Name: Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Scopri un modello 3D ex vivo per studiare le metastasi peritoneali del carcinoma ovarico utilizzando omento umano. Questo metodo preserva la struttura tissutale e permette di testare nuove terapie.

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Questo studio è finanziato in parte dalla Janet Burros Memorial Foundation. Ringraziamo i pazienti e il Dipartimento di Oncologia Ginecologica dell'Istituto Oncologico Karmanos per la raccolta di campioni di omento. Ringraziamo anche la Biobanca e il Nucleo di Scienze Correlative presso il Karmanos Cancer Institute per il coordinamento del reclutamento dei pazienti e la preparazione dei vetrini patologici. Il nucleo di Biobanca e Scienze Correlative è sostenuto in parte dalla sovvenzione P30 del NIH Center CA22453 al Karmanos Cancer Institute della Wayne State University.

Il seguente protocollo di ricerca è stato esaminato e approvato dal Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti prima dell'intervento chirurgico. La Figura 1 illustra i tre passaggi generali di questo protocollo.
1. Preparazione del tessuto di omento umano
<ol><li>Preparare il terreno di coltura dell'omento (DMEM/F12 + 10% siero fetale bovino + 1% penicillina-streptomicina) e conservare a 4 °C. Aliquotare 30-40 mL di questo terreno in una provetta conica sterile da 50 mL o in un contenitore per campioni chirurgici.</li>
	<li>Ottenere campioni chirurgici da un intervento di biopsia omentale o omentectomia. Immergere il campione sterile in terreni di coltura dell'omento subito dopo la rimozione in sala operatoria. Se il flusso di lavoro non lo consente, posizionare il campione nel terreno di coltura dell'omento il prima possibile. Trasferire il campione mettendolo su ghiaccio e conservarlo a 4 °C fino al trattamento. NOTA: La dimensione del campione di omento rimosso determinerà la quantità di tessuto lavorabile.</li>
	<li>Processare il campione di omento entro 1-2 ore dalla raccolta utilizzando una cappa a flusso laminare. Assicurarsi che tutti i materiali e gli strumenti siano sterili o sterilizzati.</li>
	<li>Rimuovere l'omento dal contenitore di raccolta e trasferirlo in un piatto di coltura da 100 mm. Immergere il campione in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) e lavare delicatamente il campione per rimuovere eventuali coaguli di sangue o detriti.</li>
	<li>Tagliare il tessuto in pezzi (0,5 cm x 0,5 cm o 100-200 mg; Figura 2A) utilizzando piccole forbici chirurgiche o un bisturi da 10-15 mm. Utilizzare piccole pinze chirurgiche per aiutare a manipolare il tessuto ed evitare di schiacciare l'omento. Se è stato utilizzato un dispositivo energetico per rimuovere chirurgicamente il campione di omento, evitare di utilizzare il tessuto distorto sul bordo sigillato.</li>
	<li>Posizionare ogni pezzo di omento tagliato in singoli pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzetti e riempire i pozzetti con 500 μL di terreno di coltura per omento o fino a un volume sufficiente a coprire l'omento senza consentire al pezzo di omento di galleggiare sopra il pavimento del pozzetto (Figura 2B).</li>
	<li>Conservare i pezzi di omento in terreni di coltura freschi a 4 °C fino al momento dell'iniezione.</li>
</ol>2. Preparazione delle cellule tumorali ovariche
<ol><li>Colture di cellule di carcinoma ovarico umano in un matraccio da 75 cm 2 a 37 °C e 5% di CO2 ad almeno il 75% di confluenza entro il giorno della raccolta dell'omento. NOTA: Questo protocollo utilizza cellule di carcinoma ovarico umano OCSC1-F2 mCherry-positive precedentemente descritte15,16,17,18. Può essere modificato in qualsiasi linea cellulare tumorale marcata con un segnale di fluorescenza.</li>
	<li>Preparare le cellule all'interno di una cappa a flusso laminare subito dopo la raccolta del campione di omento. Assicurarsi che tutti i materiali e gli strumenti siano sterili o sterilizzati.</li>
	<li>Aggiungere 10 ml di PBS sterile 1x al pallone di coltura e lavare le cellule facendo oscillare delicatamente il pallone. Rimuovere 1x PBS e quindi aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA allo 0,05%.</li>
	<li>Agitare delicatamente il pallone di coltura per rivestire tutte le cellule, quindi porre il pallone in un incubatore (37 °C e 5% di CO2 ) per non più di 5 minuti. Picchiettare il pallone di coltura per staccare completamente le cellule, quindi neutralizzare la tripsina aggiungendo 3 mL di terreno di coltura dell'omento.</li>
