Name: Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nellintestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Scopri l'interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino usando un modello gnotobiotico. Questo protocollo standardizzato aiuta a studiare le dinamiche ospite-batteriofago in vivo e il ruolo dei fagi nella salute intestinale.

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Gli autori riconoscono che la terra su cui hanno eseguito questa ricerca è il territorio tradizionale, ancestrale e non ceduto della nazione xwməθkwəy̓əm (Musqueam). Il terreno su cui si trova è sempre stato un luogo di apprendimento per il popolo Musqueam, che per millenni ha tramandato la sua cultura, la sua storia e le sue tradizioni da una generazione all'altra in questo sito. Incoraggiamo gli altri a conoscere meglio le terre native in cui vivono e lavorano in https://native-land.ca. Gli autori riconoscono il sostegno del Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) Canadian Graduate Scholarships - Master's (NP), Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, a MH), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants Program (RGPIN-2019-04591 to C.T., RGPIN-2016-04282 to LCO), Canadian Institute for Advanced Research / Humans and the Microbiome (FL-001253 Appt 3362, a C.T.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, a C.T.), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 a LCO) e la Fondazione canadese per l'innovazione (34673 a LCO e 38277 a CT). Siamo grati per il supporto tecnico dell'UBC Centre for Disease Modelling e ubcFLOW, che è supportato dall'UBC GREx Biological Resilience Initiative, e ai membri dei laboratori Osborne e Tropini per le discussioni critiche e la valutazione del manoscritto. La Figura 1A e la Figura 2A sono state create utilizzando Biorender.com.

Esplorazione delle dinamiche dei fagi-batteri intestinali in modelli murini utilizzando il fago T4

