Name: Raccolta sul campo e manutenzione in laboratorio delle alghe giganti che formano la chioma per facilitare il ripristino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Scopri la tecnica della ghiaia verde per coltivare Macrocystis pyrifera e ripristinare le foreste di alghe. Questo protocollo dettagliato illustra la raccolta sul campo e la manutenzione in laboratorio.

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Questo lavoro è stato finanziato dal California Sea Grant Kelp Recovery Research Program R/HCE-17 a JBL e MESB, un premio di tirocinio di ricerca della National Science Foundation DGE-1735040 a PDD, The Nature Conservancy, Schmidt Marine Technology Partners, Sustainable Ocean Alliance, Tinker Foundation ad AP-L e The Climate Science Alliance Baja Working Group a RBL e JL. Ringraziamo Steven Allison, Cascade Sorte, Samantha Cunningham, Sam Weber e Caitlin Yee dell'Università della California, Irvine; Mark Carr, Peter Raimondi, Sarah Eminhizer, Anne Kapuscinski presso l'Università della California, Santa Cruz; Walter Heady e Norah Eddy presso The Nature Conservancy; Filipe Alberto e Gabriel Montecinos presso l'Università del Wisconsin, Milwaukee; Jose Antonio Zertuche-González, Alejandra Ferreira-Arrieta e Liliana Ferreira-Arrieta presso l'Universidad Autónoma de Baja California; Luis Malpica-Cruz, Alicia Abadía-Cardoso e Daniel Díaz-Guzmán di MexCal; i subacquei MexCalitos Alejandra Reyes, Monica Peralta, Teresa Tavera, Julia Navarrete, Ainoa Vilalta, Jeremie Bauer e Alfonso Ferreira; e Nancy Caruso per la consulenza tecnica. Ringraziamo l'Instituto de Investigaciones Oceanológicas, Universidad Autónoma de Baja California per aver fornito le strutture utilizzate per sviluppare il sistema di bagnomaria. Ringraziamo Ira Spitzer per i contenuti video subacquei e con droni.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il cambiamento climatico antropogenico è una minaccia crescente per la salute degli oceani del mondo 44,45,46,47,48, con conseguenti gravi perturbazioni e perdita di biodiversità 49,50,51,52. Per accelerare il ripristino degli ecosistemi degradati, le Nazioni Unite hanno dichiarato il 2021-2030 il "Decennio delle Nazioni Unite per il ripristino degli ecosistemi", in coincidenza con il "Decennio delle scienze oceaniche delle Nazioni Unite per lo sviluppo sostenibile", che mira a invertire il deterioramento della salute degli oceani53. In linea con questo invito globale all'azione, la Kelp Forest Alliance ha lanciato la Kelp Forest Challenge per ripristinare 1 milione di ettari e proteggere 3 milioni di ettari di foresta di alghe entro il 204054. Il ripristino marino è sottovalutato55 e gli ecosistemi di alghe ricevono molta meno attenzione rispetto ad habitat come le barriere coralline, le foreste di mangrovie e le praterie di fanerogame marine56. Il ripristino degli ecosistemi degradati ha dimostrato di essere efficace nella ricostruzione degli ecosistemi marini, ma può costare in media tra gli 80.000 e i 1.600.000 dollari per ettaro, con costi totali mediani che potrebbero essere da due a quattro volte superiori(57). Le perdite attuali e previste richiedono lo sviluppo di metodologie di ripristino delle alghe scalabili, fattibili ed economiche come interventi urgenti di conservazione.
Gli attuali sforzi di ripristino delle alghe utilizzano una combinazione di metodologie per affrontare i fattori specifici della perdita di alghe, tra cui il trapianto di alghe adulte, la semina diretta di zoospore e/o gametofiti, il controllo dei pascolatori e l'installazione di barriere artificiali11. Tuttavia, questi metodi richiedono risorse sostanziali e hanno una scalabilità limitata. Il tipico trapianto di alghe adulte richiede il laborioso dispiegamento di materiali o strutture artificiali sul benthos, da parte dei subacquei. Anche gli interventi dal basso verso l'alto per ristabilire le barriere coralline rocciose costiere, come il controllo dei concorrenti e dei pascolatori, sono limitati dai costi di manodopera in quanto si basano sulla rimozione manuale sott'acqua o sull'esclusione di questi fattori di stress biotici11. La tecnica della "ghiaia verde" supera questi limiti con un semplice dispiegamento dalla superficie, che non richiede installazioni subacquee o conoscenze tecniche e scalabilità a costi relativamente bassi28. Questo approccio innovativo fornisce uno strumento di restauro promettente, sollecitando prove approfondite in luoghi e ambienti diversi per sbloccare il suo pieno potenziale32.
Mentre sono stati documentati sforzi di ripristino di successo con la "ghiaia verde" nei fiordi riparati in Norvegia utilizzando l'alga da zucchero, Saccharina latissima26, questa tecnica è ancora in fase pilota per Macrocystis pyrifera nel Pacifico orientale. Sono necessari ulteriori studi per affrontare la sopravvivenza prevista degli espianti di M. pyrifera all'interno del suo areale. Nelle condizioni di esposizione alle onde, tipiche della crescita di M. pyrifera , la ghiaia più piccola può essere più soggetta a movimenti e abrasioni, portando a esemplari danneggiati. Inoltre, la galleggiabilità positiva fornita dalle pneumatocisti piene di gas di M. pyrifera può portare a espianti di "ghiaia verde" che vengono effettivamente portati via dal sito di ripristino e, quindi, le dimensioni e il peso della ghiaia sono fattori importanti da esplorare per questa specie. In un recente studio pilota (maggio 2022; Ensenada, Baja California, Messico), è stato osservato un successo preliminare sul campo con M. pyrifera , indicato dall'attaccamento degli apteri al substrato circostante e dalla crescita dei giovani che raggiungono 1,2 m di lunghezza dopo due mesi sul campo (Figura 4). Ciò dimostra una chiara opportunità che deve ancora essere esplorata nell'utilizzo della "ghiaia verde" per M. pyrifera nel Pacifico orientale. Questo video mostra la tecnica della "ghiaia verde" con M. pyrifera ed è una risorsa preziosa che semplifica e centralizza le pratiche esistenti nella fase di coltura del restauro per supportare gli studi che affrontano i successi e i limiti in diversi contesti di campo.
Con la tecnica della "ghiaia verde", molte singole unità di ghiaia più piccole possono essere seminate su una scala che può aumentare la probabilità di successo rispetto agli approcci di trapianto più comuni con piante adulte. Tuttavia, l'aspetto scalabile chiave di questa tecnica è il suo semplice dispiegamento dalla superficie, che può facilitare il ripristino di grandi aree in barca. Per gli ambienti di campo in cui l'impiego di ghiaia di piccole dimensioni non è adatto, questo protocollo può essere adattato per trapiantare M. pyrifera su un'ampia gamma di substrati, tra cui ghiaia più grande o anche piccoli massi, corde che possono essere legate ad ancoraggi subacquei naturali o dispiegati, o piastrelle che possono essere imbullonate o incollate con resina epossidica marina sul fondo del mare in condizioni più esposte. Questi adattamenti non modificheranno le strutture necessarie per la coltura di M. pyrifera , ma aumenteranno successivamente i costi di diffusione.