	<li>Miscelare la sospensione cellulare mediante pipettaggio, quindi trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 1.200 x g a 24 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 6 mL di terreno di coltura fresco per omento.</li>
	<li>Conta le cellule usando un ematotometro. Diluire la sospensione cellulare ad almeno 100.000 cellule per 100-200 μL di sospensione. Questo è il volume di iniezione in ogni pezzo tagliato di omento.</li>
	<li>Trasferire un numero appropriato di cellule in un nuovo matraccio di coltura per continuare il passaggio cellulare.</li>
</ol>3. Iniezione di cellule tumorali ovariche
<ol><li>Utilizzare una siringa da 1 mL per aspirare la sospensione cellulare, quindi inserire un ago da 26 G. Non aspirare la sospensione cellulare con l'ago, poiché ciò può frammentare le cellule.</li>
	<li>Usa piccole pinze chirurgiche per raccogliere un pezzo di omento tagliato. Trasferire l'omento in una capsula sterile separata per facilitare l'iniezione. Perforare delicatamente l'omento con la punta dell'ago e iniettare un piccolo volume di sospensione cellulare nel tessuto (Figura 2C).</li>
	<li>Ripetere l'iniezione su diverse aree di omento fino a un volume totale di almeno 100 μL o 100.000 cellule. Si noti che gran parte della sospensione cellulare può sembrare ristagnare intorno al campione. In caso di dubbi sulla qualità dell'iniezione, ripetere l'iniezione o iniettare un volume maggiore di sospensione cellulare nel campione.</li>
	<li>Restituire i campioni di omento iniettati in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti. Si noti che il volume dei terreni di coltura dell'omento è a un livello tale da coprire l'omento senza lasciarlo galleggiare. Maneggiare con cura la piastra e posizionarla all'interno di un'incubatrice (37 °C e 5% di CO2 ).</li>
	<li>OPZIONALE: Utilizzare Matrigel (matrice di membrana basale) per sospendere il tessuto dell'omento in una matrice solida per consentire un'iniezione più facile e una somministrazione di sospensione cellulare più concentrata.<ol><li>Scongelare la matrice di membrana basale a 4 °C e miscelare in rapporto 1:1 con terreni di coltura per omento immediatamente prima dell'uso. Conservare la miscela di matrice di membrana basale su ghiaccio o a 4 °C fino all'iniezione. Riempire i pozzetti vuoti con una quantità sufficiente di miscela di matrice di membrana basale per immergere un pezzo tagliato di omento.</li>
		<li>Posizionare i campioni nella miscela di matrice della membrana basale e quindi posizionare la piastra di coltura a 24 pozzetti in un incubatore (37 °C e 5% di CO2 ) per 20 minuti. Una volta che la miscela si è solidificata, continuare con l'iniezione come descritto sopra.</li>
	</ol></li>
	<li>Confermare l'avvenuta iniezione utilizzando l'imaging fluorescente. Assicurarsi che venga visualizzata una striscia di segnale fluorescente nei siti di iniezione (Figura 2D). Si noti che il numero effettivo di cellule attaccate all'omento dopo l'iniezione è imprevedibile.</li>
</ol>4. Co-coltura di cellule tumorali umane e tumorali ovariche
<ol><li>Cambiare terreno ogni 48-72 ore aggiungendo 500-2000 μL di terreno di coltura fresco per omento. Non pipettare il terreno direttamente sopra il tessuto dell'omento, poiché ciò potrebbe spostare le cellule tumorali. Si noti che se il colore del supporto diventa giallo, cambiare il supporto. NOTA: La frequenza di sostituzione del terreno dipenderà dal volume del terreno utilizzato e dalla traiettoria di crescita delle cellule tumorali. Una volta che le cellule tumorali hanno seminato l'omento, non è più importante se il pezzo di omento galleggia o meno.</li>
	<li>OPZIONALE: Se è stata utilizzata una matrice di membrana basale, la matrice verrebbe in genere dissolta al momento del primo cambio di fluido.</li>
	<li>Monitorare la crescita dei tumori del cancro ovarico utilizzando l'imaging fluorescente. La frequenza dell'imaging è a discrezione dello sperimentatore. Anticipare l'evidenza di tumori di piccole dimensioni di circa 14 giorni (Figura 3A-C). I risultati possono variare a seconda della qualità dell'iniezione.</li>
	<li>Terminare l'esperimento in base all'endpoint dell'esperimento. NOTA: La crescita del tumore e l'integrità del tessuto omentoso sono state osservate negli ultimi 50 giorni.</li>
</ol>

