Espressione e purificazione ad alto rendimento di vettori di soluti umani per studi strutturali e biochimici
29 settembre 2023
Gli studi strutturali e biochimici dei trasportatori di membrana umani richiedono quantità di milligrammi di proteine stabili, intatte e omogenee. Qui descriviamo metodi scalabili per lo screening, l'espressione e la purificazione di trasportatori di soluti umani utilizzando geni ottimizzati per i codoni.
I vettori di soluti, o SLC, sono responsabili dell'assorbimento dei nutrienti e sono coinvolti nelle malattie umane. Tuttavia, ci sono pochi farmaci che prendono di mira gli SLC perché sono scarsamente studiati. Abbiamo sviluppato approcci efficienti per clonare, esprimere e purificare gli SLC.
Il nostro flusso di lavoro produce proteine pure, consentendo studi biochimici e strutturali e, in ultima analisi, fornisce approfondimenti per le campagne di scoperta di farmaci. Con i numerosi ruoli nei processi biologici, nelle malattie e nella somministrazione di farmaci, le SLC hanno ricevuto sempre più attenzione e sono diventate bersagli terapeutici interessanti. I progetti pubblici e privati ReSOLUTE IMI hanno generato risorse e dati ad accesso aperto per consentire nuove scoperte nella funzione, nella fisiologia, nella patologia e nel targeting terapeutico di SLC.
Tradizionalmente, le SLC erano difficili da studiare in quanto sono proteine integrali di membrana con vari substrati e diversi meccanismi di trasporto. Recentemente, Cryo-EM, il sistema di espressione BacMam e nuovi reagenti di solubilizzazione hanno portato a un cambiamento radicale nella loro caratterizzazione. I campioni di proteine pure sono necessari per gli studi biochimici e strutturali.
Nell'uomo, i vettori di soluti hanno spesso una scarsa resa quando sono sovraespressi e instabili quando vengono purificati. Pertanto, in passato, ogni obiettivo richiedeva anni per sviluppare singole strutture per produrre il campione proteico per le applicazioni a valle. Il nostro metodo è ottimizzato per lo studio parallelo ed economico di più bersagli o costrutti di un singolo bersaglio.
Pertanto, bilancia attentamente la flessibilità sperimentale, i costi, i tempi e le risorse di laboratorio. Inoltre, offriamo l'accesso aperto a tutti i nostri protocolli e risorse in questo articolo e nel portale web ReSOLUTE.
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Panoramica
Questo studio si concentra sui trasportatori di soluti (SLC), che sono cruciali per l'assorbimento dei nutrienti e sono associati a diverse malattie umane. I ricercatori hanno sviluppato metodi efficienti per il clonaggio, l'espressione e la purificazione degli SLC, consentendo ulteriori studi biochimici e strutturali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Farmacologia
Sfondo
- I trasportatori di soluti svolgono un ruolo fondamentale nel trasporto dei nutrienti.
- Sono coinvolti in numerose malattie umane.
- Nonostante la loro importanza, pochi farmaci agiscono sui SLC a causa della ricerca ancora limitata.
- Recenti iniziative hanno avuto come obiettivo approfondire la comprensione delle funzioni dei SLC.
Scopo dello studio
- Sviluppare metodi scalabili per lo studio degli SLC umani.
- Produrre proteine pure per analisi biochimiche e strutturali.
- Facilitare gli sforzi di scoperta di farmaci mirati agli SLC.
Metodi Utilizzati
- Clonaggio di geni ottimizzati per il codice genetico per le SLC.
- Espressione delle proteine SLC in sistemi appropriati.
- Purificazione delle proteine per ottenere campioni omogenei.
- Utilizzo di risorse aperte provenienti dai progetti IMI per l'accesso ai dati.
Risultati principali
- Sono stati sviluppati metodi efficienti di clonazione ed espressione.
- Sono state ottenute proteine SLC ad alta purezza per studi successivi.
- Lo studio fornisce informazioni sulle funzioni delle proteine SLC e sul loro potenziale terapeutico.
- I dati generati sostengono la ricerca in corso sulla fisiologia e patologia delle proteine SLC.
Conclusioni
- I metodi sviluppati migliorano in modo significativo lo studio dei SLC.
- Le informazioni ottenute potrebbero portare a nuove strategie per la scoperta di farmaci.
- Una maggiore comprensione dei SLC potrebbe migliorare il targeting terapeutico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I trasportatori di soluti umani (SLC) rappresentano una vasta classe sottovalutata di trasportatori di membrana con un notevole potenziale terapeutico, ma la loro caratterizzazione strutturale e biochimica ha subito ritardi a causa delle difficoltà legate all'espressione e alla purificazione. Questo flusso di lavoro ad alto rendimento consente la produzione parallela e scalabile di proteine SLC pure e funzionalmente attive, affrontando direttamente un collo di bottiglia fondamentale nella fase iniziale della scoperta di farmaci e nella validazione dei bersagli. Facilitando l'accesso a campioni di SLC di alta qualità, il metodo supporta la riduzione del rischio su tutta la linea e accelera la valutazione di questi bersagli per interventi farmacologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette un'analisi sistematica della funzione e della specificità del substrato dei trasportatori SLC.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico fornendo una proteina strutturalmente integra e biochimicamente attiva per la verifica delle ipotesi.
- Facilita la validazione del target attraverso la produzione riproducibile di costrutti SLC multipli in parallelo.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce proteine SLC ad alta purezza, adatte a saggi biochimici e di trasporto quantitativi.
- Standardizza l'input proteico per analisi di screening ad alto rendimento e studi di interazione a valle.
- Migliora la riproducibilità e la scalabilità dei saggi garantendo una qualità e un rendimento proteico costanti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Permette studi strutturali che forniscono informazioni sui meccanismi dei trasportatori rilevanti per le malattie e sulla loro druggabilità.
- Fornisce preparazioni proteiche stabili per studi sull'interazione e sul trasporto di piccole molecole, in linea con lo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Supporta la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, generando dati sulla stabilità e attività delle proteine.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro si integra nell'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione dei composti promettenti, fornendo reagenti fondamentali sia per studi meccanicistici che per campagne di screening.
- Biologia della scoperta: Fornisce proteine SLC di alta qualità per analisi funzionali e strutturali guidate da ipotesi.
- Screening: Consente lo sviluppo di saggi robusti e lo screening di composti mediante impieghi proteici riproducibili.
- Analisi: Fornisce risultati quantitativi come concentrazione proteica, purezza e monodisperseità per il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'identificazione di SLC rilevanti per le malattie e la loro modulazione farmacologica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma scalabile e riutilizzabile per la valutazione di target SLC in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella selezione dei bersagli SLC e riduce l'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Razionalizza la produzione proteica mediante protocolli standardizzati e ad alto rendimento.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avanzamento o abbandono e migliora l'allocazione del capitale consentendo una selezione precoce dei bersagli.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei bersagli SLC in base al rischio per l'avanzamento nei processi di screening e preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'espressione, purificazione e caratterizzazione analitica delle proteine di membrana.
- Necessita dell'accesso a sistemi di espressione eucariotici, infrastrutture per la cromatografia e strumenti per l'analisi proteica.
- Traggo beneficio da protocolli standardizzati e risorse ad accesso aperto per garantire riproducibilità tra diversi gruppi di ricerca.
- È adattabile a diversi membri della famiglia SLC e a diversi disegni di costrutto, favorendo un'ampia applicabilità.
- La stabilità e il rendimento della proteina possono variare in base al bersaglio, richiedendo un'ottimizzazione del costrutto e del tampone.