Le perturbazioni antropiche e i cambiamenti climatici stanno attualmente mettendo a dura prova la capacità di adattamento delle popolazioni naturali. Ciò pone sfide significative agli sforzi di conservazione tradizionali che riportano gli ecosistemi ai loro stati storici 58,59,60,61,62,63. Pertanto, i quadri di conservazione si sono ampliati per includere la gestione anticipatoria che tiene conto della resilienza e della capacità di adattamento64. La gestione preventiva per affrontare i cambiamenti climatici è in corso di attuazione per le specie arboree negli ecosistemi forestali65 ed è stata proposta per ulteriori sforzi di ripristino volti a migliorare il potenziale evolutivo degli espianti 66,67. Sebbene queste strategie siano intrinsecamente più facili da manipolare in ambienti terrestri, diversi studi stanno iniziando a esplorare la loro applicazione in ambienti marini 62,68,69,70. Ad esempio, le barriere coralline sono minacciate da numerosi fattori di stress antropogenici che hanno provocato un declino senza precedenti71,72. In risposta alla perdita di queste importanti specie di base, il ripristino attivo e le tecniche di adattamento assistito sono sempre più raccomandate per conservare le barriere coralline rimanenti e le loro funzioni associate 62,73,74. Una tecnica prevede la traslocazione degli individui all'interno del loro attuale areale di distribuzione delle specie per aumentare la tolleranza allo stress da calore75. Per quanto riguarda il ripristino delle alghe che formano la chioma, la "ghiaia verde" ha un quadro personalizzabile per esplorare tecniche di adattamento assistito come la traslocazione di genotipi resilienti in aree vulnerabili, la manipolazione non genetica come l'ibridazione o l'acclimatazione degli individui allo stress ambientale62 con risultati volti a ottenere ceppi più resistenti per i programmi di ripristino76,77.
Sfruttare il sostegno locale per migliorare gli sforzi di ripristino è fondamentale per sostenere il successo della conservazione dell'ecosistema delle alghe. Il coinvolgimento delle parti interessate locali può aumentare l'adesione locale alle esigenze di ripristino 6,50 e promuovere la gestione delle coste che potrebbe successivamente tradursi in un aumento dei finanziamenti e della longevità della protezione dell'ecosistema delle alghe. Come per tutte le altre metodologie di ripristino delle alghe, quadri decisionali strutturati che integrano diversi obiettivi ecologici, socioeconomici e di conservazione contribuiranno a raggiungere risultati ottimali per gli ecosistemi di alghe e le comunità che sostengono11.

Le alghe che formano la chioma (macroalghe brune dell'ordine Laminariales) sono specie di base importanti a livello globale, che dominano le scogliere rocciose costiere nei mari temperati e artici1. Queste alghe formano habitat biogenici strutturalmente complessi e altamente produttivi, noti come foreste di alghe, chesupportano comunità marine tassonomicamente diversificate. Le foreste di alghe in tutto il mondo forniscono molti servizi ecosistemici all'uomo, tra cui la produzione di pesca commerciale, il ciclo del carbonio e dei nutrienti e le opportunità ricreative, con un valore totale stimato di 500 miliardi di dollari all'anno3.
Nonostante il loro valore considerevole, le foreste di alghe devono far fronte a crescenti pressioni antropogeniche in molte regioni3. Il cambiamento climatico rappresenta una delle minacce più significative per le alghe a causa del riscaldamento a lungo termine degli oceani combinato con la crescente frequenza delle anomalie di temperatura 3,4,5,6,7. L'aumento delle temperature oceaniche è associato alla limitazione dei nutrienti8, mentre l'esposizione a stress da calore al di sopra delle soglie fisiologiche può provocare mortalità9. In combinazione con fattori di stress locali regionali variabili7, le popolazioni di alghe stanno diminuendo a livello globale di circa il 2% all'anno10 con perdite significative e spostamenti persistenti verso stati comunitari alternativi in alcune regioni 6,11,12,13,14. Il recupero naturale delle popolazioni di alghe da solo potrebbe non essere sufficiente a invertire l'entità delle perdite attuali e previste 15,16,17,18, sottolineando l'importanza di un ripristino attivo.
Gli attuali sforzi di ripristino delle alghe possono utilizzare una combinazione di metodologie per ristabilire queste importanti specie di base sulle scogliere rocciose costiere 3,19. Le metodologie scelte per affrontare i problemi specifici del sito dipendono dal contesto geografico, dagli ostacoli specifici al recupero delle alghe e dal contesto socio-ecologico11. Comprendere le connessioni e l'interdipendenza dei sistemi socio-ecologici è la chiave, e gli interventi che coinvolgono le istituzioni locali e ottengono il sostegno delle comunità locali aumentano la probabilità di successo degli sforzi di ripristino20.
Oltre al cambiamento climatico, la pressione degli erbivori o la competizione interspecifica guidano, diminuiscono o sopprimono la ripresa (ad esempio, da parte dei ricci di mare13, dei pesci erbivori21,22, delle alghe del tappeto erboso 9,23 o delle alghe invasive24). Il ripristino può concentrarsi sulla rimozione di questi fattori di stress biotici25, sebbene questi metodi richiedano risorse sostanziali e una manutenzione continua11. Per catalizzare il recupero delle specie di alghe, sono stati compiuti sforzi verso un approccio di semina diretta, ad esempio pesando sacchi a rete pieni di lame di alghe fertili al benthos che rilasciano zoosporenell'ambiente 26. Questo metodo, tuttavia, richiede molto tempo e richiede l'installazione e la rimozione tecnica subacquea. Altri casi si concentrano sul trapianto di grandi quantità di piante intere adulte donatrici, che possono compromettere popolazioni di donatori strettamente associati e vulnerabili e sono spesso limitati a piccole dimensioni a causa della dipendenza dal trapianto continuo27.
Per le regioni in cui la limitazione delle spore di alghe può ostacolare il recupero delle foreste di alghe a causa della frammentazione dell'habitat, è stato introdotto un approccio relativamente nuovo al ripristino delle alghe chiamato tecnica della "ghiaia verde". La tecnica è stata sperimentata con successo presso la stazione di ricerca di Flødevigen, nel sud della Norvegia28, e ha rappresentato un'opzione promettente per il restauro grazie all'economicità e alla scalabilità. Il flusso di lavoro di questa tecnica è il seguente: (1) una soluzione di spore viene creata da tessuto fertile raccolto da alghe adulte riproduttive sul campo e quindi seminato su piccoli substrati, come la ghiaia; (2) le alghe allo stadio iniziale sono allevate in condizioni abiotiche controllate in laboratorio su substrati; (3) I substrati con sporofiti visibili sono distribuiti sul campo su barriere coralline specifiche come "ghiaia verde", dove gli sporofiti continuano a crescere. Si noti che i tipici sforzi di trapianto di individui adulti richiedono un'installazione subacquea laboriosa e inibitoria dal punto di vista dei costi da parte dei subacquei, e la tecnica della "ghiaia verde" utilizza un semplice dispiegamento dalla superficie28.