Stabilire un modello 3D ex vivo per l'interazione cancro ovarico-omento

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li>
<li>Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+of+the+ovary%2C+fallopian+tube%2C+and+peritoneum%3A+2021+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynaecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update.</a> Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).</li>
<li>Ledermann, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+diagnosed+and+relapsed+epithelial+ovarian+carcinoma%3A+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis%2C+treatment+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).</li>
<li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).</li>
<li>Morgan, R. J. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer.+Clinical+practice+guidelines+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Compr+Canc+Netw%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology.</a> J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Motohara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolving+story+of+the+metastatic+voyage+of+ovarian+cancer+cells%3A+cellular+and+molecular+orchestration+of+the+adipose-rich+metastatic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment.</a> Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).</li>
<li>Di Nicola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omentum+a+powerful+biological+source+in+regenerative+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Omentum a powerful biological source in regenerative surgery.</a> Regen Ther. 11, 182-191 (2019).</li>
<li>Meza-Perez, S., Randall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+functions+of+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological functions of the omentum.</a> Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).</li>
<li>Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+immune+responses+in+the+peritoneal+cavity+and+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum.</a> J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+facilitate+ovarian+cancer+premetastatic+niche+formation+in+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum.</a> J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).</li>
<li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+microenvironment+promotes+Bclxl+expression+and+confers+chemoresistance+in+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells.</a> Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes%3A+key+players+in+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 95(2019).</li>
<li>Zhang, Z., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue%3A+The+dysfunctional+adipocyte+-+a+cancer+cell%27s+best+friend%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte - a cancer cell's best friend.</a> Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).</li>
<li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRX-E-002-1+Induces+c-Jun-dependent+apoptosis+in+ovarian+cancer+stem+cells+and+prevents+recurrence+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo.</a> Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).</li>
<li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+detection+of+intraperitoneal+micrometastasis+using+an+ovarian+cancer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model.</a> Sci Rep. 7, 40989(2017).</li>
<li>Craveiro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+modifications+in+ovarian+cancer+stem+cells+following+Paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment.</a> Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).</li>
<li>Sumi, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+for+non-invasive+imaging+to+detect+and+monitor+ovarian+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence.</a> J Vis Exp. (93), e51815(2014).</li>
<li>Agarwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+expression+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).</li>
<li>Kelly, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-4+signaling+promotes+tumor+growth+and+paclitaxel+chemoresistance+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer.</a> Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBX7+binds+the+E-box+to+inhibit+TWIST-1+function+and+inhibit+tumorigenicity+and+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential.</a> Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).</li>
