Name: Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dellRNA a singola cellula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Scopri l'isolamento cellulare intestinale da larve di Danio rerio per il sequenziamento RNA a singola cellula. Questo metodo avanzato permette di studiare lo sviluppo gastrointestinale e le disfunzioni associate con precisione.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Amici di Sophia (SSWO WAR-63).

Tutti gli allevamenti e gli esperimenti di zebrafish sono stati condotti secondo le linee guida istituzionali dell'Erasmus MC e la legislazione sul benessere degli animali. L'uso di larve di pesce zebra a 5 giorni dalla fecondazione rientra nella categoria degli esperimenti che non richiedono un'approvazione etica formale, come delineato dalle normative olandesi.
1. Ottenimento di 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) wildtype e larve di tg (phox2bb: GFP)
<ol><li>Avviare l'allevamento di zebrafish wildtype e raccogliere 50 uova in terreno E3 tamponato con HEPES (di seguito denominato E3) in una capsula di Petri da 15 cm. Utilizzare questi pesci come controllo negativo per la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FAC).</li>
	<li>Impostare l'allevamento di pesce zebra tg(phox2bb:GFP) e raccogliere circa 300 uova in E3 in una capsula di Petri da 15 cm.</li>
	<li>Conservare gli ovuli fecondati in E3 (massimo 50 uova/piatto) con un ciclo di luce/buio di 14 ore/10 ore, in un'incubatrice a 28,5 °C.</li>
	<li>A 1 dpf, rimuovere gli ovuli non fecondati e lasciare che quelli fecondati si sviluppino fino a 5 dpf.</li>
	<li>Selezionare le larve di tg(phox2bb:GFP) a 1 dpf.</li>
</ol>2. Dissociazione di larve intere di tipo selvatico
<ol><li>Anestetizzare 5 larve dpf con lo 0,016% di tricaina.</li>
	<li>Tritare 30 zebrafish in piccoli pezzi usando una lama di rasoio in una capsula di Petri contenente 1 ml di soluzione 10x tripsina-EDTA.</li>
	<li>Trasferire il pesce zebra tritato in una provetta per microcentrifuga con un volume totale di 2 ml di soluzione 10x tripsina-EDTA e lasciare sul ghiaccio per 3 ore. Pipettare su e giù con una pipetta P1000 ogni ora per stimolare la dissociazione.</li>
</ol>3. Isolamento intestinale
<ol><li>Posizionare 6-10 larve da 5 dpf anestetizzate con tricaina allo 0,016% in fila, su una piastra di agarosio all'1,8% (0,45 g di agarosio in 25 mL di E3), sotto un microscopio da dissezione</li>
	<li>Metti uno spillo per insetti nella testa del pesce zebra.</li>
	<li>Rimuovere tutto l'E3 rimanente utilizzando un fazzoletto.</li>
	<li>Isolare l'intestino usando un altro spillo per insetti, senza disturbare gli altri organi. Assicurarsi che il tuorlo sia stato rimosso (Figura supplementare S1A).</li>
	<li>Una volta isolato, ispezionare l'intestino e rimuovere tutto il materiale non intestinale (ad es. pelle, grasso, fegato) se necessario.</li>
	<li>Raccogliere l'intestino con una pinzetta e metterlo in una provetta per microcentrifuga, contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con il 10% di siero fetale di vitello (FCS), su ghiaccio. NOTA: È necessario isolare un minimo di 244 intestini, mantenendo il tempo totale di dissezione a 3 ore. Questo è fattibile con due persone che lavorano in parallelo.</li>
</ol>4. Dissociazione intestinale
<ol><li>Subito dopo la dissezione di tutti gli intestini, centrifugare la provetta per microcentrifuga alla massima velocità (13.800 × g) per 30 s.</li>
	<li>Rimuovere il PBS/10% FCS ma lasciarne una piccola quantità (~100 μL) per evitare che l'intestino si secchi. Aggiungere 500 μL di papaina 2,17 mg/mL in HBSS contenente CaCl2 e MgCl2 per dissociare le cellule.</li>
	<li>Attivare la papaina con 2,5 μL di cisteina (1 M).</li>
	<li>Incubare le budella a bagnomaria a 37 °C per 10 min. Pipettare su e giù a metà (dopo 5 minuti) per stimolare la digestione enzimatica dei tessuti.</li>
	<li>Trasferire le cellule in una provetta FACS utilizzando un filtro cellulare da 35 μm, prebagnato con 0,5 mL di PBS/10% FCS.</li>
	<li>Lavare il filtro aggiungendo un totale di 2 mL di PBS/10% FCS con incrementi di 0.5 mL.</li>
	<li>Centrifugare a 700 × g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 300 μL di PBS/10% FCS.</li>
	<li>Aggiungere 1 μg/mL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per marcare le cellule morte (1:1.000) e incubare per 5 minuti per consentirne l'esclusione durante la FACS.</li>
</ol>5. Arricchimento FACS
<ol><li>Utilizzare il campione wildtype per impostare le porte della popolazione cellulare ordinata registrando 3.000 cellule sul citometro a flusso (Figura supplementare S1B-E).</li>
	<li>Utilizzare un ugello da 100 μm, impostare la precisione di ordinamento sulla purezza e inserire la provetta di raccolta contenente 200 μL di PBS/5% FCS nella macchina FACS.</li>
	<li>Caricare la sospensione cellulare dell'intestino e selezionare le singole cellule vive (DAPI-negative) nella provetta di raccolta (Figura 2C), escludendo i doppietti (Figura 2B) e le cellule morte (Figura 2C). NOTA: Per il pesce zebra tg(phox2bb), la proporzione di cellule GFP+ viene controllata solo come riferimento, poiché tutte le singole cellule vive vengono ordinate.</li>
	<li>Tenere la provetta di raccolta su ghiaccio dopo lo smistamento delle cellule.</li>
	<li>Contare la sospensione cellulare con un emocitometro, incluso un controllo di vitalità con blu di tripano. Se la fattibilità è almeno dell'80%, continuare con il passaggio successivo.</li>
	<li>Le cellule sono ora pronte per l'elaborazione per scRNAseq (cioè la piattaforma 10x Genomics Chromium). Utilizzare circa 20.000 cellule per campione.</li>
</ol>