La tecnica della "ghiaia verde" è attualmente in fase di sperimentazione da parte dei membri di numerosi gruppi di lavoro internazionali29 in diversi ambienti e diverse specie di alghe laminariane. Questo protocollo descrive le strutture, i materiali e i metodi necessari per la raccolta dei tessuti, la sporulazione, la semina, le condizioni di allevamento, la manutenzione regolare e il monitoraggio delle alghe in fase iniziale prima di implementare questa tecnica di ripristino sul campo utilizzando l'alga gigante, Macrocystis pyrifera. Questo protocollo è una risorsa preziosa per ricercatori, manager e parti interessate che cercano di fornire informazioni sui successi e sui limiti di questo metodo con M. pyrifera in diversi contesti di campo.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m filtri</td><td>Milipore</td><td>SCGPS05RE</td><td>Sterilizzazione naturale con acqua di mare</td></tr><tr><td>1 L bottiglie di vetro</td><td>Amazon</td><td>B07J6JP4D1</td><td>Sterilizzazione naturale con acqua di mare</td></tr><tr><td>1 &; m filtri (acqua + aria)</td><td>Amazon</td><td>B01M1VWUWL</td><td>Sterilizzazione naturale con acqua di mare</td></tr><tr><td>1'' PVC Gomito a 90 gradi</td> Home <td>Depot</td><td>203812125</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>10 &; m filtri</td><td>Amazon</td><td>B00D04BG56</td><td>Sterilizzazione naturale con acqua di mare</td></tr><tr><td>20 & micro; m filtri</td><td>Amazon</td><td>B082WS9NPH</td><td>Sterilizzazione naturale con acqua di mare</td></tr><tr><td>Tubo 3x5mm</td><td>Amazon</td><td>B0852HXPN6</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Incubatrice</td></tr><tr><td>4x4'' Garza sterile</td><td>Amazon</td><td>B07NDK8XM3</td><td>Sporulazione</td></tr><tr><td>4x6mm Tubo</td><td>Amazon</td><td>B08BCRV1FY</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Incubatrice</td></tr><tr><td>5 &; m filtri</td><td>Amazon</td><td>B082WS9NPH</td><td>Sterilizzazione naturale con acqua di mare</td></tr><tr><td>Tubo falcon da 50 ml Amazon</td><td></td><td>B01M04HGPJ</td><td>Sporulazione</td></tr><tr><td>8x10mm</td><td>Tubo Amazon</td><td>B01MSM3LLZ</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Incubatrice</td></tr><tr><td>Filtri dell'aria</td><td>Thermo Fisher</td><td>MTGR85010</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Incubatrice</td></tr><tr><td>Lampada ad alcool</td><td>Amazon</td><td>B07XWD9WWC</td><td>Sporulazione</td></tr><tr><td>Ammonio ferro (II) solfato esaidrato ACS reagente, 99%</td><td>Sigma</td><td>215406-100G</td><td>Prodotti chimici per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei media</td></tr><tr><td>Ghiaia per acquari</td><td></td> Amazon <td>B07XRCKFBJ</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Incubatore</td></tr><tr><td>Biotina in polvere, BioReagente, adatto per colture cellulari, adatto per colture cellulari di insetti, adatto per colture cellulari vegetali, 99%</td><td>Sigma</td><td>B4639-100MG</td><td>Prodotti chimici per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Acido Borico, 99,8%, 10043-35-3, MFCD00011337, BH3O3, 61,83, 500g</td><td>Thermo Fisher</td><td>5090113707</td><td>Chemicals per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Calcio D-Pantotenato,ge98,0% (T),C9H17NO5,137-08-6,25g,D-Acido pantotenico Sale di calcio, P0012-25G 1/EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>P001225G</td><td>Sostanze chimiche per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei mezzi Valvole di</td></tr><tr><td>ritegno</td><td>Amazon</td><td>B08HRZR4MM</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Incubatore</td></tr><tr><td>Tubo trasparente 3/8'' - 10 piedi</td><td>Amazon</td><td>B07MTYMW13</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>COBALTO(II) SOLFATO EPTA-100G, AVVERTENZA - California - Rischio di cancro, 93-2749-100G 1/EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>5090114752</td><td>Prodotti chimici per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Microscopio composto con fotocamera</td><td>OMAX</td><td>M83EZ-C50S</td><td>Monitoraggio</td></tr><tr><td>Pallone</td><td>di coltura Thermo Fisher</td><td>07-250-080</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Incubatrice</td></tr><tr><td>Lampada di coltura</td><td>Amazon</td><td>B07RRRPJ63</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Incubatrice</td></tr><tr><td>Tappi di coltura</td><td>Amazon</td><td>B07DX6J7QD</td><td>Opzione 1 Piccola scala - </td></tr><tr><td>Incubatore Connettore di drenaggio</td><td>Amazon</td><td>B00GUZ6CV0</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Numero EDTA CAS: 6381-92-6 Formula molecolare: C10H14N2O8Na2- 2H2O Peso molecolare: 372,2</td><td>Thermo Fisher</td><td>50213299</td><td>Sostanze chimiche per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Eisco Safety Pack Set di cilindri graduati Classe A, ASTM, Capacità: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Graduazioni: 0,2 mL, 0,5 mL, 1,0 mL, Vetro borosilicato 3,3, Autoclavabile: Sì, Classe: Classe A, Graduato: Sì, Tolleranza: 0,10 mL, 0,17 mL, 0,25 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>S81273</td><td>Sostanze chimiche per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Eisco Safety Pack Set di cilindri graduati Classe A, ASTM, Capacità: 50 mL, 100 mL, 250 mL, Graduazioni: 1,0 mL, 1,0 mL, 2,0 mL, Vetro borosilicato 3,3, Autoclavabile: Sì, Classe: Classe A, Graduato: Sì, Tolleranza: 0,25 mL, 0,50 mL, 1,0 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>S81275</td><td>Sostanze chimiche per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Set di matracci volumetrici Eisco Safety Pack - Classe A, ASTM, Capacità: 10 mL, 25 mL, 50 mL, Vetro borosilicato 3.3, Autoclavabile: Sì, Classe: Classe A, Materiale di chiusura: Vetro, Dimensioni chiusura: 9, 9, 13, Tipo di chiusura: Penny Stopper, Graduato: Ye</td><td>Thermo Fisher</td><td>S81271</td><td>Prodotti chimici per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni Portafiltro</td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>B07LCKBKCT</td><td>Sterilizzazione naturale con acqua di mare</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cilindri graduati, Capacità: 500 mL, Graduazioni: 5 mL, Vetro borosilicato, Autoclavabile: Sì, Limite di errore: +/-4,0 mL, Applicazioni consigliate: Istruzione, Suddivisione: 5 mL, S63460 1/EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>S63460</td><td>Prodotti chimici per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>FLEXACAM C1 Fotocamera</td><td>Leica</td><td>FLEXACAM C1</td><td>Monitoraggio</td></tr><tr><td>Acido folico, C19H19N7O6, Numero