<li>Tedja, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+epithelial-mesenchymal+hybrid+cancer+cells+with+tumorigenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 15030684(2023).</li>
<li>Dauleh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cultured+mesothelial+cells+derived+from+the+murine+adult+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum.</a> PLoS One. 11 (7), e0158997(2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Utilizzando questo protocollo, è stato sviluppato un modello preclinico di carcinosi peritoneale per il carcinoma ovarico utilizzando una combinazione di tecniche di base in vitro ed ex vivo. Una crescita progressiva del tumore è stata osservata in 50 giorni di co-coltura dopo aver seminato campioni di omento con cellule di carcinoma ovarico umano mCherry+ OCSC1-F2. Questo metodo è stato sviluppato e ottimizzato in diverse prove sperimentali utilizzando diversi campioni di omento. Il successo della crescita del tumore dipendeva dalla qualità dell'omento, dalla vitalità delle cellule tumorali e dall'efficacia dell'iniezione. In questo rapporto, sono state utilizzate solo cellule mCherry+ OCSC1-F2 e linee di carcinoma ovarico umano mCherry+ R182 precedentemente riportate in diverse pubblicazioni 12,15,16,17,18,19,20,21,22. Utilizzando queste due linee cellulari con tempi di raddoppio diversi (16 ore per OCSC1-F2 e 36 ore per R182), è stata notata una differenza nel tempo per raggiungere la crescita logaritmica all'interno del tessuto omentale. Ciononostante, siamo riusciti a stabilire entrambe le linee cellulari nel sistema di co-coltura.
Una comunicazione efficiente tra i ricercatori, i coordinatori della ricerca e le équipe chirurgiche è stata fondamentale per la raccolta e l'elaborazione dei campioni di omento. Lo sperimentatore ha identificato i candidati al protocollo, i coordinatori della ricerca hanno ottenuto il consenso dei pazienti prima dell'intervento chirurgico e lo sperimentatore ha raccolto i campioni dalla sala operatoria. Dato questo flusso di lavoro, il programma dello sperimentatore doveva essere flessibile poiché molti fattori del paziente che influenzavano la raccolta erano imprevedibili (ad esempio, l'intervento chirurgico annullato, l'ora dell'intervento chirurgico modificata, l'omento inadeguato o assente rimosso). La visualizzazione diretta e la selezione dei tessuti dalla sala operatoria hanno garantito l'integrità del campione, la sterilità chirurgica e l'elaborazione tempestiva. Inizialmente, la raccolta dei campioni era delegata ai coordinatori della ricerca; Tuttavia, dopo la raccolta di alcuni campioni, abbiamo notato che il tempo di elaborazione era ritardato (cioè >4 ore) e la qualità dell'omento era gravemente inferiore (ad esempio, il tessuto era a pezzi). In uno studio sperimentale, il tessuto omentale è stato conservato a 4 °C per 48 ore prima dell'iniezione perché le cellule tumorali non erano pronte in tempo. È stata osservata una crescita tumorale simile, ma questa sequenza non è stata ripetuta poiché è noto che le variazioni di temperatura influenzano il microambiente tumorale (TME).
Prima della raccolta del campione, era importante avere cellule tumorali sufficientemente confluenti secondo il programma chirurgico. Poiché il numero di campioni raccolti ogni mese variava, le colture attive di cellule di carcinoma ovarico non venivano sempre mantenute. Le cellule congelate sono state scongelate con almeno 1 settimana di anticipo, placcate utilizzando un protocollo standard e quindi passate le cellule almeno una volta per garantire la vitalità. Le linee cellulari utilizzate in questo protocollo erano relativamente resistenti; Tuttavia, abbiamo ancora riscontrato casi in cui le cellule non si erano riprese entro il giorno dell'intervento chirurgico e non potevano essere iniettate. In questo studio, non c'è stato alcun tentativo di iniettare cellule tumorali che erano meno del 50% confluenti. I successivi ritardi relativi alla preparazione delle cellule sono stati mitigati utilizzando una buona tecnica sterile e dividendo le cellule in rapporti per mantenere la confluenza a seconda del programma di raccolta dei campioni previsto. Abbiamo limitato il protocollo a solo due linee cellulari tumorali marcate con fluorescenza, ma è importante notare che potrebbero essere utilizzate anche altre linee cellulari tumorali consolidate o cellule tumorali primarie senza proteine fluorescenti.