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I batteriofagi, o fagi, sono virus che infettano e uccidono i batteri con specificità a livello di specie e ceppo1. I fagi svolgono un ruolo importante all'interno di comunità batteriche complesse come il microbiota intestinale, dove sono stati implicati nella regolazione delle dinamiche di popolazione e nel guidare la fitness batterica2. Nel corso dell'ultimo decennio, c'è stato un rinnovato interesse per la ricerca sui fagi a causa dell'aumento dei patogeni resistenti agli antimicrobici3 e del potenziale della terapia fagica come strategia di trattamento alternativa. Negli ultimi anni, i cocktail di fagi litici sono stati utilizzati per via endovenosa con un certo successo nelle infezioni settiche batteriche gravi e resistenti agli antibiotici nell'uomo 3,4. La terapia fagica orale è stata anche proposta come potenziale alternativa agli antibiotici per il trattamento delle infezioni intestinali e delle infiammazioni. Inoltre, i fagi sono stati implicati nel successo dei trapianti di filtrato fecale (FFT), che sono preparati del microbiota fecale che sono stati filtrati per rimuovere i batteri, nel trattamento dell'infezione ricorrente da Clostridioides difficile (rCDI)5,6, dei disturbi infiammatori intestinali (IBD)7,8 e dell'enterocolite necrotizzante nei suini prematuri9. Alla luce di questi risultati, è importante considerare le interazioni sia tra i fagi e il microbiota intestinale, sia tra i fagi e l'ospite mammifero, poiché l'aggiunta di nuovi fagi in una comunità preesistente può avere effetti indiretti sulla comunità nel suo complesso, e non solo sui suoi batteri bersaglio 2,10.
Lo studio delle interazioni dei fagi con i loro batteri bersaglio in vitro si è dimostrato utile per comprendere i meccanismi e gli impatti delle interazioni tra fagi e batteri nell'intestino. In questo contesto, è stato dimostrato che i fagi T4 specifici per Escherichia coli dell'ordine Caudovirales richiedono domini simili alle immunoglobuline (Ig) situati all'interno di proteine del capside esterno (Hoc) altamente antigeniche sulla superficie del virione per aderire al muco intestinale11. Inoltre, i saggi transwell hanno dimostrato che i fagi T4 sono in grado di interagire con colture cellulari epiteliali e di traslocare attraverso gli strati cellulari mediante macropinocitosi12,13. Questi risultati supportano l'ipotesi che i fagi possano interagire con il loro ospite metazoico, anche se non sono in grado di infettare le cellule eucariotiche. Questi modelli, sebbene utili, mancano dell'intera gamma di interazioni complesse che si verificano in un ecosistema intestinale che sono necessarie per un'esplorazione completa dell'interazione tripartita tra fagi, batteri e l'ospite metazoo.
I modelli murini sono uno strumento importante per lo studio dei fagi all'interno di ambienti complessi. Un'applicazione auspicabile della somministrazione di fagi è come strategia alternativa per il trattamento di infezioni resistenti agli antimicrobici o patobionti associati a malattie infiammatorie croniche, tra cui l'IBD. Tuttavia, la letteratura emergente suggerisce che il comportamento dei fagi in vitro non rappresenta pienamente le funzioni in vivo. Buttimer et al.14 hanno dimostrato che un cocktail di fagi era in grado di esaurire i batteri bersaglio in un consorzio di microbiota umano semplificato in vitro, ma non poteva essere replicato in vivo in topi gnotobiotici colonizzati con lo stesso consorzio batterio-fago. Inoltre, in un microbioma murino convenzionale, il fago T7 ha portato a una deplezione selettiva dei suoi batteri intestinali bersaglio, sebbene sia stato osservato un graduale recupero nel tempo, indicativo di resistenza evoluta15. Altri studi hanno dimostrato la coesistenza di fagi somministrati per via orale e dei loro ceppi batterici bersaglio in vivo 2,16. Infatti, al di là della coesistenza fagi/batteri, la somministrazione di fagi ha portato a cambiamenti diffusi nella composizione e nella funzione complessiva della comunità del microbiota 2,16. Ciò è rilevante in contesti patologici poiché diversi studi hanno trovato associazioni tra l'aumento dell'abbondanza relativa di Caudovirales e IBD 7,8,17 che erano indipendenti dai cambiamenti nell'abbondanza batterica7. Non è noto se questo sia un fattore trainante o una conseguenza della patogenesi della malattia.
