Name: Registrazione dellintegrità funzionale della barriera su cellule endoteliali vascolari bEnd.3 tramite rilevamento della resistenza elettrica transendoteliale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Scopri come misurare la resistenza elettrica transendoteliale per valutare l'integrità della barriera ematoencefalica su cellule bEnd.3. Questo metodo semplice e non invasivo accelera lo screening di farmaci per il sistema nervoso centrale.

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Apprezziamo il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (82274207 e 82104533), del Key Research and Development Program di Ningxia (2023BEG02012) e dello Xinglin Scholar Research Promotion Project dell'Università di Chengdu di MTC (XKTD2022013).

NOTA: Le cellule endoteliali derivate dal cervello di topo.3 (bEnd.3) sono state inoculate nelle camere di una piastra a 24 pozzetti per costruire un semplice modello in vitro di BBB in condizioni specifiche del terreno. Il TEER delle cellule normali e delle cellule ipossiche è stato misurato con il misuratore TEER (Figura 1 e Figura 2).
1. Preparazione della soluzione
<ol><li>Preparare il terreno di coltura cellulare DMEM contenente FBS (10%, v/v), 100 U/mL di penicillina e 10 mg/mL di streptomicina (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare 100 mM di soluzione madre di CoCl2 aggiungendo 1,30 mg di CoCl2 a 100 μL di soluzione di DMSO. NOTA: Tutte le soluzioni di cui sopra sono state conservate a 4 °C e la soluzione madre è stata diluita in base alla concentrazione desiderata prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% (v/v) aggiungendo 2 mL di soluzione di ipoclorito di sodio a 38 mL di acqua bidistillata.</li>
</ol>2. Colture cellulari e vitalità cellulare
<ol><li>Seminare 1 mL di cellule bEnd.3 in piastra di coltura (100 mm) contenente terreno DMEM ad una densità di 1 x 106 cellule/mL e coltura a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 . Cambiare il terreno ogni 2 o 3 giorni e sottocoltivare le cellule 2 volte a settimana.</li>
	<li>Dopo che le cellule bEnd.3 sono cresciute fino all'80% di confluenza, digerire le cellule con lo 0,25% di tripsina per 30 secondi.</li>
	<li>Preparare una sospensione di cellule bEnd.3 con una densità di 7 x 104 cellule/mL utilizzando un terreno DMEM attraverso un contatore di cellule. Quindi, seminare 100 μL di sospensione cellulare bEnd.3 in una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Dopo l'adesione cellulare, pulire le cellule con PBS e coltivare le cellule con 100 μL di terreno di coltura o terreno contenente farmaco (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2) per 24 ore nelle stesse condizioni. Dopo aver rimosso il terreno all'interno della piastra del pozzetto e averlo pulito con PBS, aggiungere 100 μL di soluzione CCK-8. NOTA: Non generare bolle nel pozzetto, che influenzeranno i valori di densità ottica (OD).</li>
	<li>Mettere le piastre a 96 pozzetti in un ambiente di 37 °C e incubare per 1 ora. Misurare l'assorbanza delle piastre a 96 pozzetti a 450 nm utilizzando un lettore per micropiastre. NOTA: Per evitare differenze all'interno del gruppo, le piastre a pozzetti sono state raffreddate a temperatura ambiente prima del rilevamento.</li>
	<li>Calcolare la vitalità cellulare indotta da diverse concentrazioni di CoCl2 secondo la formula [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Selezionare la concentrazione di CoCl2 con una differenza significativa nella riduzione della vitalità cellulare rispetto al gruppo di controllo per il prossimo esperimento.</li>
</ol>3. Assemblaggio del modello
<ol><li>Sciacquare la camera superiore delle piastre a 24 pozzetti con PBS. NOTA: Le cellule sono cresciute e si sono fuse sul fondo della camera superiore della piastra a 24 pozzetti e si sono gradualmente formate giunzioni strette tra le cellule per svolgere un ruolo di barriera. Se le cellule endoteliali utilizzate in alcuni studi non sono in grado di formare una barriera completa sulle membrane PET in modo indipendente, è necessario rivestire le membrane con una soluzione di collagene IV prima dell'inoculazione cellulare.</li>
	<li>Miscelare le cellule bEnd.3 con il terreno DMEM per ottenere una sospensione a una densità di 5 x 105 cellule/mL utilizzando un miscelatore a vortice. Quindi, seminare 200 μL di sospensione cellulare bEnd.3 sulla membrana PET nella camera superiore di una piastra a 24 pozzetti (0,33 cm2, dimensione dei pori della membrana 0,4 μm). NOTA: Lo studio pilota di questo protocollo non ha riscontrato differenze nei risultati quando si utilizzano da 5 a 10 passaggi di cellule bEnd.3 per gli esperimenti. Per garantire la probabilità di successo della modellazione, fare riferimento all'intervallo del numero di celle di questo protocollo.</li>
