Name: Un metodo efficiente e veloce per letichettatura e lanalisi dei glomeruli di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Scopri un metodo rapido ed efficiente per etichettare e analizzare i glomeruli nei reni di topo usando FITC-Dextran e microscopia a foglio di luce. Questa tecnica semplifica la ricerca sulle malattie renali.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82204951) e del Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).

In questo studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6 (6 settimane di età, 25-30 g). Tutte le procedure sono state eseguite nel rispetto delle normative locali in materia di benessere animale e di etica sperimentale. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca Biomedica dell'Ospedale della Cina Occidentale dell'Università del Sichuan.
1. Etichettatura dei glomeruli e preparazione dei tessuti
<ol><li>Etichettatura dei glomeruli<ol><li>Sciogliere il destrano FITC (10 mg) in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un rapporto di 1:1 (1 mg: 1 mL) per preparare la soluzione della sonda di lavoro. NOTA: La soluzione di lavoro può essere conservata a 4 °C per 1 mese.</li>
		<li>Posiziona il mouse C57 in un fissatore per vene della coda di topo. Bagnare la garza con acqua calda, avvolgere la garza attorno alla parte centrale della coda del topo e scaldare la coda per 1 minuto.</li>
		<li>Pulisci la coda del topo con etanolo al 75% finché le vene della coda sinistra e destra non sono visibili.</li>
		<li>Prelevare 100 μL della soluzione della sonda di lavoro con una siringa da insulina da 1 mL e iniettare lentamente la soluzione nella vena caudale del topo.</li>
		<li>Dopo l'iniezione, lasciare circolare la soluzione della sonda per 30 minuti. Lascia che i topi si muovano liberamente nelle loro gabbie.</li>
		<li>Una volta raggiunta una circolazione sufficiente, anestetizzare in profondità i topi mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital di sodio (1%, 60-80 μg/kg).</li>
	</ol></li>
	<li>Prelievo e fissazione del rene<ol><li>Fissare i topi anestetizzati alla placca anatomica in posizione supina. Fissa le zampe con del nastro adesivo.</li>
		<li>Dopo la preparazione della pelle, sopprimere i topi con una dose letale di pentobarbital di sodio (1%, 10 mg/kg).</li>
		<li>Praticare un'incisione addominale sulla linea mediana per esporre la cavità addominale.</li>
		<li>Rivelare i reni e rimuoverli con un bisturi e delle forbici nella cappa aspirante. Rimuovere delicatamente l'involucro renale.</li>
		<li>Prelevare i reni e fissarli in paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C per una notte.</li>
		<li>Lavare i campioni con PBS tre volte 1 ora ciascuno con agitazione a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Preparare il rene per la microscopia.<ol><li>Tagliare il rene per la microscopia confocale: tagliare il rene in fette spesse 1 mm utilizzando la matrice cerebrale (acciaio da 1 mm, 40-75 g) per standardizzare lo spessore della fetta. Trasferire le fette in PFA al 4% e continuare la fissazione a 4 °C per tutta la notte.</li>
			<li>Rene intero per microscopia a foglio ottico: fissare i reni in PFA al 4% a 4 °C per 48 ore.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Schiarimento
<ol><li>Preparazione dei reagenti<ol><li>Preparare il reagente CUBIC-L mescolando il 10% (wt/wt) di N-butildietanolammina, il 10% (wt/wt) di Triton X-100 e l'80% di ddH2O.</li>