Infine, il tasso di crescita del tumore è stato correlato alla confluenza di cellule tumorali adiacenti e all'interno degli adipociti immediatamente dopo l'iniezione. Questo è stato determinato prendendo immagini fluorescenti di tutti i campioni di omento dopo l'iniezione. Rispetto all'inoculazione con cellule tumorali di organi solidi o tessuti sottocutanei, l'iniezione di cellule tumorali nel tessuto omentale è stata più impegnativa. La struttura sciolta e la consistenza grassa dell'omento impediscono al tessuto di trattenere efficacemente volumi di sospensione cellulare senza perdite. Quando è stato utilizzato un ago più piccolo (cioè 30 G o più stretto) per iniettare, c'era preoccupazione per la frammentazione cellulare poiché la proliferazione cellulare era diminuita. Abbiamo testato varie tecniche di iniezione, numero di cellule e volumi di sospensione cellulare e abbiamo trovato risultati coerenti con il protocollo sopra descritto. Allo stesso tempo, riconosciamo che è probabile che tali variazioni del protocollo producano ancora risultati simili, data la natura maligna delle cellule. L'aggiunta di Matrigel ha reso più facile la fase di iniezione in quanto la matrice extracellulare ha trattenuto meglio la sospensione cellulare; Tuttavia, questo metodo è più costoso e non ha prodotto costantemente un carico tumorale più elevato nei campioni. Nel complesso, era raro che uno qualsiasi degli esemplari di omento non sviluppasse tumori, ma il numero di tumori e la velocità di crescita variavano.
Questo modello ha simulato un segno distintivo della tumorigenesi del cancro ovarico replicando le metastasi precoci ai tessuti peritoneali ricchi di adiposo. Questo protocollo consente variazioni senza alcuna competenza richiesta, è facile da replicare e genera un sistema con un potenziale valore traslazionale. Rispetto ai modelli esistenti in vitro ed ex vivo nel carcinoma ovarico, il metodo qui descritto combina diverse tecniche per produrre un modello che conserva l'architettura del tumore e la TME per una lunga durata di vita. Inoltre, abbiamo osservato che quando un campione di omento con tumori multipli è stato trasferito in un nuovo pozzetto e coltivato con omento privo di cancro (cioè non iniettato), l'omento naïve è stato seminato con cellule tumorali entro 7 giorni. Questa scoperta suggerisce che i tumori replicati mantengono il potenziale metastatico attraverso la transizione epiteliale-mesenchimale. Non sono stati identificati modelli simili di carcinoma ovarico in letteratura che hanno coltivato biopsie tissutali per lunghi periodi di tempo. Questo approccio è supportato da una precedente scoperta secondo cui le cellule mesoteliali isolate dall'omento di topo potevano essere coltivate per più di 30 passaggi dopo la raccolta23.
Il modello descritto in questo studio può essere utilizzato per comprendere ulteriormente l'effetto dell'interazione diretta tra le cellule tumorali ovariche e le cellule all'interno dell'omento ricco di adiposi. Le cellule tumorali possono essere dissociate dai tessuti dell'omento e ottenute per l'analisi trascrittomica o immunoistochimica (IHC). Inoltre, le cellule possono essere utilizzate per studi di risposta ai farmaci.
I limiti principali di questo modello sono che il numero di tumori, il tasso di crescita del tumore e la posizione dei tumori erano imprevedibili. La mancanza di standardizzazione e la variazione tra i campioni potrebbero limitare l'applicazione di questo modello. Abbiamo anche fatto diverse osservazioni che richiederanno un ulteriore esame durante lo sviluppo di questo protocollo. Ad esempio, le repliche "di controllo" in un esperimento non erano effettivamente prive di cancro poiché al paziente è stata successivamente diagnosticata una micrometastasi omentale; Tuttavia, i tumori non iniettati sono rimasti vitali per tutto il periodo sperimentale. Le applicazioni future di questo modello includeranno studi molecolari della TME durante la tumorigenesi precoce, la manipolazione della TME mediante iniezione di cellule immunitarie e le indagini sulla risposta ai farmaci. In sintesi, riteniamo che il modello preclinico qui descritto si aggiungerà al repertorio degli strumenti di ricerca esistenti e aiuterà a chiarire i meccanismi molecolari della TME nel carcinoma ovarico.