L'obiettivo storico dell'indagine sui fagi è stato la relazione tra un fago e il suo batterio bersaglio. Tuttavia, è anche importante considerare le potenziali interazioni tra il fago e la mucosa, l'epitelio e il sistema immunitario dell'ospite metazoico. Tutte queste interazioni svolgono un ruolo importante nella risposta globale all'infezione fagica intestinale. Per dimostrarlo, i fagi sono stati studiati utilizzando topi privi di germi (GF) per chiarire il loro impatto sul sistema immunitario senza interferenze da parte del microbiota8. In questo sistema, gli acidi nucleici fagici sono stati rilevati dai recettori Toll-like (TLR) situati all'interno degli endosomi delle cellule immunitarie fagocitiche (macrofagi e cellule dendritiche). Ciò ha attivato la segnalazione a valle e stimolato la produzione dipendente dalle cellule T di interferone (IFN)-γ8 o IFNdi tipo I 18. Inoltre, Fluckiger et al.19 hanno implicato le cellule T CD8+ della memoria nel riconoscimento degli antigeni codificati dai fagi (profagi), che hanno portato alla cross-reattività delle cellule T con gli antigeni tumorali, con conseguente riduzione del carico tumorale. Infine, la produzione di anticorpi fagico-specifici è stata documentata in studi sui topi in cui i fagi sono stati somministrati a modelli animali in modo continuo attraverso l'acqua potabile 8,20 o mediante somministrazione orale ripetuta per diversi mesi20, dimostrando la capacità delle proteine fagiche di promuovere le risposte immunitarie umorali. Sebbene queste modalità di inoculazione dei fagi consentano un innesco ottimale e continuo del sistema immunitario, potrebbero non rappresentare le interazioni naturali tra i fagi e l'ambiente intestinale, né la cinetica della terapia fagica applicata per via orale. Finora, un numero limitato di studi ha esaminato le interazioni del fago con una singola specie batterica in modelli murini monocolonizzati21. Tuttavia, i topi monocolonizzati si sono dimostrati fondamentali nel decifrare gli effetti microbo-specifici delle singole specie sul tratto gastrointestinale (GI) e sullo sviluppo immunitario 22,23,24 e possono ancora rivelarsi utili nella comprensione delle interazioni tripartite tra i fagi, i loro batteri bersaglio e l'ospite metazoico.
Entusiasmantemente, c'è ancora molto da imparare sulle interazioni tra fagi intestinali e batteri commensali intestinali, nonché sulle interazioni che si verificano tra l'ospite metazoico e i fagi che risiedono al suo interno. Questo protocollo fornisce una serie di procedure per studiare il fago T4 isolato e la sua controparte batterica, E. coli (K-12, BW25113), utilizzando un modello murino gnotobiotico. Queste procedure standardizzate forniscono anche una base per l'ottimizzazione di altre diadi fagi/batteri adattando i parametri di crescita alle coppie di interesse. I metodi qui descritti delineano: (1) Preparazione di lisati fagici e veicoli T4 per il gavage orale di topi; (2) Somministrazione orale di fago T4 a topi gnotobiotici monocolonizzati da E. coli ; (3) Monitoraggio dei livelli di fagi T4 nelle feci e nei tessuti di topo nel tempo.
Per i risultati rappresentativi qui presentati, i lisati fagici T4 purificati sono stati propagati da stock di banche fagiche mantenute dal Rohwer Lab. Il metodo Phage-on-Tap per la propagazione del fago T4 è stato adattato25, come indicato in questo protocollo. Il metodo produce titoli fagici ad alto titolo, a basso contenuto di endotossine entro tre giorni. Utilizzando questo approccio, sono stati raccolti di routine 10 ml di ≥10 10 unità formanti placca (pfu)/mL di fago T4 con < 0,5 unità di endotossine (EU)/mL. I livelli raccomandati di endotossine per la somministrazione orale o endovenosa nei topi sono rispettivamente ≤ 20 EU/mL e ≤ 5 EU/kg/h (o 0,1 EU somministrati in 1 ora per un topo di 20 g), il che lo rende un metodo adatto di preparazione dei fagi per l'inoculazione in vivo . Tutti gli stock fagici sono stati conservati a 4 °C in tampone fagico salino di magnesio (SM) (ricetta fornita al punto 1.1.5.1). E. coli è stato coltivato in terreni LB. Per varie coppie fagi-batteri, diversi terreni di coltura e condizioni di crescita possono essere adattati da questo protocollo. I fagi possono anche essere reperiti dall'ambiente, come le acque reflue, l'acqua marina, il suolo e il contenuto intestinale e possono essere isolati e purificati secondo Sambrook e Russell26 prima della preparazione utilizzando le condizioni di crescita e propagazione appropriate per ciascuna coppia fago-ospite di interesse25. In alternativa, i fagi possono essere ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) o da banche di fagi.