	<li>Aggiungere 1200 μL di terreno completo alla camera inferiore della piastra per garantire che la pressione osmotica della camera superiore e inferiore tenda a stabilizzarsi. Ci sono differenze nel volume del mezzo aggiunto a seconda del tipo; Assicurarsi che il livello del liquido delle camere superiore e inferiore sia a filo.</li>
	<li>Cambiare il fluido della camera superiore e della camera inferiore a un'ora fissa ogni giorno e monitorare contemporaneamente il valore della resistenza.<ol><li>Quando si cambia il mezzo, l'integrità dello strato cellulare sarà danneggiata dal tocco artificiale o da un movimento eccessivo. Per evitare la situazione di cui sopra, rimuovere lentamente il vecchio mezzo da un lato con una pipetta a pressione negativa e aggiungere lentamente un nuovo mezzo lungo la parete durante lo scambio del fluido.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Misurazione del TEER
<ol><li>Prima di iniziare il lavoro, posizionare il resistore, la soluzione di ipoclorito di sodio al 5%, l'etanolo al 75% e la soluzione di acqua bidistillata in un tavolo ultra-pulito. Accendere l'irradiazione UV per 30 minuti per eliminare batteri e agenti patogeni residui.</li>
	<li>Immergere gli elettrodi in una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% agitando lentamente per 3-5 secondi, quindi immergerli in etanolo al 75% per 15 minuti. Infine, trasferire in PBS o in una soluzione di acqua bidistillata fino all'uso.</li>
	<li>Accendere l'interruttore sul retro del resistore di cella, fare clic su Seleziona piastra in base ai parametri nella Tabella 1 e selezionare Piastra a 24 pozzetti.</li>
	<li>In base alle esigenze operative, selezionare la sequenza di rilevamento appropriata. In questo studio abbiamo selezionato la procedura A1 .</li>
	<li>Inserire una resistenza kΩ nella spina destra per calibrare lo strumento. Se il risultato della calibrazione è 1000 ± 5 Ω, considerare la precisione dello strumento normale.<ol><li>Se il risultato della calibrazione non è 1000 Ω, fare clic su Unità di modalità nell'interfaccia principale per selezionare OHMS, quindi fare clic su Calibra nella schermata principale per ricalibrare lo strumento.</li>
	</ol></li>
	<li>Estrarre la resistenza kΩ sul lato destro e sostituire l'elettrodo di misura con un filo di collegamento.</li>
	<li>Posizionare l'elettrodo nella piastra a 24 pozzetti senza seminare le celle verticalmente e fare clic su Gestione del grezzo nella schermata principale dello strumento. Il valore di fondo della resistenza della piastra senza cellule seminate è di circa 134,4 Ω.</li>
	<li>Inserire i due elettrodi nelle camere superiore e inferiore della piastra seminata con le celle in modo che lo strato cellulare si trovi tra di loro, quindi registrare il valore della resistenza premendo delicatamente il pedale.<ol><li>Assicurarsi che l'elettrodo non tocchi le celle nella camera superiore e nella parte inferiore della camera inferiore. Il tempo di immersione dell'elettrodo nella soluzione non ha alcun effetto sul valore della resistenza ed è solo necessario assicurarsi che l'elettrodo sia nella posizione corretta.</li>
	</ol></li>
	<li>Ottenere i valori di TEER (Ωcm2) moltiplicando i valori di resistenza elettrica (ohm) per la zona inferiore (cm2) della camera superiore, come nell'equazione: TEER (Ωcm2) = Resistenza (Ω) xinserto S (cm2)</li>
	<li>Disegna un grafico a linee di TEER-Time (in giorni). Quando il valore della resistenza non aumenta ulteriormente con il tempo (misurato in giorni), si consideri la cella formata da una barriera. NOTW: Il modello BBB monostrato di cellule bEnd.3 sarà costruito con successo coltivando cellule bEND.3 con i parametri di questo studio per circa 6 giorni. Il TEER del modello monostrato di celle bEnd.3 variava da 16,49 ± 2,12 Ωcm2 a 27,59 ± 1,50 Ωcm2 entro 6 giorni (n=8, media ± DS).</li>
</ol>5. Distruzione delle barriere e analisi statistica
<ol><li>In base alla curva TEER - tempo, selezionare i pozzetti con funzione barriera e dividerli nel gruppo di controllo e nel gruppo CoCl2 (n = 4).</li>
	<li>Aggiungere il terreno di coltura e il terreno di coltura contenenti 300 μM di CoCl2 (200 μL) rispettivamente nella camera superiore del gruppo di controllo e del gruppo CoCl2 .</li>
	<li>Rilevare i valori di resistenza dei gruppi di controllo e CoCl2 a 12 ore e 24 ore di incubazione a 37 °C utilizzando la procedura descritta al punto 4.</li>
	<li>Utilizzare software commerciali per mappare l'andamento dei valori di TEER della barriera di cellule coltivate con o senza 300 μM di CoCl2.</li>
	<li>Utilizzare un software di analisi statistica per analizzare la differenza nei valori di resistenza tra le cellule trattate con CoCl2 e le cellule normali (n=4, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).</li>
</ol>