Il carcinoma ovarico è la neoplasia ginecologica più letale al mondo1. Il rischio di sviluppare questo tumore nel corso della vita è di circa 1 su 70, con un'età mediana di diagnosi di 63 anni2. Le neoplasie ovariche primarie sono classificate istologicamente come epiteliali o non epiteliali. I tumori ovarici epiteliali (EOC) rappresentano oltre il 90% dei tumori e il sottotipo più comune è il carcinoma sieroso di alto grado (HGSC), che rappresenta circa il 70%-80% degli EOC. Attualmente, non esistono metodi di screening efficaci per rilevare precocemente la malattia. Quindi la maggior parte dei pazienti viene diagnosticata in uno stadio avanzato (cioè Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] stadio III o IV) dopo che il cancro si è diffuso in tutta la cavità peritoneale2.
Il trattamento standard di prima linea è la chirurgia citoriduttiva per rimuovere tutta la malattia macroscopica visibile, seguita da chemioterapia adiuvante a base di platino per distruggere qualsiasi malattia microscopica residua. Sebbene ci siano stati molti progressi nel trattamento del cancro ovarico negli ultimi due decenni, circa il 70% delle pazienti con malattia avanzata avrà una recidiva entro 3 anni dal trattamento3. Data la prognosi complessivamente sfavorevole di questi pazienti, gli sforzi di ricerca traslazionale in corso e futuri nell'EOC mirano a identificare biomarcatori per la diagnosi precoce, prevenire le metastasi, migliorare le terapie attuali per eludere la resistenza e sviluppare nuovi trattamenti personalizzati per il cancro.
Le metastasi generalizzate all'interno della cavità peritoneale e la chemioresistenza associata sono due delle principali limitazioni per il miglioramento del trattamento delle pazienti con carcinoma ovarico 4,5. L'omento, una struttura grassa simile a un grembiule che pende dallo stomaco sopra l'intestino, è una delle principali sedi di metastasi del cancro ovarico 6,7. Oltre alla sua funzione di barriera fisica, è stato dimostrato che l'omento ha capacità rigenerative e angiogeniche e possiede attività immunitarie, che insieme promuovono la vascolarizzazione, accelerano la guarigione delle ferite e limitano le infezioni8. Contiene un'alta concentrazione di cellule staminali che possono differenziarsi in vari tipi di cellule e possono aiutare a riparare i tessuti danneggiati. L'omento può infiammarsi in risposta a lesioni o infezioni, che innescano la migrazione delle cellule immunitarie verso il sito della lesione9. Queste cellule immunitarie rilasciano fattori di crescita e altre molecole che aiutano a promuovere la riparazione e la rigenerazione dei tessuti danneggiati. Le cellule immunitarie, come macrofagi, linfociti e plasmacellule, localizzate nell'omento sono strutture note come "macchie lattiginose", responsabili del rilevamento e dell'attacco degli agenti patogeni e della regolazione dell'immunità peritoneale. È stato anche dimostrato che l'omento svolge un ruolo nell'indurre la tolleranza immunitaria10, che è la capacità del sistema immunitario di tollerare gli autoantigeni e non attaccare i tessuti sani. Tuttavia, le stesse attività immuno-correlate sono coinvolte anche nelle risposte patologiche, come la crescita di tumori omentali, le metastasi e la fuga dalla sorveglianza immunitaria 9,11. Precedenti studi del nostro laboratorio e di altri hanno dimostrato un ruolo unico e attivo del microambiente adiposo nell'inibizione delle risposte immunitarie antitumorali e nell'acquisizione della chemioresistenza12,13,14. Purtroppo, abbiamo informazioni limitate sui meccanismi cellulari e molecolari attraverso i quali l'omento fornisce un microambiente pro-tumorale.
Per comprendere meglio le interazioni tra le cellule tumorali e l'omento, è stato sviluppato un sistema di coltura 3D costituito da cellule di cancro ovarico umano ed espianti di omento derivati da pazienti. Il protocollo qui descritto rappresenta un nuovo modello ex vivo di carcinosi peritoneale. Questo modello imita la progressione naturale della tumorigenesi del cancro ovarico in questo tessuto ricco di adiposi. Il modello proposto è facile da generare, poco costoso e potenzialmente applicabile alle indagini traslazionali nella ricerca sul cancro ovarico.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina da 1 ml con ago staccabile da 26 G</td><td>BD</td><td>329652</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 10 ml</td><td>CELLTREAT</td><td>229010B</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale da 100 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Tubo da centrifuga da 15 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>24 pozzetti Piastra di coltura</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 50 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 Pallone per coltura tissutale</td><td>CELLTREAT</td><td>229341</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell Counter Corning</td><td></td><td>9819000</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 imager</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutammina, +2.438 g/L di sodio Gibco bicarbonato</td><td></td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino, qualificato</td><td>Gibco</td><td>1043028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Matrice a membrana basale</td></tr><tr><td>n. 10 Bisturi monouso in acciaio inossidabile</td><td>Integra-Miltex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr> soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato, pH 7,4 ( 1x)</td><td>Microscopio Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Revolve</td><td>Echo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