CAS59303, vitamina m, acido pteroilglutammico, vitamina b9, folvite, folacina, acido folico, acido pteroillglutammico, pteglu, acido folico, folato, 25g, 100781, CHEBI:27470, da giallo ad arancione, 2004190, 441.41, OVBPIULPVIDEAOLBPRGKRZSAN</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ6083314</td><td>Prodotti chimici per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei media</td></tr><tr><td>Lavello autoportante da 20 galloni</td><td>Amazon</td><td></td><td>B094TLH19L Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>BIOSSIDO DI GERMANIO 99,99 10GR</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC190000100</td><td>Sostanze chimiche per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Cilindri graduati in vetro, base rotonda di classe A, Eisco, Da utilizzare con: Liquidi dosatori, Capacità: 1000 mL, Graduazioni: 10 mL Bianco, CH0344OWT 1/EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>S88442</td><td>Prodotti chimici per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni Vetrini</td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>B00L1S93PS</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Glicerolo fosfato sale disodico idrato miscela immera</td><td>Sigma</td><td>G6501-100G</td><td>Sostanze chimiche per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Contenitori per la crescita -3,4 Qt- 3,25 Lt contenitori trasparenti con coperchio trasparente</td><td>Contenitore per il magazzino</td><td>#10014828</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Luce per la crescita</td><td>Amazon</td><td>B086R14MFW</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Emocitometro per incubatrice</td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>B07TJQDKLJ</td><td>Sporulazione</td></tr><tr><td>Barattoli di</td> <td>plastica incernieratiSKS Bottiglia & Imballaggio</td><td>40280125.01S</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Incubatore</td></tr><tr><td>Inositolo grado di ricerca, USP/NF Per batteriologia. Otticamente inattivo. Testato per la sua idoneità in coltura tissutale. Dimensioni - 100G Condizioni di conservazione - +15 C A +30 C Codice prodotto - 26310.01 CAS 87-89-8</td><td>Thermo Fisher</td><td>50247745</td><td>Chemicals per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Instant Ocean - 50 G</td><td>Amazon</td><td>B000255NKA</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Incubatore</td></tr><tr><td></td><td>Microscopio invertito Leica DMi1 Leica</td><td>DMi1</td><td>Monitoraggio</td></tr><tr><td>Cloruro di ferro (III) esaidrato Reagente ACS, 97%</td><td>Sigma</td><td>236489-100G</td><td>Sostanze chimiche per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei media</td></tr><tr><td>Licor Ligth Meter Data Logger</td><td>Licor</td><td>LI-250A</td><td>Monitoraggio</td></tr><tr><td>Luce/temperatura HOBO Data logger</td><td>Amazon</td><td>B075X2SWKN</td><td>Luci di monitoraggio</td></tr><tr><td>150W</td><td>Amazon</td><td></td><td>B0799DQM9V Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Il solfato di manganese monoidrato soddisfa le specifiche di test USP</td><td>Sigma</td><td>M8179-100G</td><td>Prodotti chimici per la realizzazione di Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei media</td></tr><tr><td>Rocce di medie dimensioni 2-3 pollici, 20 libbre</td><td>Home</td><td>Depot</td><td>206823930 Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Acido nicotinico, 99%, C6H5NO2, Numero CAS59676, daskil, apelagrin, acidum nicotinicum, akotin, 3carbossipiridina, niacina, 3piridinaacido carbossilico, acido nicotinico, pellagrina, wampocap, 250g, 109591, CHEBI:15940, 1.4, 2004410, 293 gradi. C (559 gradi. F), 123.11,Thermo</td> <td>Fisher</td><td>AAA1268330</td><td>Chemicals per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Acido p-aminobenzoico 99,82% Acido 4-amminobenzoico, C7H7NO2, Numero CAS: 150-13-0, 25g, 0210256925 1/EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>ICN10256925</td><td>Chemicals per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Cemento PCV</td><td>Amazon</td><td></td><td>B001D9WRWG Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Valvola dell'acqua</td><td>in plastica Amazon</td><td>B0006JLVE4</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Valvola dell'acqua in plastica</td><td>Amazon</td><td>B07G5FY7X1</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Bilancia di precisione 1mg</td><td>Amazon</td><td>B08DTH95FN</td><td>Materiali per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei media</td></tr><tr><td>Pompa per aria filtrata</td><td>Amazon</td><td>B0BG2BT9RX</td><td>Opzione 1 Piccola scala -</td></tr><tr><td>Incubatore Tubo in PVC 1x24''</td> <td>Home Depot</td><td>202300505</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Misuratore di luce quantistica</td><td>Apogee Instruments</td><td>MQ-510</td><td></td></tr><tr><td>Monitoraggio Incubatore refrigerato</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-103-1566</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Anelli</td></tr><tr><td>di tenuta in gomma per incubatrici</td><td>Amazon</td><td></td><td>B07YZD22ZP Opzione 1 Piccola scala - Rifrattometro per incubatrice</td></tr><tr>Monitoraggio <td>della B018LRO1SU</td><td></td>di<td>salinità</td><td>ATC</td></tr><tr><td>Rete ombreggiante 6x50 piedi</td><td>Deposito domestico</td><td>316308418</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagnomaria</td></tr><tr><td>Nitrato di sodio ge 99,0% Acido nitrico, sale di sodio, NNaO3, Numero CAS: 7631-99-4, 500 g, 1/EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP360500</td><td>Chemicals nasce Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei media</td></tr><tr><td>Saldatura per l'apertura di aerazione</td><td>Amazon</td><td>B08R3515SF</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Spray alcool isporopyl</td><td>Amazon</td><td>&lrm; B08LW5P844</td><td>Sporulazione</td></tr><tr><td>Sissors in acciaio inox</td><td>Amazon</td><td>B07BT4YLHT</td><td>Sporulazione Vassoio</td></tr><tr><td>in acciaio inox</td><td>Amazon</td><td>B08CV33YXG</td><td>Sporulazione</td></tr><tr><td>Twizzers in acciaio inox</td> Amazon <td>B01JTZTAJS</td><td>Spinulazione</td><td></td></tr><tr><td>Spine</td><td>Amazon</td><td>B07C4TNKXB</td><td>Materiali per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei media</td></tr><tr><td>Pompa di circolazione sommergibile 400 GPH</td><td>Amazon</td><td>B07RZKRM13</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Sensore quantistico sferico sommergibile</td><td>Valzer</td><td>US-SQS/L</td><td>Monitoraggio</td></tr><tr><td>Pistola di temperatura</td><td>Termometro a infrarossi 