Misurazione della resistenza transendoteliale per valutare l'integrità della barriera cellulare

<ol><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLEC14A+deficiency+exacerbates+neuronal+loss+by+increasing+blood-brain+barrier+permeability+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 48(2020).</li>
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<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33(2013).</li>
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<li>Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+models%3A+in+vitro+to+in+vivo+translation+in+preclinical+development+of+CNS-targeting+biotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics.</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).</li>
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<li>Peng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+in+vitro+cell+culture+models+and+the+potential+applications+for+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders.</a> Front Pharmacol. 12, 671734(2021).</li>
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<li>Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+%28BBB%29+based+on+hCMEC%2FD3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells.</a> J Control Release. 358, 78-97 (2023).</li>
<li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li>
<li>Sivandzade, F., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+blood-brain+barrier+modeling%3A+A+review+of+modern+and+fast-advancing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).</li>
<li>Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocultures+of+primary+porcine+brain+capillary+endothelial+cells%3A+Still+a+functional+in+vitro+model+for+the+blood-brain-barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier.</a> J Control Release. 285, 172-177 (2018).</li>
<li>Srinivasan, B., Kolli, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial%2Ftransendothelial+electrical+resistance+%28TEER%29+to+measure+the+integrity+of+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Blood-Brain+Barrier%22%5BJournal%5D)">Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier.</a> Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).</li>
<li>Liang, Y., Yoon, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+sensors+for+blood-brain+barrier+%28BBB%29+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+Rep%22%5BJournal%5D)">In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip.</a> Sens Actuators Rep. 3, 100031(2021).</li>
<li>Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+expression+of+selected+blood-brain+barrier+transporters+GLUT-1%2C+P-gp%2C+SLC7A5+and+TFRC%2C+while+maintaining+barrier+integrity%2C+in+brain+capillary+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers.</a> Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Uno degli organi corporei più sviluppati, il cervello controlla un'ampia gamma di intricati processi fisiologici, tra cui la memoria, la cognizione, l'udito, l'olfattoe il movimento. Il cervello è uno degli organi più complicati e malati del corpo umano allo stesso tempo. L'insorgenza di molti disturbi del sistema nervoso centrale mostra una tendenza crescente anno dopo anno a causa di fattori quali l'inquinamento atmosferico, i modelli alimentari irregolari e altri fattori 27,28,29.<sup class="xr...