Il cancro ovarico è il tumore maligno ginecologico più mortale. L'omento svolge un ruolo chiave nel fornire un microambiente di supporto alle cellule di carcinoma ovarico metastatico, nonché segnali immunomodulatori che consentono la tolleranza al tumore. Tuttavia, abbiamo modelli limitati che imitano da vicino l'interazione tra le cellule tumorali ovariche e i tessuti ricchi di adiposo. Per comprendere ulteriormente i meccanismi cellulari e molecolari attraverso i quali l'omento fornisce un microambiente pro-tumorale, abbiamo sviluppato un modello 3D ex vivo unico dell'interazione cellula tumorale-omento. Utilizzando l'omento umano, siamo in grado di far crescere cellule tumorali ovariche all'interno di questo microambiente ricco di adiposi e monitorare i fattori responsabili della crescita del tumore e della regolazione immunitaria. Oltre a fornire una piattaforma per lo studio di questo microambiente tumorale ricco di adiposi, il modello fornisce un'eccellente piattaforma per lo sviluppo e la valutazione di nuovi approcci terapeutici per colpire le cellule tumorali metastatiche in questa nicchia. Il modello proposto è facile da generare, poco costoso e applicabile alle indagini traslazionali.

L'insediamento riuscito delle cellule di carcinoma ovarico in campioni di omento è stato evidente intorno al giorno 14 (Figura 3A-C). Almeno 24 repliche sono state preparate e iniettate per ogni campione raccolto per consentire ulteriori esperimenti. La crescita del tumore è stata monitorata scattando immagini fluorescenti (Figura 3D,E). Le immagini dovevano essere attentamente interpretate poiché un monostrato di cellule tumorali cresceva anche sul fondo di ogni pozzetto che non era attaccato all'omento. Abbiamo preferito scattare immagini dell'omento quando era sospeso nel terreno per evitare la sovrapposizione dei segnali fluorescenti con il monostrato della cellula tumorale.
L'assenza di un segnale fluorescente entro il giorno 14 può essere considerata come iniezioni fallite. È stato osservato che le cellule tumorali inizialmente si sono diffuse sulla superficie dell'omento durante i primi 7 giorni, ma nel tempo si sono riunite per formare tumori (Figura 3A-D). Una misura surrogata per il carico tumorale tra i campioni era la velocità con cui i terreni di coltura dell'omento cambiavano colore da rosso a giallo (Figura 3F). Abbiamo utilizzato l'imaging fluorescente, la revisione istologica e l'ispezione macroscopica per confermare la crescita del tumore e la vitalità del tessuto omentale negli ultimi 50 giorni di co-coltura (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig01.jpg"> Figura 1: Illustrazione delle fasi generali del protocollo. (A) Fase 1: Preparazione dell'omento; (B) Fase 2: iniezione di cellule tumorali; (C) Fase 3: creazione del microambiente cellula-omento tumorale. (Figura preparata in BioRender.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig02.jpg"> Figura 2: Preparazione e iniezione di cellule tumorali nell'omento . (A) L'omento viene tagliato in pezzi di 1x1 cm. (B) Ogni pezzo viene posto in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e coperto con 500 μL di terreno. (C) Iniezione di cellule tumorali nel pezzo di omento. (D) Dopo l'iniezione si osserva una serie di cellule tumorali fluorescenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig03.jpg"> Figura 3: Immagini rappresentative dopo 14 e 25 giorni di co-coltura. (A-C) Immagini rappresentative dopo 14 giorni di co-coltura: (A) fase, (B) canale mCherry, (C) fusione. (D-E) Immagini rappresentative dopo 25 giorni di co-coltura. (F) Il cambiamento del colore del terreno da rosa a giallo è un'indicazione del successo dell'iniezione di cellule tumorali e dell'instaurazione di co-coltura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig04.jpg"> Figura 4: Morfologia macroscopica e colorazione con ematossilina ed eosina (H&amp;E). (A,B) Morfologia macroscopica rappresentativa delle co-colture al giorno 50; le frecce indicano i siti di crescita delle cellule di carcinoma ovarico mCherry+. (C,D) Colorazione rappresentativa H&amp;E delle co-colture al giorno 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive la creazione di un modello tridimensionale (3D) ex vivo dell'interazione cellula tumorale-omento. Il modello fornisce una piattaforma per chiarire i meccanismi pro-tumorali all'interno della nicchia adiposa e per testare nuove terapie.

Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

Gli studi attuali utilizzano sistemi di co-coltura composti da adipociti isolati e cellule tumorali ovariche. Questi adipociti sono differenziati in vitro dai pre adipociti. Queste cellule vengono quindi separate attraverso un inserto transwell e quindi mancano di contatto diretto da cellula a cellula.Questo metodo di coltura ex vivo offre un modello per studiare l'interazione diretta delle cellule tumorali con il microambiente adiposo. Il nostro modello preserva la struttura della quantità di moto umana e quindi mantiene i vari tipi di cellule che si trovano tipicamente in questo organo. Oltre agli adipociti, queste cellule includono fibroblasti di supporto e cellule immunitarie.Questo modello mantiene anche queste cellule nella loro matrice intrinseca. Questo modello fornisce un'eccellente piattaforma per lo sviluppo e la valutazione di nuovi approcci terapeutici per colpire le cellule tumorali metastatiche in questa nicchia.