<table><tbody><tr><td>1-ottanolo (99%)</td><td>Thermofisher</td><td>CAAAA15977-AP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml PES Steriflip Unità filtranti sottovuoto monouso sterili</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td>SCGP00525</tr><tr><td>Agarosio (Basso EEO/Multiuso/Grado di Biologia Molecolare)</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di filtraggio centrifugo Amicon® 100kDa Ultra-15, Ultracel-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer® Tubi, SST</td><td>BD Medical</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>Gabbie ermetiche per bioesclusione (gabbie ISO)&nbsp;</td><td>Techiplast</td><td>1245ISOCAGE</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade; Termociclatore con modulo di reazione rapida a 96 pozzetti</td><td>BioRad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di calcio diidrato (cristalli bianchi in polvere)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Tappi Serrature per provetta da 1,5 ml 100/conf</td><td>Andwin Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>16812612</tr><tr><td>Cloroformio (etanolo come conservante/certificato ACS)</td><td>Perline</td> d'acciaio rivestite di rame Fisher <td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>(4,5 mm)</td><td>Crosman Corporation</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit Tessuti (50)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di sale disodico di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), per biologia molecolare, 0,5 M in H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&commercio; Agar, polvere / fiocchi, Fisher BioReagenti&commercio; &nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&trade; Terreni di microbiologia: brodo LB (polvere) - Lennox&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Miscela qPCR FastMix® verde, 1250 rxns</td><td>QuantaBio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>Filtri HEPA per coperchi isocage, FILTRI H14 AUTOCLAVABILI PER LINEA ISO IRRADIATI</td><td>Techiplast</td><td>UISOHEPAXTBOX-300</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Agitatore incubato</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>8354-30-0009</td><td></td></tr><tr><td>Terreni di microbiologia: brodo LB (polvere) - Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga con tappo a scatto di bloccaggio, 2 ml</td><td>Fisher</td><td>14-666-315</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola sigillante Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Scorte di fagi</td><td>Carolina Biological Supply&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PicoLab&reg; Dieta del topo 20 EXT</td><td>LabDiet</td><td>5R58</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; Kit Quant Endotossina Cromogenica</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A39552S</tr><tr><td>RNasi A (17.500 U)</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Set di DNasi senza RNasi</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (polvere bianca fine)</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (cristallino/certificato ACS)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (sonda modello CL-18; fonte di alimentazione modello FB50)</td><td>Fisher scentific&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Isolatore sterile a film flessibile&nbsp;</td><td>Classe Biologicamente Pulito&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&commercio; Disinfettante per gel DNA sicuro</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Primer fagico T4, in avanti (CCACACACATAGCGCGAGTATAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Primer fagico T4, in avanti (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, soluzione 1M, pH 8.0, grado di biologia molecolare, termo scientifico ultrapuro</td><td>.</td><td></td><td></td>AAJ22638AE</tr><tr><td>Acqua, (senza DNASI, RNASI)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2484100</td><td></td></tr></tbody></table>