La BBB è un'interfaccia biologica unica tra la circolazione sanguigna e il tessuto nervoso, composto da cellule endoteliali vascolari, periciti, astrociti, neuroni e altre strutture cellulari1. Il flusso di ioni, sostanze chimiche e cellule tra il sangue e il cervello è strettamente regolato da questa barriera. Questa omeostasi protegge i tessuti nervosi dalle tossine e dagli agenti patogeni, consentendo anche il corretto funzionamento dei nervi cerebrali 2,3. Mantenere l'integrità della BBB può prevenire efficacemente lo sviluppo e la progressione di disturbi che colpiscono il sistema nervoso centrale, come la disfunzione neuronale, l'edema e la neuroinfiammazione4. Tuttavia, le proprietà fisiologiche uniche della BBB impediscono a oltre il 98% dei farmaci a piccole molecole e al 100% dei farmaci macromolecolari di entrare nel sistema nervoso centrale5. Pertanto, aumentare la penetrazione dei farmaci attraverso la BBB durante lo sviluppo di farmaci per il sistema nervoso centrale è essenziale per raggiungere l'efficacia terapeutica 6,7. Anche se lo screening con simulazione al computer dei substrati ha aumentato significativamente la probabilità che i candidati farmaci attraversino la BEE, sono ancora necessari modelli di BBB in vitro/in vivo affidabili e convenienti per soddisfare le esigenze della ricerca scientifica8.
Una tecnica rapida ed economica per lo screening dei farmaci ad alto rendimento è il modello in vitro 9. Per far luce sui processi fondamentali degli effetti dei farmaci sulla funzione della BBB e sul loro ruolo nello sviluppo e nella progressione della malattia, è stata creata una serie di modelli semplificati di BBB in vitro. Attualmente, i modelli comuni di BBB in vitro sono i modelli monostrato, di co-coltura, dinamici e microfluidici 10,11,12, costruiti da cellule endoteliali vascolari e astrociti, periciti o microglia 13,14. Sebbene le colture cellulari 3D siano più in linea con la struttura fisiologica della BBB15, la loro applicazione come mezzo di screening farmacologico per la BBB è ancora limitata dal loro design intricato e dalla riproducibilità scadente. Al contrario, il modello monostrato in vitro è quello più frequentemente utilizzato per la ricerca sulla BBB ed è applicabile per determinare l'espressione dei trasportatori di membrana e delle proteine a giunzione stretta in particolari cellule.
La misurazione della resistenza elettrica transmembrana (TEER) è una tecnica per valutare e monitorare lo strato di cellule attraverso la resistenza e valutare l'integrità cellulare e la permeabilità della barriera. Inserendo contemporaneamente due elettrodi nel mezzo di crescita o nella soluzione tampone su entrambi i lati del monostrato, è possibile misurare la corrente alternata o l'impedenza elettrica attraverso lo strato compatto della cella16,17. Al fine di determinare se il modello BBB in vitro è stato creato correttamente, la misurazione del TEER sarà solitamente impiegata come gold standard18. D'altra parte, l'andamento dell'azione dei farmaci sulla permeabilità della BBB può essere previsto con precisione misurando la variazione della resistenza elettrica dello strato cellulare dopo il coinvolgimento del farmaco19. Ad esempio, Feng et al. hanno scoperto che il catalpol (il monomero attivo primario delle rehmanniae) potrebbe invertire efficacemente la down-regulation indotta dai lipopolisaccaridi delle proteine a giunzione stretta nella BBB e aumentare il valore TEER dello strato20 delle cellule endoteliali del cervello di topo.
La risposta neuroinfiammatoria è di solito la causa principale dello squilibrio dell'omeostasi della BBB21. Il trattamento ipossico per indurre lesioni neuroinfiammatorie è il metodo principale per distruggere la barriera emato-encefalica, includendo principalmente metodi fisici e metodi di reagenti chimici. Il primo utilizza principalmente un incubatore a tre gas per variare il contenuto di ossigeno nell'ambiente di crescita cellulare per simulare le condizioni ipossiche22, mentre il secondo si ottiene introducendo artificialmente reagenti deossi come CoCl2 nel terreno di coltura cellulare23. Le cellule rimarranno in una condizione di deossigenazione se Fe2+ viene sostituito con Co2+ nell'eme. Se Fe2+ viene sostituito con Co2+ nel gruppo catalitico, l'attività della prolina idrossilasi e dell'aspartato idrossilasi sarà inibita, con conseguente accumulo di fattore 1α inducibile dall'ipossia (HIF-1α)24. In condizioni di ipossia persistente, la defosforilazione di HIF-1α nel citoplasma innesca la morte cellulare e attiva il fattore di crescita dell'endotelio vascolare, che alla fine aumenta la permeabilità vascolare. In precedenti studi 25,26, è stato ben dimostrato che l'ipossia può ridurre significativamente l'espressione delle proteine endoteliali della giunzione stretta per aumentare la permeabilità della BBB. In questo studio, è stata misurata la curva tempo-resistenza delle cellule bEnd.3 seminate in piastre a 24 pozzetti al fine di creare un modello BBB semplice. Utilizzando questo modello, abbiamo caratterizzato i cambiamenti nel TEER cellulare dopo l'intervento di CoCl2 al fine di costruire un modello cellulare che può essere utilizzato per lo screening dei farmaci per la protezione della BBB.