		<li>Preparare il reagente CUBIC-R mescolando il 45% (wt/wt) di antipirina, il 30% (wt/wt) di nicotinamide, lo 0,5% (vol/vol) di N-butildietanolammina e il 24,5% di ddH2O. Assicurarsi che la soluzione abbia un pH di 9,6-9,8 e un indice di rifrazione (RI) di 1,522. NOTA: CUBIC-L viene utilizzato per la delipidazione e CUBIC-R viene utilizzato per la corrispondenza dell'indice di rifrazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedura di compensazione<ol><li>Raccogliere i campioni di rene in una provetta da centrifuga da 50 mL e poi pulirli in CUBIC-L con agitazione a 60 giri/min a 37 °C. Sostituire CUBIC-L ogni 4 ore (per le fette di rene) o ogni 24 ore (per un rene intero) fino ad ottenere una trasparenza ottica soddisfacente. NOTA: Questo processo richiede 1 giorno per le fette di rene e 5 giorni per un rene intero.</li>
		<li>Lavare i campioni tre volte in PBS agitando delicatamente a RT per 1 ora ciascuno.</li>
		<li>Applicare CUBIC-R sui campioni, agitando i campioni a 37 °C, 60 giri/min per 6 ore.</li>
		<li>Osservare direttamente i campioni eliminati o conservarli in provette nere riempite con CUBIC-R a RT per 1 settimana.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Acquisizione delle immagini
<ol><li>Imaging confocale NOTA: Acquisire un'immagine dei campioni di rene affettati con microscopia confocale (lenti: obiettivo Plan Apo λ 4×/0,2 N1 o obiettivo Plan Apo VC 10×/0,45 DIC N1). Acquisisci immagini di grandi dimensioni (ad esempio, 6052 μm x 6052 μm per la fetta di rene) con z-stack.<ol><li>Accendere il microscopio confocale nella seguente sequenza: alimentazione laser, interruttore di controllo confocale, computer, microscopio e hardware confocale. Dopo aver eseguito l'autotest, accendere il software confocale.</li>
		<li>Selezionare l'obiettivo appropriato. Rimuovere il campione dal reagente CUBIC-R, posizionarlo nella capsula confocale e coprirlo per evitare che il reagente CUBIC-R si secchi.</li>
		<li>Spostare il campione al centro del campo visivo e regolare il piano focale fino a quando non è a fuoco.</li>
		<li>Applicare la ricostruzione 3D (passaggio 3.1.4.1) e la ricostruzione di immagini di grandi dimensioni (passaggi 3.1.4.2-3.1.4.3).<ol><li>Ricostruzione 3D (confocale): Cambia il piano dello zoom in una direzione fino a quando non è visibile alcuna fluorescenza; Questa posizione è definita come la parte superiore. Quindi, spostare il piano dello zoom nella direzione opposta fino a quando non è visibile alcuna fluorescenza; Questa posizione è definita come il fondo. Fare clic sul pulsante Esegui nell'angolo in basso a destra della finestra di dialogo per avviare la scansione.</li>
			<li>Ricostruzione di immagini di grandi dimensioni (confocale): sposta il campo visivo al centro del campione e imposta la posizione corrente come centro. Selezionare un campo visivo 2 x 2.</li>
			<li>Nell'interfaccia multifunzione ND, selezionare la pila Z per ricostruire immagini di grandi dimensioni e impostare diverse opzioni nel pannello. Quindi premere il pulsante Esegui per avviare la scansione.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Imaging al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) NOTA: Acquisire l'immagine dell'intero rene con un microscopio a fluorescenza a foglio luminoso (lente: EC Plan-Neofluar 5x/0,16 (medio n = 1,529) obiettivo).<ol><li>Fissaggio del campione (LSFM):<ol><li>Incollare il rene trasparente all'adattatore di fissaggio del campione e attendere che il rene sia saldamente attaccato.</li>
			<li>Immergere il rene nel contenitore del campione e spingere il contenitore del campione nel sistema del microscopio. Chiudere il portello.</li>
		</ol></li>
		<li>Osservazione e scansione (LSFM):<ol><li>Nell'interfaccia Locate , spostare il campione in una posizione di osservazione adatta. Passare all'interfaccia di acquisizione , impostare il percorso ottico, selezionare laser a 488 nm, LBF 405/488/561/640, blocco filtro di divisione ottica SBS LP 490, selezionare Camera 2 e modificare lo pseudo-colore in verde.</li>
