Analisi della tomografia microcomputerizzata del ginocchio in porcellini d'India Dunkin-Hartley invecchiati dopo iniezione intra articolare

L'osteoartrite, o OA, è una malattia degenerativa delle articolazioni che colpisce 32,5 milioni di adulti statunitensi. Spesso, i sintomi dell'OA compaiono solo dopo che la malattia è diventata grave. La mancanza di farmaci modificanti la malattia deriva da una scarsa comprensione dei meccanismi che avviano e guidano la malattia.

Di conseguenza, c'è un bisogno medico critico e continuo di agenti migliorati per il trattamento dell'OA. I porcellini d'india Dunkin-Hartley sono un modello animale di OA consolidato, in quanto sviluppano naturalmente questa malattia, offrendo un modello robusto per studiare gli effetti di nuove terapie somministrate per iniezione intraarticolare sulla progressione della malattia. Poiché l'osso mineralizzato ha un eccellente contrasto alla micro-TC, questa modalità può essere utilizzata per valutare le caratteristiche 3D ed eseguire analisi quantitative dei cambiamenti associati all'OA. Due misure quantitative particolarmente rilevanti includono la densità minerale ossea e lo spessore trabecolare, poiché entrambi aumentano durante la progressione della malattia. La metodologia descritta delle iniezioni intraarticolari nelle cavie e la successiva analisi dei dati micro-CT contribuiranno a ridurre la variabilità dello studio e ad aumentare l'efficienza delle analisi dei dati.

Radere il ginocchio con un rasoio elettrico. Anestetizzare l'animale e confermare un'adeguata profondità di anestesia in caso di mancanza di risposta al pizzicamento delle dita. Mettere del lubrificante oculare sterile in entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione e le lesioni.

Pulire il sito di iniezione tre volte con un movimento circolare e alternare utilizzando lo scrub diluito e le soluzioni alcoliche. Devono essere utilizzati guanti sterili. Questo video include l'uso di guanti nitro per autoclave.

La tecnica asettica deve essere utilizzata durante tutta la procedura. Flettere il ginocchio a 90 gradi, spostare il dito distalmente alla rotula per individuare il solco dell'aspetto distale dello spazio articolare flettendo ed estendendo l'arto posteriore. La tibia può essere percepita come la struttura ossea distale alla rotula.

Una volta determinata la posizione della tibia e della rotula, l'articolazione si trova tra di loro. Inserire con cautela l'ago da insulina nella linea mediana distale alla rotula all'interno dello spazio articolare. L'ago deve essere inserito uno o due millimetri sotto la pelle.

Iniettare il volume lentamente. Massaggiare il ginocchio flettendo ed estendendo l'articolazione alcune volte per garantire una corretta distribuzione del farmaco. Collocare i campioni con formalina in un contenitore compatibile.

Calibrare la macchina micro-CT per esposizioni in campo scuro e campo chiaro, secondo le raccomandazioni del produttore. Scansione del campione con filtro in alluminio e rame a 18 micron. Utilizzare il passo di rotazione di 0,7 gradi per 360 gradi con la fotocamera offset.

Selezionare una fetta dalle immagini micro-CT. Controllare la compensazione del disallineamento. Nelle impostazioni, applica l'arrotondamento, l'indurimento del raggio, la rotazione CS e l'artefatto dell'anello.

Selezionare Avvia per avviare la ricostruzione. Selezionare VOI e orientare il campione in modo che si allinei verticalmente per facilitare l'analisi in un secondo momento. Salva il VOI modificato come nuova cartella.

Selezionare l'intervallo di immagini da analizzare, a partire dalla piastra subcondrale. Si consiglia di dividere l'analisi della placca subcondrale nell'osso trabecolare perché hanno caratteristiche ossee diverse. Seleziona la regione di interesse per ogni immagine per assicurarti che includa l'osso.

Seleziona la selezione binaria. Regola l'istogramma in modo che lo sfondo nell'osso sia completamente separato. Selezionare la scheda densità minerale ossea.

Salvare i dati in una nuova cartella dei dati di analisi. Seleziona l'elaborazione personalizzata. Innanzitutto, eseguire la soglia e selezionare Automatico, quindi eseguire.

Quindi seleziona Elimina macchie e scegli Rimuovi macchie nere. Ripeti Elimina macchie e scegli Rimuovi macchie bianche. Scegliere Analisi 3D e selezionare i valori di base e i valori aggiuntivi.

A mostra un ginocchio sezionato con presenza di colorante blu di metilene all'interno dello spazio articolare, mostrando una corretta iniezione. B è un'iniezione superficiale che provoca la formazione di una bolla nello spazio sottocutaneo. C mostra la mancanza di colorante blu di metilene all'interno dello spazio articolare, mostrando un'iniezione errata.

Può essere utile suddividere l'analisi per la placca subcondrale, che è mostrata in A e l'osso trabecolare, che è mostrato in B, poiché a volte hanno parametri diversi per diverse analisi ossee. Per la densità minerale ossea, vediamo che c'è un aumento della media dei porcellini d'India di 12 mesi rispetto ai porcellini d'India di cinque mesi, e questo è vero sia nella placca subcondrale che nell'osso trabecolare, il che dimostra che la densità minerale ossea aumenta nel tempo. Inoltre, per lo spessore trabecolare, vediamo che c'è un aumento della quantità di spessore in millimetri tra la cavia di 12 mesi e la cavia di nove mesi e la cavia di cinque mesi, il che dimostra che lo spessore trabecolare aumenta nel tempo.

I punteggi di Mankin modificati aumentano con l'invecchiamento dei porcellini d'India, come si vede nella figura A.Le figure da B a D mostrano macchie blu di toluidina. B è un porcellino d'india di cinque mesi, C è un porcellino d'india di nove mesi e D è un porcellino d'india di 12 mesi. L'asterisco nero nella figura C mostra la perdita di proteoglicani, mentre l'asterisco nero nella figura D mostra le fessure e l'asterisco bianco nella figura D mostra l'ipocellularità.

Attualmente l'unica cura per l'artrosi reumatoide grave è la sostituzione, che è costosa, invasiva e può causare morbilità e mortalità per i pazienti. Di conseguenza, c'è un disperato bisogno di continuare la ricerca con modelli animali di OA e lo sviluppo sostenuto di nuove terapie. Sebbene le iniezioni intraarticolari siano parte integrante degli studi sull'OA nel porcellino d'India, questa procedura deve ancora essere sistematicamente dettagliata.

Procedure di iniezione adeguate sono fondamentali per garantire il benessere degli animali e ridurre il numero complessivo di animali, in particolare per gli studi che richiedono iniezioni multiple nell'arco di molti mesi. Per valutare sistematicamente i cambiamenti correlati all'OA, descriviamo le analisi micro-CT. La micro-CT fornisce una valutazione più approfondita delle alterazioni dell'OA rispetto alla revisione istologica delle scansioni in un intero campione anziché in una o poche sezioni di tessuto.

Sebbene le cavie di Dunkin-Hartley forniscano un modello robusto per lo studio della progressione dell'OA e degli effetti di nuove terapie, ci sono dei limiti a questo modello. I modelli spontanei richiedono tipicamente un periodo di studio più lungo rispetto al rapido sviluppo di cambiamenti a seguito di OA chirurgica o indotta chimicamente. Inoltre, i ricercatori possono ridurre l'effetto della variabilità inter-animale applicando trattamenti a un arto in ciascun animale, consentendo all'arto controlaterale di fungere da controllo interno.