749</td><td>B07VTPJXH9</td><td>Monitoraggio</td></tr><tr><td>BioReagente tiamina cloridrato, adatto per colture cellulari, adatto per colture cellulari di insetti, adatto per colture cellulari vegetali</td><td>Sigma</td><td>T1270-25G</td><td>Prodotti chimici per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Timina 99% 2, 4-diidrossi-5-metilpirimidina, C5H6N2O2, Numero CAS: 65-71-4, 25g, 157850250 1/EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC157850250</td><td>Sostanze chimiche per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei media</td></tr><tr><td>Lastra acrilica trasparente 24x48 pollici</td><td>Home Depot</td><td>202038048</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Circolazione dell'acqua con tubi 1''x10 piedi</td><td>Amazon</td><td></td><td>B07ZC1PSF3 Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Luce UV per la sterilizzazione naturale dell'acqua di mare</td><td>Amazon</td><td>B018OI7PYS</td><td>Sterilizzazione naturale dell'acqua di mare</td></tr><tr><td>Pompa a vuoto</td><td>Amazon</td><td>B087XBTPVW</td> Bioreagente per <td>la sterilizzazione naturale con acqua di mare</td></tr><tr><td>Vitamina B12, adatto per colture cellulari, adatto per colture cellulari di insetti, adatto per colture cellulari vegetali, 98%</td><td>Sigma</td><td>V6629-100MG</td><td>Prodotti chimici per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Flaconi volumetrici, vetro di classe A, Eisco, con tappo in polipropilene, graduati, marcature stampate in bianco, Capacità: 1000 mL, CH0446IWT 1/EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>S89446</td><td>Sostanze chimiche per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr><tr><td>Palloni tarati, vetro di classe A, Eisco, con tappo in polipropilene, graduati, marcature stampate in bianco, Capacità: 500 mL, CH0446HWT 1/EA</td><td>Thermo Fisher</td><td>S89445</td><td>Prodotti chimici per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei media</td></tr><tr><td>Refrigeratore d'acqua 200-600GPM</td><td>Amazon</td><td>B07BHHP71C</td><td>Opzione 2 - Scala media - Sistemi a bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Splitter a Y per tubi 4x6mm</td><td>Amazon</td><td>B08XTJKFCH</td><td>Opzione 1 Piccola scala - Incubatore</td></tr><tr><td>Solfato di zinco eptaidrato BioReagent, adatto per colture cellulari</td><td>Sigma</td><td>Z0251-100G</td><td>Prodotti chimici per creare Provasoli' s Acqua di mare arricchita (PES) e vitamine per l'arricchimento dei terreni</td></tr></tbody></table>

raccolta sul campo e manutenzione in laboratorio delle alghe giganti che formano la chioma per facilitare il ripristino

Field Collection and Laboratory Maintenance of Canopy-Forming Giant Kelp to Facilitate Restoration

Le alghe che formano la chioma sono specie di base essenziali, che supportano la biodiversità e forniscono servizi ecosistemici per un valore di oltre 500 miliardi di dollari all'anno. Il declino globale delle foreste di alghe giganti a causa di fattori di stress ecologici causati dal clima sottolinea la necessità di strategie di ripristino innovative. Una tecnica di ripristino emergente nota come "ghiaia verde" mira a seminare giovani alghe su vaste aree senza un ampio lavoro subacqueo e rappresenta uno strumento di ripristino promettente grazie all'economicità e alla scalabilità. Questo video illustra un protocollo e gli strumenti per la coltura di alghe giganti, Macrocystis pyrifera. Fornisce inoltre una risorsa per ulteriori studi per affrontare i successi e i limiti di questo metodo in contesti di campo. Descriviamo metodi sul campo e in laboratorio per la raccolta del tessuto riproduttivo, la sporulazione, l'inoculazione, l'allevamento, il mantenimento e il monitoraggio dei substrati seminati con le prime fasi di vita utilizzando la tecnica della "ghiaia verde". Il protocollo semplifica e centralizza le attuali pratiche di ripristino in questo campo per supportare ricercatori, gestori e parti interessate nel raggiungimento degli obiettivi di conservazione delle alghe.

La tecnica di ripristino della "ghiaia verde" è ancora in fase pilota, con dati limitati sulla sopravvivenza all'espianto per altre specie28 e dati ancora pubblicati per Macrocystis pyrifera. Utilizzando la raccolta sul campo e la manutenzione in laboratorio delineata in questo protocollo, abbiamo testato il significato delle condizioni di allevamento specifiche del sito per due distinte popolazioni di alghe donatrici prima di un'ipotetica distribuzione di "ghiaia verde" (Figura 5). Il tessuto di alghe riproduttive è stato raccolto in California (USA) da popolazioni K1 più fredde (Santa Cruz 36.60167°N, 121.88508°W) e K4 più calde (San Diego, 32.85036°N, -117.27600°W) e allevato a due temperature: (1) 12 °C (la temperatura di coltura standard per l'acquacoltura di alghe marine e la SST invernale media per K1) e (2) 20 °C (la SST media estiva per K4, e un'ondata di caldo di 4 °C per il K1). Tutti i vetrini utilizzati per monitorare lo sviluppo dello stadio di vita delle alghe sono stati contrassegnati con una griglia standardizzata e le immagini ad alta risoluzione sono state catturate utilizzando questa griglia come riferimento per consentire l'osservazione di campi fissi nel tempo utilizzando un microscopio invertito e una fotocamera (N = 5 immagini per campione, 2,479 mm x 1,859 mm).
Dopo 24 giorni dalla sporulazione, i gametofiti sono stati contati dalle immagini al microscopio (N = 300 immagini da 60 campioni). Per testare le differenze nella conta dei gametofiti, sono stati impiegati modelli lineari generalizzati di effetti misti con distribuzione di Poisson utilizzando la funzione glmmTMB() nel pacchetto glmmTMB41, e sono stati condotti confronti a coppie con emtrends() dal pacchetto emmeans42in R. I nostri risultati illustrano che la risposta dei gametofiti alla variabilità termica è stata diversa tra le popolazioni K1 e K4 (t = 2,7, p = 0,007), dove la temperatura non ha avuto un effetto per la popolazione K4 più calda (stima = -0,01, errore standard [SE] = 0,01, intervallo di confidenza [CI] = [-0,03, 0,01]), ma ha avuto un effetto per la popolazione K1 più fredda (stima = -0,06, SE = 0,02, CI = [-0,10, -0,03]) (Figura 6A), suggerendo una possibile divergenza adattativa nei tratti di tolleranza termica. I gametofiti delle alghe sono spesso raffigurati come uno stadiodi resistenza 43, il che significa che producono un fenotipo per tutti gli usi che è tollerante allo stress e relativamente insensibile alla variabilità ambientale. Tuttavia, questi risultati indicano che la variabilità termica impone una pressione significativa in questa fase iniziale.