<table><tbody><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>Corning (Corning 3470, 0,33 cm2, 0,4 &; micro; m)</td><td>10522023</td><td></td></tr><tr><td>75 % etanolo</td><td>ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd</td><td>2023052901</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd</td><td>220412-078-B</td><td></td></tr><tr><td>bEnd.3 celle</td><td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td><td>CL0049</td><td></td></tr><tr><td>Kit di conteggio cellulare-8 (CCK-8)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>BG0025</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura cellulare (100 mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>1192022</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di cobalto (CoCl2)</td><td>Sigma</td><td>15862</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle medium (1x)</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8121587</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>2166090RP</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism software</td><td>GraphPad Software</td><td>9.0.0(121)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Contiene collagene IV)</td><td>MedChemexpress</td><td>HY-K6002</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax iD5</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 software</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (100x)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>17C18B16</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 1x)</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>Ipoclorito di sodio</td><td>ChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd</td><td>2022091501</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di resistenza transmembrana</td><td>World Precision Instruments LLC</td><td>VOM3 (versione 1.6)</td><td></td></tr></tbody></table>

registrazione dell'integrità funzionale della barriera su cellule endoteliali vascolari bend.3 tramite rilevamento della resistenza elettrica transendoteliale

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

La barriera emato-encefalica (BBB) è una struttura fisiologica dinamica composta da cellule endoteliali microvascolari, astrociti e periciti. Coordinando l'interazione tra il transito limitato di sostanze nocive, l'assorbimento dei nutrienti e la clearance dei metaboliti nel cervello, la BBB è essenziale per preservare l'omeostasi del sistema nervoso centrale. La costruzione di modelli in vitro della BBB è uno strumento prezioso per esplorare la fisiopatologia dei disturbi neurologici e creare trattamenti farmacologici. Questo studio descrive una procedura per la creazione di un modello di cellula BBB monostrato in vitro seminando cellule bEnd.3 nella camera superiore di una piastra a 24 pozzetti. Per valutare l'integrità della funzione di barriera cellulare, il voltmetro convenzionale a cellule epiteliali è stato utilizzato per registrare in tempo reale la resistenza elettrica transmembrana delle cellule normali e delle cellule ipossiche indotte da CoCl2. Prevediamo che gli esperimenti di cui sopra forniranno spunti efficaci per la creazione di modelli in vitro di BBB e farmaci per il trattamento dei disturbi delle malattie del sistema nervoso centrale.

Questo protocollo ha permesso di registrare le variazioni dei valori di resistenza delle cellule in base ai parametri impostati nel resistore transendoteliale. La vitalità delle cellule bEnd.3 (numero di cellule vive) trattate con diverse concentrazioni di CoCl2 è stata esaminata mediante test CCK-8. Il maggior danno cellulare prodotto da CoCl2 è stato rappresentato da una minore vitalità cellulare. Abbiamo scoperto che 300 μM di CoCl2 erano significativamente citotossici in vitro</em...

Questo protocollo descrive un modello in vitro affidabile ed efficiente della barriera emato-encefalica. Il metodo utilizza cellule endoteliali vascolari cerebrali di topo bEnd.3 e misura la resistenza elettrica transmembrana.