			<li>Immettere il valore Offset Z sinistro/destro registrato in precedenza nel sottomenu Canale . Selezionare lo zoom più piccolo (0,36) e regolarlo con precisione per ottenere la massima chiarezza.</li>
		</ol></li>
		<li>Trova il limite X\Y e l'intervallo Z dell'intero organo. Regolare l'intensità del laser e il tempo di esposizione (preferibilmente inferiore a 10 ms) e fare clic su Esegui per iniziare.</li>
		<li>Se il tessuto è troppo grande, unisci due o più immagini con l'unione delle immagini. Aprire il file acquisito utilizzando il software di microscopia (in questo caso, ZEISS ZEN 3.7). Selezionare Metodo di elaborazione > > Stitching > Parametro Metodo > Applica per completare l'unione dell'immagine.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Elaborazione e quantificazione dei dati
NOTA: Elaborare le pile di immagini con il software Imaris (analisi delle immagini), utilizzando la funzione Superficie per etichettare i glomeruli ed eseguire l'analisi.
<ol><li>Conte dei glomeruli<ol><li>Importazione di immagini di grandi dimensioni (microscopia confocale) o di immagini cucite (microscopia a foglio luminoso) nel software di analisi delle immagini.</li>
		<li>Aprire i file nel software di analisi delle immagini. Fare clic sul pulsante Superficie per creare una nuova superficie. Segui la guida nella parte in basso a sinistra dello schermo.<ol><li>Fare clic sul pulsante Avanti (pulsante freccia destra) senza spuntare nulla.</li>
			<li>Selezionare la casella prima dell'opzione Arrotonda e immettere un numero appropriato (ad esempio, 14,5) per controllare i dettagli della superficie. Selezionare Sottrazione sfondo in Thresholding e riempire la casella con il diametro medio approssimativo dei glomeruli. Fare clic sul pulsante Avanti .</li>
			<li>Regolare se necessario e fare clic sul pulsante Avanti . Selezionare l'intervallo corretto e fare clic sul pulsante Avanti per creare una superficie.</li>
		</ol></li>
		<li>Fare clic su Filtro, quindi sul pulsante Aggiungi per aggiungere Sfericità per filtrare gli oggetti non sferici. Fate clic sul pulsante Duplica (Duplicate ) per copiare la nuova superficie.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Statistiche , quindi fare clic sul pulsante Generale ; il software presenterà il numero di glomeruli come numero totale di superficie.</li>
	</ol></li>
	<li>Volume dei glomeruli<ol><li>Create una superficie dei glomeruli come sopra.</li>
		<li>Una volta completata la superficie, fare clic sul pulsante Selezione per selezionare gli oggetti di destinazione e presentare il volume di ogni oggetto. Fare clic sul pulsante Salva ed esportare le statistiche in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.</li>
	</ol></li>
	<li>Volume della fetta o del rene intero<ol><li>Importazione di immagini di grandi dimensioni (microscopia confocale) o di immagini cucite (microscopia a foglio luminoso) nel software di analisi delle immagini.</li>
		<li>Aprire i file nel software di analisi delle immagini. Fare clic sul pulsante Superficie per creare una nuova superficie. Segui la guida nella parte in basso a sinistra dello schermo.<ol><li>Fare clic sul pulsante Avanti (pulsante freccia destra) senza spuntare.</li>
			<li>Selezionare la casella prima dell'opzione Arrotonda e immettere un numero appropriato (ad esempio, 50) per controllare i dettagli della superficie. Selezionare Intensità assoluta in Soglia. Fare clic sul pulsante Avanti .</li>
			<li>Regolare la superficie fino a coprire l'intero tessuto e fare clic sul pulsante Avanti . Fare clic sul pulsante Avanti per creare la superficie.</li>
		</ol></li>
		<li>Fare clic sul pulsante Selezione per selezionare la superficie dell'intero tessuto e presentare il volume del tessuto. Fai clic sul pulsante Salva per esportare le statistiche in un foglio di calcolo.</li>
	</ol></li>
</ol>

