivi consentono un'analisi continua e minimamente invasiva dell'attecchimento e della funzionalità delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici (HSPC). Questo approccio risolve un collo di bottiglia critico nell'ematologia preclinica, permettendo una valutazione prospettica e quantitativa delle popolazioni cellulari residenti nel midollo osseo, utilizzando campioni limitati ma ad alto valore. Il metodo aumenta la sicurezza predittiva per gli studi traslazionali e supporta decisioni di portafoglio basate sulla valutazione del rischio nella ricerca su terapie cellulari e malattie ematologiche in fase iniziale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente un'analisi diretta dell'attecchimento delle CSP e dell'output linfatico in una nicchia del midollo osseo fisiologicamente rilevante.
- Permette una riduzione del rischio meccanicistica consentendo il recupero seriale e il fenotipaggio delle cellule trapiantate nel tempo.
- Facilita la validazione funzionale di popolazioni cellulari derivate da editing genico o da pazienti in vivo.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema in vivo validato per valutare l'efficienza di attecchimento e il destino cellulare utilizzando un numero ridotto di campioni.
- Permette una misurazione riproducibile e quantitativa della chimera del midollo osseo e della composizione cellulare dopo il trapianto.
- Consente la standardizzazione dei saggi per flussi di lavoro di xenotrapianto e trapianto di cellule staminali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Consente la modellizzazione di disturbi ematopoietici e interventi terapeutici pertinenti alle malattie.
- Permette il monitoraggio longitudinale dell'attecchimento e della persistenza di cellule umane in modelli di xenotrapianto murino.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali correlando i risultati midollari con esiti funzionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo collega la fase iniziale della scoperta, l'identificazione dei composti promettenti e la validazione preclinica, consentendo un'analisi quantitativa continua dell'attecchimento del midollo osseo in modelli animali vivi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla funzione delle cellule progenitrici ematopoietiche e sulle interazioni con il nicchio attraverso l'accesso diretto al midollo osseo.
- Screening: Fornisce dati quantitativi riproducibili sull'attecchimento per popolazioni cellulari candidate.
- Analisi: Permette misurazioni seriali della chimera midollare e del fenotipo cellulare per studi comparativi.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità dai risultati ottenuti in vitro alla validazione in vivo in modelli pertinenti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma scalabile e riutilizzabile per svariati programmi di ricerca in ematologia e terapie cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nell'attecchimento e nella funzione delle cellule staminali ematopoietiche (HSPC) consentendo un'analisi diretta e seriale del midollo osseo.
- Valore operativo: Standardizza procedure minimamente invasive per studi di trapianto ad alto valore con un numero ridotto di cellule.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione (go/no-go) fornendo dati quantitativi robusti in vivo precocemente nel percorso di sviluppo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei prodotti terapeutici cellulari e ematologici in base agli esiti funzionali in vivo, adeguandola al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze tecniche nella manipolazione di topi, nell'anestesia e nelle tecniche di iniezione intrafemorale.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per l'analisi FACS e l'imaging per la caratterizzazione cellulare successiva.
- Richiede una rigorosa standardizzazione intergruppo dei protocolli di iniezione e aspirazione per garantire la riproducibilità.
- Adattabile a diverse fonti cellulari, inclusi HSPC modificati geneticamente, derivati da pazienti e da sangue del cordone.
- Limitato dalla necessità di un attento monitoraggio post-procedura per garantire il benessere animale e l'integrità dei dati.