interazione tra batteriofago t4 ed e. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

I batteriofagi (fagi) sono virus che infettano i batteri con specificità a livello di specie e ceppo e sono le entità biologiche più abbondanti in tutti gli ecosistemi conosciuti. All'interno delle comunità batteriche, come quelle che si trovano nel microbiota intestinale, i fagi sono implicati nella regolazione delle dinamiche di popolazione del microbiota e nel guidare l'evoluzione batterica. Nell'ultimo decennio c'è stato un rinnovato interesse per la ricerca sui fagi, in parte a causa delle capacità di uccisione dei fagi litici specifici per l'ospite, che offrono uno strumento promettente per contrastare la crescente minaccia dei batteri resistenti agli antimicrobici. Inoltre, recenti studi che dimostrano che i fagi aderiscono al muco intestinale suggeriscono che potrebbero avere un ruolo protettivo nel prevenire l'invasione batterica nell'epitelio sottostante. È importante sottolineare che, come i microbiomi batterici, i fageomi interrotti sono stati associati a esiti peggiori in malattie come le malattie infiammatorie intestinali. Studi precedenti hanno dimostrato che i fagi possono modulare il microbioma degli animali e degli esseri umani attraverso trapianti di filtrato fecale, a beneficio della salute dell'ospite. Con questa recente ondata di ricerca arriva la necessità di stabilire e standardizzare protocolli per lo studio dei fagi nel contesto del microbioma intestinale. Questo protocollo fornisce una serie di procedure per studiare i fagi T4 isolati e il loro ospite batterico, Escherichia coli, nel contesto del tratto gastrointestinale murino. I metodi qui descritti delineano come partire da un lisato fagico, somministrarlo ai topi e valutare gli effetti sui livelli di ospite batterico e fagico. Questo protocollo può essere modificato e applicato ad altre coppie fago-batterio e fornisce un punto di partenza per lo studio delle dinamiche ospite-fago in vivo.