Marcatura fluorescente di glomeruli in reni di topo chiariti per microscopia

<ol><li>Hoy, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+glomerular+volume%2C+renal+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).</li>
<li>Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nephron+number%3A+implications+for+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Human nephron number: implications for health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age%2C+kidney+weight%2C+and+body+surface+in+normal+man%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).</li>
<li>Rasch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+diabetic+glomerulopathy+in+streptozotocin+diabetic+rats+by+insulin+treatment.+Kidney+size+and+glomerular+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume.</a> Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).</li>
<li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+number+and+size+variability+and+risk+for+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Glomerular number and size variability and risk for kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).</li>
<li>Bertram, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+and+how+we+determine+nephron+number%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Why and how we determine nephron number.</a> Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).</li>
<li>Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+numbers+of+glomeruli+and+individual+glomerular+cell+types+in+the+normal+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).</li>
<li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li>
<li>Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+renal+glomeruli+with+the+new+stereology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">Analyzing renal glomeruli with the new stereology.</a> International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).</li>
<li>Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+biopsies+can+be+used+for+estimations+of+glomerular+number+and+volume%3A+a+pig+study%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study.</a> Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).</li>
<li>Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+glomerular+volume%3A+a+comparison+of+four+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods.</a> Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).</li>
<li>Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurements+of+kidney+glomerular+number+and+size+in+healthy+and+Os%28%2F%2B%29+mice+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cationic+near+infrared+fluorescent+agent+and+ethyl-cinnamate+tissue+clearing+protocol+for+vascular+staining+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 521(2019).</li>
<li>Beeman, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+glomerular+number+and+size+in+perfused+kidneys+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).</li>
<li>Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+glomerular+number+in+situ+using+magnetic+resonance+imaging+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy.</a> Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).</li>
<li>Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+molecular+imaging+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Label-free molecular imaging of the kidney.</a> Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).</li>
<li>Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+thick+and+thin+section+method+for+estimation+of+podocyte+number%2C+glomerular+volume%2C+and+glomerular+volume+per+podocyte+in+rat+kidney+with+Wilms%27+tumor-1+protein+used+as+a+podocyte+nuclear+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).</li>
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<li>Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+imaging+methods+for+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Iscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development.</a> Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).</li>
<li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+technique%3A+Recent+progress+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li>
<li>Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+CLARITY-based+tissue+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Therapeutic%22%5BJournal%5D)">Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging.</a> Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).</li>
<li>Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382(2014).</li>
</ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Le tecnologie di pulizia dei tessuti possono essere classificate in 3 o 4 gruppi: 29,30,31. La pulizia dei tessuti a base di solventi organici (ad es. DISCO e PEGASOS), la pulizia dei tessuti a base acquosa (ad es. CUBIC) e la pulizia dei tessuti con incorporazione di idrogel (ad es. CLARITY) sono state tutte applicate nella pulizia dei reni 25,26,28,32. CUBIC, come abbiamo dimostrato, funziona meglio quando i glomeruli (vasi) sono etichettati con FITC-Destrano. Inoltre, CUBIC ha un processo operativo relativamente più conveniente e non richiede più delle normali lenti microscopiche27, poiché i campioni trattati non hanno bisogno di essere immersi in reagenti organici33. Tuttavia, i diversi metodi di compensazione e i metodi di etichettatura dei recipienti presentano vantaggi e svantaggi; I ricercatori potrebbero aver bisogno di sperimentare approcci diversi per soddisfare le loro esigenze specifiche.
Studi precedenti hanno notato che i glomeruli potevano essere marcati nei reni puliti quando i vasi sanguigni nei reni erano etichettati 13,25,26,28. Una spiegazione approfondita di questo fenomeno deve ancora essere ulteriormente indagata, ma si può dedurre che un buon metodo di marcatura per il sistema vascolare marca efficacemente anche i glomeruli. Sulla base dei risultati sperimentali, si consiglia l'iniezione intravascolare di FITC-destrano con un peso molecolare medio (come 150 kDa). Tuttavia, poiché l'etichettatura si basa sulla circolazione sanguigna, questo metodo potrebbe non riuscire a etichettare i glomeruli quando mancano di circolazione.
L'LSFM consente l'osservazione dei tessuti su larga scala, rendendolo più adatto per il rilevamento dei glomeruli renali interi. Tuttavia, i microscopi a foglio luminoso potrebbero non essere disponibili in tutti i laboratori. Quindi, stiamo fornendo una serie alternativa di protocolli utilizzando microscopi confocali ordinari. Sebbene il rene debba essere tagliato in più sezioni, è possibile ottenere dati come la conta e il volume dei glomeruli nell'intero rene. Inoltre, la microscopia confocale fornisce un volume di dati inferiore, che è più facile da elaborare.
Imaris fornisce l'output diretto dei dati. Tuttavia, è necessario prestare attenzione a far corrispondere il segnale analogico all'originale. Inoltre, il software potrebbe richiedere molto tempo per elaborare file di grandi dimensioni, il che può essere frustrante. Finché i glomeruli possono essere chiaramente etichettati e visualizzati, esiste più di un'unica soluzione per l'analisi dei dati. I ricercatori di diversi laboratori potrebbero lavorare con il proprio software e linguaggi di programmazione familiari.