Dopo 32 giorni di sporulazione, gli sporofiti visibili con lunghezza superiore a circa 1 mm sono stati contati sulla totalità di ciascun vetrino di 2,5 cm per 7,5 cm (N = 72 campioni totali). Per testare le differenze nella conta degli sporofiti visibili, sono stati impiegati modelli lineari generalizzati ad effetti misti con distribuzione di Poisson utilizzando la funzione glmmTMB() nel pacchetto glmmTMB e sono stati condotti confronti a coppie con emtrends() dalle medi del pacchetto in R. I nostri risultati illustrano che la risposta degli sporofiti alla variabilità termica è simile tra le popolazioni differenziate K1 e K4 (z = 0,92, p = 0,36), dove la temperatura ha avuto un effetto per la popolazione K4 più calda (stima = -0,66, SE = 0,04, CI = [-0,74, - 0,57]), così come la popolazione K1 più fredda (stima = -0,85, SE = 0,13, CI = [-1,10, -0,60]) (Figura 6B). I campioni allevati a 20 °C hanno sviluppato pochi sporofiti visibili (media ± SE = 0,4 ± 0,2) rispetto a quelli allevati a 12 °C (media ± SE = 82,4 ± 9,8). Questo risultato suggerisce che la produzione di sporofiti è più sensibile alla temperatura rispetto allo stadio di gametofito e che le temperature di coltura sito-specifiche non devono superare i 15 °C per ottenere lo sviluppo dello sporofito come delineato nel protocollo.
<img alt="Allestimento dell'esperimento di crescita delle piante nella camera di crescita; Include barattoli ad atmosfera controllata, tubi, sensori." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Schema del sistema di incubazione a "ghiaia verde". (A) Sorgente di luce rossa per colture di gametofito vegetativamente bulking. (B) Porta di accesso per cavi elettrici e tubi, che conduce a una presa esterna. (C) Struttura per bloccare la luce a spettro completo dalla sezione a luce rossa. (D) Una sezione di coltivazione di «ghiaia verde». (E) sorgenti luminose a spettro completo. (F) Tubi collegati a una fonte esterna di aria filtrata. (G) Valvole di ritegno per ridurre la contaminazione aerodispersa. (H) Contenitori di coltura individuali che riducono al minimo la contaminazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Diagramma del processo di desalinizzazione solare con più serbatoi, evidenziando la configurazione di purificazione dell'acqua." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Schema del sistema a bagno d'acqua a «ghiaia verde» . (A) Refrigeratore con pompa sommersa (in I). (B) Vasca da 20 galloni per bagnomaria. (C) Scaricare per far ricircolare il bagnomaria. (D) Valvola per il ricircolo del bagnomaria. (E) Sorgente luminosa. (F) Contenitore da 2,5 L in "ghiaia verde" con coperchio trasparente e apertura di aerazione. (G) Sorgente di aerazione. (H) Tubi che fanno ricircolare l'acqua con l'uso di pompe sommerse. (I) Ricevitore bagno d'acqua da/per refrigeratore da/per vasche con pompe sommergibili. (J) Copertura in acrilico per ridurre al minimo l'evaporazione del bagnomaria. (K) Paralume a rete per regolare l'intensità della luce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Schema di identificazione dello stadio di vita: insediamento di zoospore, germinazione, gametofito, sviluppo degli sporofiti." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Sviluppo di Macrocystis pyrifera . Fasi della storia di vita dello sviluppo di Macrocystis pyrifera da prove di crescita in laboratorio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Fasi di crescita delle alghe oltre 120 giorni; coltura in laboratorio per la crescita in campo; analisi sequenziale delle immagini." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: «Ghiaia verde» seminata con Macrocystis pyrifera. La ghiaia verde seminata con Macrocystis pyrifera viene coltivata in laboratorio fino a quando gli sporofiti raggiungono 1-2 cm. La "ghiaia verde" viene quindi distribuita e continua a crescere nel campo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Confronto della crescita delle alghe a 12°C e 20°C per 40 giorni; immagini al microscopio a intervalli." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Serie temporali sperimentali. Immagini di esempio tratte da una serie storica che segue la crescita e lo sviluppo sperimentale di gametofiti e sporofiti di Macrocystis pyrifera provenienti da due popolazioni raccolte in California (USA) e coltivate a due diverse temperature. K1 = Santa Cruz, K4 = San Diego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Impatto della temperatura su gametofiti e sporofiti; grafico a barre che confronta la crescita delle specie K4 e K1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66092/66092fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: Risultati rappresentativi. Stadi di vita di Macrocystis pyrifera osservati per le popolazioni di origine K1 Santa Cruz, San Diego, K4 Santa Cruz, coltivate a condizioni termiche costanti di 12 e 20 °C. Barre di errore, media ± 1 SE. L'asterisco (*) indica differenze statisticamente significative (p &lt; 0,05). (A) Gametofiti al giorno 24 (N = 300 immagini totali da 60 campioni). (B) Sporofiti visibili al giorno 32 (N = 72 campioni, all'interno di un'area standardizzata di 2,5 cm per 7,5 cm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/66092fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Fascicolo supplementare 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66092/Supplemental%20File_Calendar%20R2.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Questo protocollo descrive la raccolta sul campo e la regolare manutenzione in laboratorio di substrati seminati con alghe giganti che formano chiome per l'uso in prove di ripristino per affrontare il successo e i limiti della tecnica della "ghiaia verde" in ambienti di campo.

Raccolta sul campo e manutenzione in laboratorio delle alghe giganti che formano la chioma per facilitare il ripristino

Canopy-forming kelps are essential foundation species, supporting biodiversity and providing ecosystem services valued at more than USD$500 billion ...