Elaborazione di cellule intestinali da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a cellula singola

<ol><li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system%2C+immune+system%2C+and+epithelium+eesponses%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSitrin%2C+M+%22The+Gastrointestinal+System%22">The Gastrointestinal System</a>. , (2014).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li>
<li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li>
<li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li>
<li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li>
<li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuromyopathies%3A+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li>
<li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg%28-8.3bphox2b%3AKaede%29+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li>
<li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070(2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290(2022).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li>
<li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).</li>
<li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKline%2C+M+%22Fishing+for+answers%3A+Isolating+enteric+neurons+and+identifying+putative+ENS+mutants%22">Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants</a>. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).</li>
<li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li>
<li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Qui, presentiamo un metodo per l'isolamento e la dissociazione dell'intestino di 5 larve di pesce zebra dpf utilizzando FACS. Con questo metodo, diversi tipi di cellule intestinali sono stati raccolti e analizzati con successo da scRNA-seq, utilizzando la piattaforma 10x Genomics Chromium. Abbiamo selezionato la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), in quanto volevamo un'indicazione che anche le cellule ENS vitali sarebbero state isolate (Figura 2D). Tuttavia, è importante notare che ...

Il tratto gastrointestinale (GI) è un sistema complesso che svolge un ruolo fondamentale nella salute e nel benessere generale. È responsabile della digestione e dell'assorbimento dei nutrienti, nonché dell'eliminazione dei prodotti di scarto 1,2. Il tratto gastrointestinale è composto da più tipi di cellule, tra cui cellule epiteliali, cellule muscolari lisce, cellule immunitarie e sistema nervoso enterico (ENS), che comunicano strettamente tra loro per regolare e mantenere la corretta funzione intestinale 3,4,5. I difetti nello sviluppo del tratto gastrointestinale possono avere effetti di vasta portata su vari aspetti come l'assorbimento dei nutrienti, la composizione del microbiota, l'asse intestino-cervello e l'ENS, portando a diversi disturbi neuromuscolari enterici, come la malattia di Hirschsprung e la pseudo-ostruzione intestinale cronica 6,7. Questi disturbi sono caratterizzati da una grave dismotilità intestinale causata da alterazioni in varie cellule chiave, come le cellule interstiziali di Cajal, le cellule muscolari lisce e l'ENS 6,8,9. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale sono ancora poco compresi.
Il pesce zebra è un prezioso organismo modello per lo studio dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale grazie al suo rapido sviluppo embrionale, alla trasparenza durante le fasi embrionali e larvali e alla trattabilità genetica 10,11,12,13,14. Sono disponibili numerose linee di zebrafish transgenici che esprimono proteine fluorescenti. Un esempio di tale linea è il pesce zebra tg(phox2bb:GFP), comunemente usato per studiare l'ENS, poiché tutte le cellule phox2bb+, compresi i neuroni enterici, sono marcate15,16. Qui, utilizzando la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), presentiamo un metodo per l'isolamento intestinale di larve 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>10x Tripsina (0,5%)-EDTA (0,2%)Sigma</td><td></td> <td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Provetta a fondo tondo da 5 mL con tappo per filtro cellulare</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Round-Bottom