Il numero e il volume dei glomeruli sono molto importanti per la diagnosi e il trattamento di varie malattie renali 1,2,3,4,5. Il golden standard della stima del numero di glomeruli è la combinazione dissettore fisico/frazionatore. Tuttavia, questo metodo richiede reagenti e attrezzature speciali, il che lo rende lento e costoso 6,7,8,9. La biopsia fornisce una grande quantità di informazioni, ma ovviamente questo metodo è adatto solo per stime approssimative10,11. Le tecnologie di imaging medico, tra cui la risonanza magnetica (MRI), la tomografia computerizzata (TC) e i raggi X, sono anche ampiamente utilizzate nella rilevazione glomerulare 12,13,14,15, ma tali tecnologie richiedono strumenti ingombranti. Nuovi metodi, come lo spettrometro di massa per imaging a desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI)16 o il metodo della sezione spessa e sottile17, sono stati utilizzati anche nella rilevazione glomerulare, sebbene rimangano noiosi e laboriosi.
Con l'aiuto delle tecnologie di trasparenza, è possibile osservare profondità più profonde e ottenere informazioni più ricche e complete da tessuti spessi o addirittura da interi organi 18,19,20,21,22,23. Pertanto, le tecnologie di trasparenza sono state ampiamente utilizzate nella ricerca sui reni24. Sono coinvolti anche l'osservazione e il rilevamento dei glomeruli nei reni puliti. Tuttavia, questi articoli pubblicati si riferivano solo brevemente alla rilevazione glomerulare25 o utilizzavano metodi di marcatura difficili da raggiungere come gli animali transgenici26, i coloranti autoprodotti13 o l'incubazione di anticorpi ad alta concentrazione27 per etichettare i glomeruli. Inoltre, sebbene gli studi avessero analizzato i glomeruli nei reni chiariti, le analisi erano sempre limitate13 o si basavano su algoritmi di analisi stabiliti dagli autori stessi26.
In precedenza abbiamo dimostrato un modo più conveniente per etichettare i glomeruli nei reni dei topi28. Utilizzando Imaris, abbiamo scoperto che il numero, la frequenza e il volume dei glomeruli potevano essere ottenuti rapidamente. Pertanto, qui presentiamo un insieme più accessibile, completo e semplificato di metodi per etichettare e analizzare i glomeruli dei reni dei topi.

<table><tbody><tr><td>4% PFA</td><td>Biosharp</td><td>7007171800</td><td>Fissazione reaagen</td></tr><tr><td>502 Colla</td><td>Deli</td><td>7146</td><td>Per fissare il rene all'adattatore di fissaggio del campione&nbsp;</td></tr><tr><td>Antipirina</td><td>Aladino</td><td>A110660</td><td>Reagente di pulizia</td></tr><tr><td>Matrice cerebrale</td><td>RWD Life Science</td><td>1mm 40-75</td><td>Affettatura dei tessuti</td></tr><tr><td>Microscopia confocale</td><td>Nikon</td><td>A1plus</td><td>Acquisizione di immagini</td></tr><tr><td>FITC-destrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD150S</td><td>Reagente di marcatura</td></tr><tr><td>Microscopia a fluorescenza a foglio leggero&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Light foglio 7&nbsp;</td><td>Acquisizione delle immagini</td></tr><tr><td>Topi</td><td>Ensiweier</td><td></td><td>Adult C57BL/6 topi (6 settimane di età, 25&ndash; 30 g)&nbsp;</td></tr><tr><td>N-butildietanolammina</td><td>Aladino</td><td>B299095</td><td>Reagente di chiarificazione</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Aladino</td><td>N105042</td><td>Reagente di chiarificazione</td></tr><tr><td>Pentobarbital Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Fissatore della vena della coda</td><td>JINUOTAI</td><td>JNT-FS35</td><td>Fissare il mouse per l'iniezione di vail</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Reagente di pulizia</td></tr></tbody></table>

un metodo efficiente e veloce per l'etichettatura e l'analisi dei glomeruli di topo

An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli

I glomeruli sono unità fondamentali del rene; Pertanto, lo studio dei glomeruli è fondamentale per comprendere la funzione e la patologia renale. L'imaging biologico fornisce informazioni intuitive; Pertanto, è di grande importanza etichettare e osservare i glomeruli. Tuttavia, i metodi di osservazione dei glomeruli attualmente in uso richiedono operazioni complicate e i risultati possono perdere i dettagli dell'etichetta o le informazioni tridimensionali (3D). La tecnologia di eliminazione dei tessuti CUBIC (Brainmental Imaging Cocktails and Computational Analysis) chiara e senza ostacoli è stata ampiamente utilizzata nella ricerca renale, consentendo un rilevamento più accurato e una profondità di rilevamento più profonda. Abbiamo scoperto che i glomeruli di topo possono essere marcati in modo rapido ed efficace mediante iniezione di vena caudale di destrano FITC-destrano a medio peso molecolare seguita dal metodo di compensazione CUBIC. Il rene di topo ripulito potrebbe essere scansionato con un microscopio a foglio luminoso (o un microscopio confocale una volta tagliato) per ottenere pile di immagini tridimensionali di tutti i glomeruli nell'intero rene. Elaborati con un software appropriato, i segnali dei glomeruli potrebbero essere facilmente digitalizzati e ulteriormente analizzati per misurare il numero, il volume e la frequenza dei glomeruli.