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Il saggio di liquidazione mesoteliali qui descritto si avvale di cellule fluorescente e microscopia time-lapse video visualizzare e misurare quantitativamente le interazioni di sferoidi multicellulari di cancro ovarico e monostrati di cellule mesoteliali. Questo saggio modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico.

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

In questo video, dimostriamo lo sviluppo di un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale. Questa coltura organotipica può aiutare a studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione delle metastasi del cancro ovarico nel rivestimento della cavità peritoneale: un metodo per stabilire un modello 3D in vitro del rivestimento peritoneale

Questo video descrive il protocollo per isolare le cellule mesoteliali umane primarie dal campione di omento umano. Le cellule mesoteliali possono essere utilizzate per stabilire un modello di carcinoma ovarico in vitro per studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Isolamento delle cellule mesoteliali: una tecnica per isolare le cellule mesoteliali primarie da un campione di tessuto di omento umano

In questo video, stabiliamo una coltura di organi omentali ex vivo sovrapposta a cellule di cancro ovarico che esprimono GFP per studiare la colonizzazione del cancro ovarico all'interno dell'espiante omentale. Questo protocollo analizza le strutture delle cellule immunitarie all'interno dell'omento, note come macchie lattiginose che promuovono le metastasi.

Modellazione della colonizzazione cellulare del cancro ovarico dell'omento: un metodo ex vivo per stabilire la colonizzazione della macchia lattiginosa di cellule di cancro ovarico marcate in fluorescenza in espianti di omento murino

Questo video descrive il protocollo per la creazione di un modello sperimentale murino per studiare lo sviluppo del tumore e le metastasi peritoneali. Questo modello di carcinoma ovarico è generato dall'inoculazione ortotopica di cellule di carcinoma ovarico epiteliale umano nelle ovaie di un topo femmina.

Inoculazione ortotopica di cellule di cancro ovarico nell'ovaio murino: una procedura per stabilire un modello murino di cancro ovarico per studiare la disseminazione peritoneale delle cellule

Delineiamo un protocollo che implementa approcci sia in vivo che ex vivo per studiare la colonizzazione del cancro ovarico dei tessuti adiposi peritoneali, in particolare dell'omento. Inoltre, presentiamo un protocollo per quantificare e analizzare le strutture cellulari immunitarie nell'omento, note come macchie lattiginose, che promuovono le metastasi del adiposo peritoneale.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

Le metastasi del cancro ovarico sono caratterizzate da numerose lesioni diffuse intra-peritoneali, tali da rendere difficile un'accurata quantificazione visiva del carico tumorale.  Qui descriviamo un metodo per la quantificazione in situ ed ex vivo del carico tumorale metastatico utilizzando cellule tumorali marcate con proteina fluorescente rossa (RFP) e imaging ottico.

La quantificazione di intra-peritoneale del cancro ovarico metastasi

Qui, presentiamo un protocollo per costruire un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale, composto da cellule mesoteliali umane primarie e fibroblasti stratificati con matrice extracellulare, come strumento per studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano

Per chiarire il processo a più fasi di diffusione peritoneale del carcinoma ovarico, questo studio presenta un modello sperimentale murino di sviluppo del tumore originale e metastasi peritoneali tramite inoculazione ortotopico con queste cellule tumorali.

Modello murino sperimentale di sviluppo del tumore originale e peritoneale Metastasi<em&gt; via</em&gt; Ortotopico inoculazione con cellule dell&#39;ovaio Carcinoma

Questo manoscritto descrive lo sviluppo di un modello animale che permette di testare direttamente gli effetti dell'ipossia tumorale sulle metastasi e di decifrare i meccanismi della sua azione. Sebbene gli esperimenti qui descritti si concentrino sul sarcoma di Ewing, un approccio simile può essere applicato ad altri tipi di tumore.

Modello in vivo per la prova Effetto dell&#39;ipossia sul tumore metastasi

Scopri un modello 3D ex vivo per studiare le metastasi peritoneali del carcinoma ovarico utilizzando omento umano. Questo metodo preserva la struttura tissutale e permette di testare nuove terapie.

Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

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