Tube 5mL (provette FACS) tappo a scatto</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger v3.0.2</td><td>10X Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Olympus SZX16</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III selezionatrice</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS con CaCl2 and MgCl2</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>Perni per insetti Strumenti per la</td><td>scienza fine</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteina</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>MS-222, Tricaina</td><td>Supelco</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>Seurat v3</td><td>Stuart et&nbsp;al. (2019)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tripan blu&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Gatto#T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'rna a singola cellula

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

Il tratto gastrointestinale (GI) svolge una serie di funzioni essenziali per la vita. I difetti congeniti che ne influenzano lo sviluppo possono portare a disturbi neuromuscolari enterici, evidenziando l'importanza di comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale. In questo studio, presentiamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di zebrafish a 5 giorni dopo la fecondazione per ottenere cellule vive e vitali che possono essere utilizzate per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Questo protocollo si basa sulla dissezione manuale dell'intestino del pesce zebra, seguita dalla dissociazione enzimatica con la papaina. Successivamente, le cellule vengono sottoposte a selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e le cellule vitali vengono raccolte per scRNA-seq. Con questo metodo, siamo stati in grado di identificare con successo diversi tipi di cellule intestinali, tra cui cellule epiteliali, stromali, del sangue, muscolari e immunitarie, nonché neuroni enterici e glia. Pertanto, lo consideriamo una risorsa preziosa per studiare la composizione del tratto gastrointestinale in salute e malattia, utilizzando il pesce zebra.

Con questo protocollo, abbiamo ottenuto con successo l'isolamento e la dissociazione di interi intestini da 5 larve dpf. Utilizzando la papaina come enzima di dissociazione, abbiamo migliorato significativamente la vitalità cellulare, consentendo la cattura di 46.139 eventi che coinvolgono singole cellule vitali (6,4% di tutte le cellule) su 244 intestini isolati (Figura 2A). Le larve intere di tipo selvatico sono state utilizzate come controllo per garantire che il processo di selezione fos...

Qui, descriviamo un metodo per l'isolamento intestinale da larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione, per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

La nostra ricerca mira a indagare i cambiamenti trascrittomici che si verificano durante lo sviluppo e la disfunzione gastrointestinale nelle larve di zebrafish. Qui, forniamo un nuovo protocollo che consente l'isolamento di diversi tipi di cellule all'interno dell'intestino del pesce zebra, che ha potenziali applicazioni nella comprensione della salute e delle malattie gastrointestinali. Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse nell'esplorare l'interazione tra il sistema nervoso enterico e altri tipi di cellule intestinali durante lo sviluppo e la malattia.La comprensione di queste dinamiche complesse utilizzando tecniche avanzate come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha il potenziale per rivelare informazioni critiche sulle neuromiopatie enteriche, portando a diagnosi e trattamenti più precisi. Utilizzando questo protocollo, abbiamo identificato con successo vari tipi di cellule intestinali, tra cui epiteliali, stromali, del sangue, dei muscoli, delle cellule immunitarie e persino dei neuroni enterici e della glia, che non sono mai stati catturati prima a questa quantità utilizzando approcci simili. Pertanto, forniamo una tecnica affidabile per studiare la composizione gastrointestinale durante lo sviluppo e la disfunzione.