Questo studio fornisce un metodo semplice ed efficiente per etichettare e analizzare i glomeruli nei reni dei topi.
I glomeruli (vasi sanguigni) possono essere ben marcati mediante iniezione intravascolare di FITC-destrano. Dopo il processo di eliminazione, il rene è diventato trasparente (Figura 1A) e i glomeruli hanno potuto essere osservati chiaramente utilizzando la microscopia a foglio ottico (Figura 1B) o la microscopia confocale (Figura 1C). La microscopia confocale ha una profondità di scansione limitata, quindi i reni devono essere tagliati in fette spesse circa 1 mm. Se si utilizza un microscopio a foglio ottico, è possibile scansionare direttamente l'intero rene.
Con i chiari segnali, era facile contare il numero dei glomeruli. In effetti, l'etichettatura era così efficace che i glomeruli potevano essere contati ad occhio nudo. Il volume dei glomeruli potrebbe anche essere misurato direttamente. Naturalmente, software come Imaris hanno accelerato notevolmente questo processo. Utilizzando la funzione Superficie , è stato possibile selezionare tutti i glomeruli in una fetta di rene (Figura 2), in un rene intero (Figura 3) o in una striscia (Figura 4) e ottenere direttamente il numero e il volume dei glomeruli (Figura 2C, Figura 3C, Figura 4C). È stato anche possibile misurare il volume della regione selezionata (Figura 2B, Figura 3B, Figura 4B), in modo da poter calcolare il rapporto e la frequenza del volume dei glomeruli in una determinata regione o nell'intero rene (Figura 2D, Figura 3D, Figura 4D). È possibile selezionare un'area del rene per eseguire calcoli in regioni specifiche. Abbiamo presentato una striscia simile a una biopsia. Anche il numero, il volume e la frequenza dei glomeruli nella striscia possono essere ottenuti facilmente (Figura 4).
Come mostrato nelle figure, i risultati presentati in questo studio sono (N = numero, F = frequenza, V = volume, V(a) = volume medio, V(t) = volume totale):
Nglomeruli in fetta = 1128, Nglomeruli in rene intero = 14006, Fglomerulare in fetta = 65 per mm3, Fglomerulare in rene intero = 105 per mm3, Vglomeruli totali in fetta/Vfetta = 2,24%, Vglomeruli totali in rene intero/Vrene = 5,54%, V(a)glomeruli in fetta = 373654 μm3, V(a)glomeruli in rene intero = 521627 μm3, V(t)glomeruli in fetta = 421481724 μm3, V(t)glomeruli in rene intero = 7305386256 μm3 (Figura 2D, Figura 3D).
Nglomeruli in striscia = 63,F glomeruli in striscia = 72 per mm3,V glomeruli totali in striscia/Vstriscia = 2,23%, V(a)glomeruli in striscia = 307698 μm3, V(t)glomeruli in striscia = 19384977 μm3 (Figura 4D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65973/65973fig01.jpg"> Figura 1: Trasparenza del tessuto renale e glomeruli marcati con destrano FITC. (A) Rene prima e dopo il trattamento di trasparenza. (B) L'immagine di un rene intero scansionato con LSFM. (C) L'immagine di una fetta di rene scansionata con il microscopio confocale (sinistra: 4x, destra: 10x). barra graduata = 300 μm (4x, confocale); barra della scala = 100 μm (10x, confocale).; barra della scala = 700 μm (5x, zoom 0,36, LSFM). I glomeruli sono stati etichettati con FITC-Destrano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65973/65973fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65973/65973fig02.jpg"> Figura 2: La funzione Superficie applicata alla fetta di rene scansionata confocale. (A) Vengono creati la superficie della fetta e tutti i glomeruli. Rosa = glomeruli, blu = fuori dalla superficie della fetta di rene, verde = etichetta originale dei vasi (glomeruli e alcuni grandi vasi). Barra della scala = 300 μm. (B) Quando si seleziona la superficie della fetta (a sinistra) o i glomeruli (a destra) (gli oggetti selezionati diventano gialli), i dati possono essere ottenuti direttamente (il riquadro tratteggiato evidenzia dove vengono visualizzati i dati). (C) Il numero, il volume di ogni singolo glomerulo e il volume dei glomeruli totali possono essere ottenuti direttamente, così come il volume della fetta. (D) I dati esportati potrebbero essere ulteriormente analizzati in modo da poter elaborare il calcolo, come il volume medio dei glomeruli e il rapporto tra il volume dei glomeruli e l'area selezionata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65973/65973fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65973/65973fig03.jpg"> Figura 3: La funzione Superficie applicata al rene intero scansionato LSFM. (A) Viene creata la superficie dell'intero rene e di tutti i glomeruli. Rosa = glomeruli, blu = fuori Superficie dell'intero rene, verde = etichetta originale dei vasi (glomeruli e alcuni grandi vasi). Barra della scala = 1000 μm. (B) Quando la superficie del rene (a sinistra) o dei glomeruli (a destra) sono selezionati (gli oggetti selezionati diventano gialli), i dati possono essere ottenuti direttamente (il riquadro tratteggiato evidenzia dove mostra i dati). (C) Il numero, il volume di ogni singolo glomerulo e il numero dei glomeruli potrebbero essere ottenuti direttamente, così come il volume del rene. (D) I dati esportati potrebbero essere ulteriormente analizzati in modo da poter elaborare il calcolo, come il volume medio dei glomeruli e il rapporto di volume dei glomeruli e dell'intero rene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65973/65973fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65973/65973fig04.jpg"> Figura 4: La funzione Superficie applicata al prelievo renale selezionato. (A) Vengono creati la superficie della striscia e tutti i glomeruli. Rosa = glomeruli, blu = fuori dalla superficie del rene strisciante, verde = etichetta originale dei vasi (glomeruli e alcuni grandi vasi). Barra della scala = 150 μm. (B) Quando la superficie della striscia (a sinistra) o i glomeruli (a destra) sono selezionati (gli oggetti selezionati diventano gialli), i dati possono essere ottenuti direttamente (la casella tratteggiata evidenzia dove vengono visualizzati i dati). (C) Il numero, il volume di ogni singolo glomerulo e il volume dei glomeruli totali possono essere ottenuti direttamente, così come il volume della striscia. (D) I dati esportati potrebbero essere ulteriormente analizzati in modo da poter elaborare il calcolo, come il volume medio dei glomeruli e il rapporto tra il volume dei glomeruli e l'area selezionata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65973/65973fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo studio presenta una serie di metodi facili da usare, completi e semplici per etichettare e analizzare i glomeruli da reni di topo eliminati da CUBIC. Dati come il numero e il volume del glomerulo possono essere ottenuti in modo semplice e affidabile utilizzando l'isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano, la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) o la comune microscopia confocale e software come Imaris.