Le foreste di alghe stanno affrontando perdite senza precedenti a causa di fattori di stress ambientale causati dal clima e cambiamenti nelle dinamiche trofiche. Questo video illustra un protocollo e strumenti per la coltivazione di alghe giganti, Macrocystis pyrifera, utilizzando la tecnica della ghiaia verde, e fornisce una risorsa preziosa per ulteriori prove per affrontare i successi e i limiti di questo metodo in diversi contesti. Gli impianti di coltivazione delle alghe devono essere in grado di controllare temperature comprese tra 10 e 15 gradi Celsius, fornire una luce a spettro completo compresa tra zero e 180 fotoni micromolecolari per metro quadrato al secondo e un'aerazione filtrata.I sistemi di incubazione con una presa incorporata o una porta di accesso per fili e tubi possono essere adattati con luci e una fonte d'aria. Se un sistema di incubazione non rientra nell'ambito, nel budget o nella scala prevista del progetto, è possibile utilizzare bagni d'acqua temperati da acqua di mare naturale fredda o da un refrigeratore. Le temperature di allevamento sono specifiche del sito e della stagione.Posiziona un termometro nel terreno di coltura o usa una pistola termica per assicurarti che la temperatura sia compresa tra 10 e 18 gradi Celsius. Impostare le luci a spettro completo su un periodo di luce di 12 ore, foto al buio di 12 ore utilizzando le impostazioni di temporizzazione sulla sorgente luminosa o collegando la sorgente luminosa a un timer con un ciclo programmabile. Misura l'intensità della luce con un misuratore quantistico PAR sotto la superficie vicino alla ghiaia e regola utilizzando una sorgente luminosa dimmerabile o sovrapponendo una rete alla sorgente luminosa.L'aerazione viene aggiunta alle colture con l'uso di pompe ad aria. Utilizzare filtri con una dimensione dei pori di 02 micrometri per ridurre la contaminazione batterica nell'aria. I materiali e le stazioni devono essere sterilizzati e preparati in anticipo.Vedi il testo per i dettagli. La ghiaia utilizzata per la semina dovrebbe avere una superficie strutturata o leggermente bucherellata, poiché è più probabile che i gametofiti vengano trattenuti su substrati con un'elevata rugosità. Strofina e risciacqua la ghiaia fino a quando l'acqua non diventa limpida per rimuovere polvere o detriti.Immergere la ghiaia in una soluzione di candeggina diluita al 10% per almeno 24 ore e risciacquare con acqua di mare sterilizzata con filtro. Calcola il volume di acqua di mare sterilizzata con filtro necessaria per rinfrescare i contenitori di coltura ogni settimana e pianifica di conseguenza questa attività di filtrazione e sterilizzazione. Grandi lotti di acqua di mare sterilizzata con filtro possono essere conservati in contenitori bui per un massimo di sei mesi a 8-10 gradi Celsius.Se la refrigerazione non è disponibile, conservare in un luogo buio e fresco. Filtrare l'acqua utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto con una dimensione dei pori da 55 a un micrometro. Spegnere la fonte di vuoto prima che tutta l'acqua venga aspirata per evitare di danneggiare il filtro e versare l'acqua filtrata in un contenitore sterile dedicato.Per volumi maggiori, è possibile utilizzare un sistema di filtrazione a flusso continuo. Ad esempio, fai scorrere l'acqua di mare attraverso una serie di tre filtri pieghettati, 10 micrometri, cinque micrometri e un micrometro, disposti dalla dimensione dei pori più grande a quella più piccola. Questo sistema a flusso continuo è collegato a una luce UV dell'acquario.Sterilizzare l'acqua di mare filtrata utilizzando metodi UV e/o sterilizzazione in autoclave. L'arricchimento dell'acqua di mare sterilizzata con filtri con sostanze nutritive e vitamine è fondamentale per la crescita delle alghe. Le opzioni di arricchimento più comuni includono i mezzi di filtrazione con acqua di mare arricchiti con Provasoli e i mezzi F/2.Vedi il testo per i dettagli. Ottenere i permessi necessari per la raccolta di tessuti di alghe che soddisfino le leggi e i regolamenti locali. Con l'immersione, selezionare da tre a cinque lame di sporofillo da 10 a 15 individui fertili di Macrocystis pyrifera con sori visibili distanziati da due a cinque metri l'uno dall'altro.Selezionare sporofilli puliti e intatti, se possibile, con poca o nessuna incrostazione o degradazione. Da questo momento in poi, conservare le lame dello sporofillo separatamente in base all'individuo genitore. Gli sporofilli crescono in una gonna densa alla base sopra la tenuta dell'alga adulta e possono essere identificati per la loro mancanza di pneumatocisti piene di gas.Trasportare le lame degli sporofilli in sacchi di raccolta scuri per evitare la sovraesposizione alla luce solare riempiti in minima parte con acqua di mare dal sito per mantenere le lame bagnate e conservate in refrigeratori a circa 12 gradi Celsius fino all'arrivo nello spazio di coltura. Assicurarsi che i campioni non siano a diretto contatto con il ghiaccio. Gli sporofilli possono essere spediti da o verso altre località.Sciacquare gli sporofilli con acqua di mare sterilizzata filtrata. Avvolgere le lame raccolte da un singolo individuo di Macrocystis pyrifera in tovaglioli di carta umidi imbevuti di acqua di mare sterilizzata filtrata e di nuovo in un foglio di alluminio per evitare la penetrazione della luce e l'ulteriore essiccazione. Questo metodo di conservazione è comunemente noto come metodo del burrito.Metti questi pacchetti in una borsa frigo con ghiaccio con una barriera protettiva, come pluriball riciclato o cartone. Preparare il frigorifero per la spedizione notturna e assicurarsi che qualcuno sia disponibile a ricevere la spedizione e posizionare i pacchi in condizioni refrigerate. Facoltativamente, conservare gli sporofilli per 12-48 ore in condizioni refrigerate, che incoraggiano il rilascio di spore dal tessuto sorus.Per conservare, utilizzare il metodo del burrito. Se conservato opzionalmente, trova segni di sporulazione parziale sui tovaglioli di carta che indicano la presenza di tessuto fertile per il soro. Il tessuto del soro è spesso leggermente sollevato e di colore più scuro rispetto al tessuto circostante.Seleziona il tessuto maturo e taglialo in sezioni quadrate di 25 centimetri usando forbici sterili. Seleziona una o due sezioni di sori pulite da 10 a 15 singoli genitori di alghe per promuovere la diversità genetica. Per pulire, strofinare delicatamente entrambi i lati del tessuto del soro in una sola direzione con una garza sterile inumidita con acqua di mare sterilizzata con filtro.Se necessario, raschiare delicatamente il tessuto del soro con una lametta sterile. Immergere la sezione sori in un bagno d'acqua dolce per 30 secondi a un minuto e risciacquare con acqua di mare sterilizzata con filtro. Immergere ogni sezione di sori in acqua di mare sterilizzata con filtro temperata a 10-15 gradi Celsius all'interno di un tubo Falcon sterile da 50 millilitri.In alternativa, le sezioni sori possono sporulare in un unico contenitore sterile. Posizionare i tubi a una temperatura compresa tra 4 e 12 gradi Celsius al buio per sporulare per un massimo di quattro ore. Se non è disponibile un frigorifero, conservare in un luogo fresco e poco illuminato.Utilizzando un microscopio composto e un emocitometro, osservare la densità delle spore di tre o quattro campioni ogni 30 minuti fino a quattro ore. Sostituire i puntali delle pipette tra