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Biologia dello sviluppo

L'isolamento di alta qualità, intatto RNA è un passo essenziale in molti protocolli di laboratorio. In questo studio dimostriamo estrazione di RNA da embrioni di zebrafish tutto e sintesi del DNA per la successiva applicazione in diverse procedure sperimentali inclusa l'analisi microarray di espressione genica.

Isolamento RNA da embrionali Sintesi Zebrafish e cDNA per l&#39;analisi di espressione genica

Questo video descrive un protocollo per isolare neuroni, macrofagi e microglia dal cervello larvale di pesce zebra interrompendo meccanicamente il tessuto cerebrale. Le popolazioni cellulari purificate possono essere ulteriormente utilizzate per l'analisi genomica.

Isolamento delle cellule cerebrali dalle larve di pesce zebra: una tecnica per ottenere neuroni, macrofagi e microglia intatti dal tessuto cerebrale del pesce zebra

Questo protocollo descrive un metodo per isolare singole cellule da embrioni di zebrafish, arricchimento per cellule di interesse, catturare cellule di zebrafish in sistemi multiplex a singola cellula basati su microfluidica e valutare l'espressione genica da singole cellule.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare il tessuto gonadico di zebrafish larvale, che faciliterà le indagini della differenziazione sessuale zebrafish e manutenzione.

La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue

Qui, descriviamo una tecnica per isolare le cellule popolazione lato da un modello zebrafish di cellule T myc indotta da leucemia linfoblastica acuta (T-ALL). Questo saggio popolazione lato è altamente sensibile ed è descritta per zebrafish T-ALL, ma può essere applicabile ad altri tipi di cellule zebrafish maligne e non maligne.

Isolamento della popolazione Side di Myc-indotta delle cellule T leucemia linfoblastica acuta in Zebrafish

Questo protocollo presenta un approccio per l'analisi del trascrittoma intero da embrioni di zebrafish, larve, o ordinato cells. Includiamo isolamento di RNA, analisi dei percorsi dei dati RNASeq e convalida qRT-PCR-basata di cambiamenti di espressione genica.

Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

Vi presentiamo un protocollo per isolare i neuroni, i macrofagi e microglia da cervelli di zebrafish larvale in condizioni fisiologiche e patologiche. All'isolamento, RNA è Estratto da queste cellule per analizzare il loro profilo di espressione genica. Questo protocollo consente la raccolta di RNA di alta qualità per l'esecuzione dell'analisi a valle come qPCR e trascrittomica.

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

Descriviamo una tecnica per profilare i microRNA nei primi embrioni di topo. Questo protocollo supera la sfida dell'input a bassa cellula e del piccolo arricchimento dell'RNA. Questo saggio può essere utilizzato per analizzare i cambiamenti nell'espressione del miRNA nel tempo in diversi lignaggi cellulari dell'embrione del topo precoce.

Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

L'isolamento dei nuclei singoli si basa sulla dissociazione e sulla permeabilizzazione a base di detersivo della membrana cellulare, passaggi che necessitano di ottimizzazione e soggetti a introdurre artefatti tecnici. Dimostriamo un protocollo detergente e privo di enzimi per un rapido isolamento dei nuclei intatti direttamente dall'intero tessuto, producendo nuclei adatti per singolo nucleo RNA-seq (snRNA-seq) o ATAC-seq.

Isolamento nuclei dal tessuto intero utilizzando un metodo detergente e senza enzimi

Qui, presentiamo un metodo per allineare e criosezionare più campioni di larve di Zebrafish (Danio rerio) e raccoglierli su un singolo vetrino per l'analisi trascrittomica spaziale.

Disposizione spazialmente compatta delle sezioni larvali di zebrafish per l'analisi trascrittomica spaziale

Scopri l'isolamento cellulare intestinale da larve di Danio rerio per il sequenziamento RNA a singola cellula. Questo metodo avanzato permette di studiare lo sviluppo gastrointestinale e le disfunzioni associate con precisione.

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

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