Un metodo efficiente e veloce per l'etichettatura e l'analisi dei glomeruli di topo

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological ...

L'etichettatura e il conteggio dei glomeruli con metodi convenzionali possono essere complicati, noiosi, dispendiosi in termini di tempo e sono necessari strumenti ingombranti. Il nostro metodo offre un metodo di etichettatura istantaneo e intuitivo per l'analisi dei glomeruli all'interno dell'intero rene. La nostra tecnica è un metodo rapido, facile, accurato ed economico per analizzare i glomeruli nell'intero rene.Non richiede alcuna attrezzatura speciale, quindi può essere eseguito in qualsiasi laboratorio. Si tratta di un metodo innovativo, rapido e semplice per etichettare i glomeruli, consentendo un'osservazione intuitiva di tutti i glomeruli all'interno dell'intero rene. Ha un grande potenziale per aiutare i ricercatori a fare progressi significativi nello studio del rene fornendo informazioni come la quantità, il volume, la distribuzione dei glomeruli e altro ancora.Da un lato, stiamo esplorando l'applicazione di questo metodo di marcatura dei glomeruli nella ricerca clinica sulle malattie renali. D'altra parte, continueremo a lavorare per migliorare i metodi per etichettare bersagli biologici come vasi sanguigni o proteine specifiche in tessuti trasparenti, adattandoli per soddisfare le nostre esigenze di ricerca.

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