Per studiare le interazioni tra la diade fago T4/E. coli nell'intestino murino, sono stati preparati, puliti e purificati i lisati del fago T4 e del veicolo (Figura 1A). I lisati fagici T4 sono stati titolati mediante test a placca e diluiti a 2 x 107 pfu/mL (2 x 106 pfu/topo) in tampone SM. I lisati del veicolo sono stati anche titolati per confermare l'assenza di fagi vitali e diluiti nello stesso volume di tampone SM del lisato fagico T4. I livelli di endotossine sono stati quantificati in lisati diluiti utilizzando un kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche. Il fago T4, il fago inattivato dal calore e i lisati veicolo presentavano livelli di endotossine inferiori a livelli accettabili per l'acqua potabile (&lt;20 EU/mL)25 (Figura 1B). Poiché il lisato veicolo aveva una quantità di endotossina simile a quella del lisato fagico T4, è stato ritenuto un controllo adatto. Il lisato fagico inattivato termicamente (2 x 107 ufu/mL prima del trattamento termico) presentava meno endotossine sia del veicolo che del lisato fagico T4. Secondo le istruzioni del kit, i campioni che erano stati trattati con 1-ottanolo sono stati testati per l'inibizione del test mediante l'aggiunta di uno standard di endotossina al lisato del veicolo (veicolo a punta), per dare una concentrazione finale di 0,5 EU/mL. I livelli di endotossine del veicolo aumentati meno i livelli di endotossina del veicolo misuravano 0,5 EU/mL ±25%, secondo le raccomandazioni del produttore (Figura 1B). Ciò ha dimostrato che l'1-ottanolo è stato rimosso con successo e che non vi era alcuna inibizione del saggio causata dai lisati che potesse interferire con i risultati del test.
Coli I topi C57BL/6 monocolonizzati K-12 (BW25113) sono stati allevati all'interno di un isolatore vinilico sterile a film flessibile in condizioni gnotobiotiche (Figura 2A). I topi della generazione F0 sono stati colonizzati con E. coli attraverso la sua aggiunta al loro ambiente e al co-housing. Solo la progenie (generazione F1 e F2) che è stata colonizzata con E. coli dalla nascita attraverso la trasmissione verticale e il co-housing sono state utilizzate per gli esperimenti. Questa strategia ha controllato i cambiamenti nel sistema immunitario, la produzione di muco e lo sviluppo del tratto gastrointestinale che si verifica in risposta all'inoculazione batterica22,37, consentendo quindi la misurazione dei cambiamenti che si verificano solo a causa dell'introduzione dei fagi. Una volta maturati, i topi sperimentali sono stati trasferiti in isogabbie sterili, dove ciascuno di essi ha ricevuto 2 x 106 pfu di fago T4 o un volume uguale di lisato veicolo per via orale a 6-8 settimane di età. L'abbondanza di fagi T4 ed E. coli è stata monitorata per quattro settimane mediante raccolta di pellet fecali e saggi di placcatura spot rispettivamente su agar allo 0,5% (morbido) o all'1,5%. Nel corso di questo esperimento, il fago T4 e l'E. coli sono stati in grado di coesistere senza che nessuna delle due popolazioni si esaurisse (Figura 2B, C). La somministrazione orale di fago T4 a dosi più basse di 2 x 102 e 2 x 104 pfu/topo non ha ridotto la capacità del fago T4 di colonizzare l'intestino rispetto a 2 x 106 pfu (Figura 2D). Allo stesso modo, non è stato osservato un effetto dose-dipendente dell'inoculazione di T4 sui livelli di E. coli (Figura 2E).
È importante sottolineare che la coerenza nella placcatura tra i campioni è risultata cruciale per il conteggio della placca. Ad esempio, quando si aggiungono batteri nell'agar morbido, è stato determinato che la densità dei batteri ha influenzato notevolmente l'esito del test. L'aggiunta di E. coli che è stata sottocoltivata per 1 ora, 1,5 ore o 2 ore, ha comportato un numero inferiore di placcature rispetto all'aggiunta di E. coli sottocoltivato per 2,8 ore o più. Inoltre, la quantificazione della placca si è stabilizzata a ~1 x 109 ufc/mL quando E. coli è stato sottoposto a subcoltura per 2,8-16 ore (durante la notte), con un aumento di circa 5 volte rispetto al valore calcolato da una subcoltura di 1 ora (~2 x 108 ufu/ml) (Figura 3A). Piuttosto che sub-colturare, i batteri bersaglio possono essere inoculati in agar molle da colture notturne. In questo caso, il volume della coltura di E. coli di 16 ore (durante la notte) che è stata inoculata nell'agar molle ha influito sulla conta delle placche (Figura 3B). Questi risultati indicano che la densità di E. coli all'interno dell'agar può influenzare il conteggio dei test di placca. In entrambi gli approcci, i risultati della quantificazione dei fagi si sono stabilizzati allo stesso valore (109 ufu/ml), suggerendo che i batteri bersaglio devono avere una densità sufficientemente elevata nell'agar morbido per garantire l'accuratezza del conteggio delle placche.
Nel loro insieme, questi risultati evidenziano l'importanza di sviluppare una comprensione della cinetica fago-batteri attraverso esperimenti pilota in vitro e in vivo prima di eseguire manipolazioni sperimentali.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig01v2.jpg"> Figura 1: Preparazione dei lisati fagici. (A) Flusso di lavoro per l'avvio di un lisato fagico da uno stock fagico ad alto titolo. I lisati sono stati propagati, puliti, concentrati e le endotossine sono state rimosse. La contaminazione dell'1-ottanolo è stata rimossa con il vuoto di velocità. (B) Le endotossine sono state quantificate nei lisati fagici e veicoli utilizzando un kit di quantificazione delle endotossine cromogeniche. Le linee blu tratteggiate indicano i limiti superiore e inferiore per confutare l'inibizione del prodotto nel controllo dell'inibizione del prodotto (0,5 EU/mL ± 25%). Ogni punto rappresenta una delle due repliche tecniche. L'altezza della barra rappresenta la media tra le repliche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig02v2.jpg"> Figura 2: Generazione di topi monocolonizzati e monitoraggio dei livelli di fagi e batteri in pellet fecali. (A) Flusso di lavoro per la colonizzazione di topi privi di germi con una singola specie batterica e generazione di topi monocolonizzati F1 e F2. (B-E) Livelli di fago T4 ed E. coli rilevati in pellet fecali di topi C57BL/6 nati monocolonizzati con E. coli e inoculati con fago T4 a 6-8 settimane di età. Al giorno 0 (pre-colonizzazione) e nei giorni indicati dopo la colonizzazione, i livelli di fagi T4 sono stati misurati mediante placcatura spot e saggi di placca utilizzando il metodo dello strato singolo di agar. I livelli di E. coli sono stati misurati mediante placcatura spot su agar all'1,5% LB. (B, C) Cinetica dei livelli di (B) fago T4 e (C) E. coli in pellet fecali recuperati dopo inoculazione con 2 x 106 pfu di lisato di fago o veicolo T4 (normalizzato per volume e livelli di endotossine). (D, E) (D) Livelli di fago T4 e (E) E. coli in pellet fecali recuperati dopo inoculazione con 2 x 102 ufu, 2 x 104 pfu o 2 x 106 pfu di fago T4. Le barre di errore rappresentano la media e l'errore standard della media (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig02largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig03v2.jpg"> Figura 3: Accuratezza della risoluzione dei problemi nei saggi della placca. (A) Titolo del lisato fagico T4 utilizzando colture notturne o sottocolture di E. coli per la preparazione di agar molle (agar allo 0,5%, LB). Le sottocolture sono state realizzate utilizzando una diluizione 1:50 di coltura notturna di E. coli in LB fresco. 5 mL di preparati di agar molle sono stati inoculati con 100 μL di E. coli e 20 μL di fago T4. CaCl2 e MgSO4 non sono stati aggiunti all'agar molle per questi test, ma possono essere aggiunti se lo si desidera. Tempi di sottocoltura di E. coli inferiori a 2,8 h hanno determinato un titolo fagico apparente inferiore. (B) Titolo di lisato fagico T4 utilizzando diverse densità di E. coli nella preparazione di agar molle. L'aggiunta di diversi volumi di E. coli da una coltura notturna (non sottocoltivata, come in A) nell'agar molle ha portato a diversi titoli fagici apparenti. Le barre di errore rappresentano l'incertezza calcolata del titolo fagico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig03largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