Registrazione dell'integrità funzionale della barriera su cellule endoteliali vascolari bEnd.3 tramite rilevamento della resistenza elettrica transendoteliale

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

Gli studi attuali utilizzano in genere test di permeabilità e l'espressione proteica associata per verificare l'accuratezza del rilevamento di TEER. Il modello BBB di cellule monostrato in virtù è meno efficace per lo screening dei farmaci e l'uso di più cellule rende più difficile la costruzione del modello. Il protocollo di questo studio è relativamente semplice, in quanto la procedura non invasiva consente di utilizzare i campioni di cellule in altri esperimenti dopo il rilevamento di TEER.Il rilevamento di TEER per valutare la permeabilità dei modelli cellulari può accelerare lo screening dei farmaci per il trattamento e la prevenzione del sistema nervoso centrale per aumentare il tasso di successo dello sviluppo di nuovi farmaci. In futuro, rileveremo l'espressione della proteina della giunzione stretta nelle cellule del compartimento superiore della parete toracica per verificare che i risultati del test TEER possano rappresentare efficacemente l'integrità della funzione di barriera della BBB.

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Un tempo reale impedenza elettrica tecnica basata su Misura Invasione di cellule endoteliali monostrato dalle cellule tumorali

Questo video mostra un metodo per valutare la resistenza elettrica transendoteliale (TEER) nelle cellule endoteliali microvascolari cerebrali di topo in vitro. Un valore TEER elevato indica giunzioni di cellule endoteliali intatte, mentre l'aggiunta di cellule T attivate abbassa il valore TEER, riflettendo la rottura della barriera giunzionale.

Valutazione della resistenza elettrica transendoteliale in un modello di barriera emato-encefalica in vitro

Il Transistor elettrochimica organica è integrato con cellule vive e utilizzato per monitorare il flusso di ioni attraverso la barriera epiteliale intestinale. In questo studio, un aumento di flusso di ioni, correlate a rottura di giunzioni strette, indotta dalla presenza del chelante calcio EGTA (etilenglicole-bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N ', N'-tetra acetico acido), viene misurata.

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Questo protocollo commenti elettrico Cell-substrato Impedance Sensing, un metodo per registrare ed analizzare lo spettro di impedenza di cellule aderenti per la quantificazione di adesione cellulare, la proliferazione, motilità, e le risposte cellulari agli stimoli farmacologici e tossici. Rilevamento di permeabilità endoteliale e la valutazione di cellula-cellula e cellula-substrato contatti sono enfatizzati.

Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

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Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

Questa pubblicazione descrive la realizzazione di un dispositivo di organo-on-chip con elettrodi integrati per quantificazione diretta della resistenza elettrica transendoteliale (TEER). Per la convalida, la barriera emato - encefalica è stata imitata all'interno di questo dispositivo microfluidico e sua funzione di barriera è stata controllata. I metodi presentati per integrazione di elettrodo e diretto TEER quantificazione sono generalmente applicabili.

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Saggio di transcitosi delle cellule endoteliali come modello in vitro per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna

Qui dimostriamo la tecnica di utilizzo di biosensori basati sull'impedenza: ECIS e cellZscope, per misurare la forza della barriera endoteliale cerebrale. Descriviamo in dettaglio la preparazione e la tecnica per aggiungere vari stimoli a un modello in vitro dell'endotelio cerebrale. Misuriamo, registriamo e forniamo un'analisi rappresentativa dei risultati.

Misurazione dei cambiamenti nell'integrità della barriera endoteliale cerebrale con due biosensori basati sull'impedenza in risposta alle cellule tumorali e alle citochine

Vi presentiamo un metodo per raccogliere i segnali electrocorticographic a fini di ricerca da esseri umani che sono sottoposti a monitoraggio invasivo epilessia. Mostriamo come utilizzare il BCI2000 piattaforma software per la raccolta dati, elaborazione del segnale e la presentazione dello stimolo. In particolare, abbiamo dimostrato Sigfried, uno strumento basato su BCI2000 in tempo reale la mappatura funzionale del cervello.

Registrazione umani Electrocorticographic (ECOG) Segnali per la ricerca neuroscientifica e in tempo reale la mappatura funzionale corticale

Scopri come misurare la resistenza elettrica transendoteliale per valutare l'integrità della barriera ematoencefalica su cellule bEnd.3. Questo metodo semplice e non invasivo accelera lo screening di farmaci per il sistema nervoso centrale.

Registrazione dellintegrità funzionale della barriera su cellule endoteliali vascolari bEnd.3 tramite rilevamento della resistenza elettrica transendoteliale (Video) | JoVE Journal

Registrazione dell'integrità funzionale della barriera su cellule endoteliali vascolari bEnd.3 tramite rilevamento della resistenza elettrica transendoteliale

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