un campione e l'altro. Se le densità sono di almeno 10.000 spore per millilitro, passare al passaggio successivo.Se una sezione di sori non produce spore dopo quattro ore, scartare il campione. Le spore possono depositarsi entro poche ore dal rilascio, ma possono essere osservate nuotare con un movimento circolare. Rimuovere ciascuna delle sezioni di sori dai loro tubi Falcon.Combina le soluzioni di spore risultanti in un unico contenitore sterilizzato e quantifica la densità combinata finale. Calcolare il volume finale di soluzione di spore necessario per l'inoculo per una concentrazione finale da 500 a 1.000 spore per millilitro in contenitori di coltura. Vedi il testo per i dettagli.Posizionare vetrini sterili all'interno di contenitori di coltura per monitorare lo sviluppo di alghe. Includere almeno 30 vetrini distribuiti in modo casuale tra i contenitori di coltura per un monitoraggio sufficiente. Inoculare il volume calcolato di soluzione di spore nel contenitore di coltura utilizzando un puntale per pipetta sterile contenente substrati immersi in terreni di crescita.Chiudere il contenitore e mescolare delicatamente per distribuire le spore. Posizionare il contenitore nel sistema di coltura. Impostare la temperatura tra 10 e 15 gradi Celsius in base alla temperatura del sito di distribuzione.Le luci a spettro completo per le piante acquatiche sono impostate su un ciclo di luce di 12 ore, 12 ore di buio con intensità luminose comprese tra zero e 180 micromoli fotoni per metro quadrato. Vedere il testo per una sequenza temporale di condizioni di luce specifiche. Dopo un giorno, fornire una leggera aerazione con una fonte d'aria filtrata.Monitorare almeno due vetrini casuali al giorno o a giorni alterni per le prime due settimane per valutare lo sviluppo. Dopo due settimane, monitorare almeno due vetrini casuali una o due volte alla settimana per una crescita sana e la contaminazione fino a quando gli sporofiti non raggiungono una dimensione di uno o due centimetri. Per monitorare, maneggiare il vetrino con una pinzetta sterilizzata e metterlo in una capsula di Petri pulita contenente abbastanza acqua di mare sterilizzata per immergere il vetrino.Non restituire i vetrini alle colture dopo essere stati rimossi per evitare la contaminazione incrociata. Utilizzare un microscopio composto o invertito con un ingrandimento da 40 a 400x per osservare le alghe in fase iniziale. Si prevede che lo sviluppo seguirà la seguente tempistica.Le spore depositate si osservano da zero a un giorno. Le spore possono germinare in poche ore dimostrate dalla formazione di un tubo germinale. La germinazione si osserva in genere dopo uno o due giorni.I primi gametofiti si osservano in genere da uno a quattro giorni. La gametogenesi, il processo mediante il quale le cellule subiscono la divisione e la differenziazione per formare gameti maschili e femminili, si osserva in genere entro le prime due settimane. Le cellule femminili sono da cinque a sette volte più grandi di quelle maschili.I gametofiti maschili sviluppano sottili rami filamentosi, mentre le femmine sono più rotonde o di forma ovoidale. Le femmine in genere producono uova entro due o tre settimane. Lo sperma rilasciato dai maschi feconda le uova, che si sviluppano in sporofiti embrionali.Gli sporofiti si osservano in genere entro due-quattro settimane. Lo zigote subisce una rapida divisione cellulare, con conseguente crescita di lame da uno a due centimetri entro circa sei-otto settimane. Ogni settimana, cambia i substrati di crescita per reintegrare i nutrienti e i minerali necessari per la crescita di Macrocystis pyrifera.Raffreddare il substrato di crescita fresco alla temperatura appropriata. Assicurarsi che il terreno di coltura non superi i 15 gradi Celsius durante questo processo. Aspirare i terreni dai contenitori di coltura per evitare il disturbo dei substrati seminati.Lasciare scolare il terreno fino a quando il contenitore non è quasi vuoto. Aggiornare immediatamente i supporti per ridurre al minimo l'essiccazione. Inclinare leggermente i contenitori di crescita durante il riempimento, in modo che il terreno scorra lungo il lato del contenitore di coltura per disturbare il meno possibile i substrati.Riorganizzare in modo casuale le posizioni del contenitore o della vasca durante i cambi settimanali dei supporti per tenere conto delle differenze nell'irradiazione della luce. Vedere il testo di un calendario per tenere traccia delle attività e delle aspettative per le colture di Macrocystis. Indica i tempi di regolazione della luce e dell'aerazione, nonché i cambi settimanali dei supporti.Dopo sei-otto settimane di coltura in laboratorio, gli sporofiti giovani sono lunghi da uno a due centimetri e pronti per la distribuzione. Aggiornare i terreni di crescita nei contenitori di coltura 24 ore prima della distribuzione. Ottenere i permessi necessari per la distribuzione della ghiaia che soddisfino le leggi e i regolamenti locali.Trasporta la ghiaia verde per un massimo di sei ore in un frigorifero ombreggiato. Il dispiegamento deve essere programmato per evitare la luce solare più diretta. Utilizzare una struttura ombreggiata sull'imbarcazione per evitare il sole diretto durante il processo di dispiegamento.Spargi con cura la ghiaia verde dalla superficie sulla barriera corallina sottostante o tramite immersioni subacquee quando provi in nuovi siti e su piccola scala. La tecnica di ripristino della ghiaia verde è ancora in fase accademica, con dati limitati sulla sopravvivenza all'espianto per altre specie e nessun dato ancora per Macrocystis pyrifera. Ciononostante, il successo sul campo è stato osservato in un recente studio pilota, indicato dall'attaccamento degli apteri al substrato circostante e dalle giovani alghe che crescono fino a 1,2 metri dopo due mesi sul campo.Utilizzando la raccolta sul campo e la manutenzione in laboratorio delineata in questo protocollo, abbiamo coltivato due distinte popolazioni di alghe donatrici a 12 gradi Celsius e 20 gradi Celsius per chiarire gli effetti dipendenti dalla temperatura sullo sviluppo di micro-stadi di Macrocystis pyrifera nel tempo. Dopo 24 giorni, i gametofiti sono stati contati dalle immagini del microscopio. La temperatura ha avuto un effetto per la popolazione K1 più fredda, ma non per la popolazione K4, suggerendo una possibile divergenza adattativa nei tratti di tolleranza termica.Ciò evidenzia l'importanza delle temperature di allevamento specifiche per il sito. Dopo 32 giorni, gli sporofiti visibili sono stati contati su ogni vetrino. La temperatura ha avuto un effetto simile per entrambe le popolazioni K1 e K4.I campioni allevati a 20 gradi Celsius hanno sviluppato pochi sporofiti visibili rispetto a quelli allevati a 12 gradi Celsius. Questo risultato suggerisce che la produzione di sporofito è più sensibile alla temperatura rispetto allo stadio del gametofito e che le temperature di coltura non devono superare i 15 gradi Celsius per raggiungere lo sviluppo dello sporofito, come delineato nel protocollo. Con questo protocollo visualizzato, speriamo di incoraggiare ulteriori prove con il metodo della ghiaia verde per migliorare il ripristino delle preziose foreste di alghe sottomarine da parte di ricercatori e gestori a livello globale.In bocca al lupo per il tuo viaggio nella ghiaia verde con Macrocystis pyrifera.

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