I batteriofagi (fagi), virus che infettano i batteri, sono parte integrante del microbioma intestinale. Sebbene questi abitanti simbiotici guidino la fitness batterica e le dinamiche di popolazione, si sa poco su come influiscono sull'omeostasi intestinale e sulle malattie. Questo protocollo studia i fagi T4 isolati all'interno di un modello murino, adattabile ad altre coppie fago-batterio.

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

La nostra ricerca mira a comprendere le interazioni tripartite tra batteriofagi batteriobatteri e sistema immunitario dei mammiferi nel contesto dell'intestino, intestino gnotobiotico del topo. Speriamo di ottenere informazioni su queste interazioni in condizioni di salute e malattia per comprendere meglio l'importanza del microbioma intestinale. Recenti sviluppi hanno scoperto che i batteriofagi possono essere rilevati dal sistema immunitario dei mammiferi.È stato suggerito che il fageoma intestinale umano possa essere disregolato in condizioni patologiche come i disturbi infiammatori intestinali e che la stimolazione immunitaria da parte dei fagi possa esacerbare i fenotipi della malattia. Il nostro obiettivo è quello di fornire ad altri un protocollo standardizzato per la produzione di un lisato fagico T4 per l'inoculazione e l'enumerazione in modelli murini gnotobiotici. Questi protocolli possono essere costruiti e modificati per l'uso con altre coppie di batteri batteriofagi.

t4-bacteriophage-e-coli-interaction-murine-intestine-prototypical

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Immunologia e Infezioni

In questo articolo viene descritta la procedura per la preparazione di una versione fluorescente marcato del batteriofago lambda, infezione...

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024).This video demonstrates the in vivo interaction between T4 bacteriophage and E. coli in the murine intestine, and the fecal spot plating method to quantify their coexistence by measuring bacterial colonies and phage plaques.

Assessing the Coexistence of T4 Bacteriophage and E. coli in Murine Fecal Samples

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

Questo protocollo descrive un metodo robusto per l'utilizzo di impostazioni ad alto rendimento per esaminare l'efficacia antibatterica dei cocktail di batteriofagi.

Efficacia dei batteriofagi per il biocontrollo dei patogeni di origine alimentare valutati tramite impostazioni ad alta produttività

Descriviamo un protocollo per identificare i ruoli chiave di molecole di segnalazione di accoglienza nella replicazione litica di un herpesvirus modello, gamma herpesvirus 68 (γHV68). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali per γHV68 replica litico, il protocollo consente sia la caratterizzazione fenotipica e molecolare del virus interrogatorio interazioni ospite-in replicazione virale litico.

Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

Murine trapianto di midollo osseo è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi immunologici che regolano graft-versus-host disease negli esseri umani. La capacità di monitorare il traffico delle cellule T...

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Noi descriviamo i metodi per l'efficiente e rapido isolamento / cultura della microglia praticabile dalla corteccia cerebrale neonatale e midollo spinale adulto. La dissezione e la placcatura di microglia corticale può essere realizzato entro 90 minuti, con la conseguente raccolta microglia in atto ~ 10 giorni dopo la dissezione iniziale.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

I membri del genere Burkholderia sono patogeni di importanza clinica. Noi descriviamo un metodo per l'estrazione delle proteine ​​totali batterica, utilizzando distruzione meccanica, e elettroforesi su gel 2-D per la successiva analisi proteomica.

Totale Estrazione di proteine ​​e 2-D elettroforesi su gel Metodi per<em&gt; Burkholderia</em&gt; Specie

Qui, una procedura è descritta per la creazione di infezione sistemica nel ratto neonatale con colture di Escherichia coli K1. Questa procedura non invasiva consente colonizzazione del tratto gastrointestinale, traslocazione del patogeno alla circolazione sistemica, e l'invasione del sistema nervoso centrale al plesso coroide.

Non invasiva Modello di neuropatogeno Escherichia coli L'infezione neonatale nel ratto

Il presente studio descrive lo sviluppo e le applicazioni di un sistema di analisi geneticamente modificato basato sulla trasfezione di cellule leucemiche basofile di ratto con il gene equino FcεRIα. Le cellule trasfettate esprimono un recettore funzionale in cui il rilascio di mediatori della risposta allergica può essere attivato da IgE e antigene.

Sviluppo di un In vitro Sistema modello per studiare l'interazione tra Equus Caballus IgE con il suo recettore ad alta affinità FcεRI

Scopri l'interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino usando un modello gnotobiotico. Questo protocollo standardizzato aiuta a studiare le dinamiche ospite-batteriofago in vivo e il ruolo dei fagi nella salute intestinale.

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nellintestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo (Video) | JoVE Journal

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

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