Analisi quantitativa della stabilizzazione della membrana del reticolo endoplasmatico (MAM) associata ai mitocondri in un modello neurale della malattia di Alzheimer (AD)

Stiamo cercando di misurare quantitativamente la stabilità delle membrane ER associate ai mitocondri di vari spessori o larghezze di gap, che è importante nella regolazione della fisiopatologia di diverse malattie neurodegenerative, tra cui l'AD. Recenti studi sulle membrane ER associate ai mitocondri, spesso chiamate MAM, le hanno descritte come uno dei fattori chiave nell'inizio della patologia amiloide nella fase iniziale dell'AD. I risultati hanno portato allo sviluppo di una nuova ipotesi chiamata ipotesi MAM, che suggerisce che l'AD è esclusivamente una malattia correlata alla MAM.

Il nostro protocollo è il primo a fornire uno strumento quantitativo per misurare la stabilizzazione MAM nelle cellule vive, che finora è rimasta impegnativa. Il più grande vantaggio del nostro protocollo è che utilizza la proprietà dinamica intrinseca dei mitocondri per misurare quantitativamente i cambiamenti nella stabilizzazione MAM dopo il restringimento o l'allentamento delle larghezze del gap MAM nelle cellule vive.

Il nostro obiettivo nell'immediato futuro è quello di migliorare e utilizzare la nostra tecnica di imaging di cellule vive e chimografica all'avanguardia per lo screening di una serie di modulatori sintetici o naturali di piccole molecole approvati dalla FDA di MAM o del recettore sigma one legato alla MAM, utilizzando una piattaforma di screening dei farmaci per l'AD recentemente sviluppata e comprenderne il meccanismo d'azione.

[Narratore] Per trasfettare le cellule con stabilizzatori MAM, sostituire la miscela mononucleata di midollo osseo con due millilitri di terreno DMEM-F12 a temperatura ambiente in ciascun pozzetto. Combinare il reagente nucleofector con l'integratore uno in un rapporto di 4,5 a uno. Aggiungere 100 microlitri del reagente nucleofector alla miscela. Quindi agitare la soluzione di DNA. Aggiungere da uno a cinque microgrammi di DNA per trattamento in provette da microcentrifuga separate da un millilitro per ogni trasfezione. Dopo aver aspirato il terreno esistente dalle cellule, lavare le cellule una volta con 10 millilitri di PBS. Aspirare il PBS e aggiungere un millilitro di accutasi direttamente alle cellule. Incubare le cellule per 5-10 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi picchiettare delicatamente il lato del piatto per rimuovere le cellule. Al microscopio, verificare che le cellule siano allentate e scorrano liberamente. Neutralizzare le sostanze con 10 millilitri di terreno DMEM-F12 e trasferire la sospensione cellulare in una provetta pulita da 15 millilitri. Quindi, prendi 10 microlitri di cellule sospese e aggiungile al lato A di una camera di conteggio delle cellule. Quindi inserire il lato A della camera riempita nella fessura principale sulla parte anteriore del contatore di celle. Premere misura e registrare il numero di celle per millilitro. Centrifugare il numero richiesto di celle a 300 G per cinque minuti. Quindi aspirare con cura il surnatante e risospendere il pellet in 100 microlitri di miscela di nucleolettori per ogni elettroporazione. Quindi, aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare risoluta a una delle provette contenenti DNA. Mescolare pipettando la soluzione più volte. Quindi trasferire la miscela di cellule di DNA in una cuvetta per elettroporazione e sigillarla con il coperchio in dotazione. Selezionare il programma del nucleolettore appropriato sul dispositivo. Aggiungere immediatamente circa 500 microlitri di DMEM da una piastra preriempita a sei pozzetti nella cuvetta utilizzando pipette sterili. Mescolare delicatamente una volta e trasferire le celle elettroporate e il terreno nel pozzetto corrispondente. Per iniziare, posizionare la piastra a sei pozzetti contenente le cellule nella camera del microscopio e regolare la messa a fuoco del microscopio fino a quando le cellule non diventano visibili. Per catturare il segnale della proteina fluorescente rossa, eccitare il fluoroforo utilizzando un laser a 594 nanometri e impostare l'emissione da 570 a 640 nanometri. Per le proteine fluorescenti verdi, utilizzare un laser a 488 nanometri per l'eccitazione con emissione da 510 a 540 nanometri. Ritagliare l'area di scansione in modo che si adatti all'assone. Un'area di scansione più piccola ridurrà i tempi di elaborazione e semplificherà la generazione della chimografia. Impostate l'intervallo su un fotogramma al secondo e la durata totale su 181 secondi. Fare clic su Esegui per avviare il processo. La velocità assonale dei mitocondri legati all'ER marcati con MAM 1X è stata ridotta del 50% rispetto ai mitocondri liberi e ai mitocondri legati con MAM 9X. Il 26,6% dei mitocondri MAM 1X era mobile contro il 53,82% dei mitocondri liberi e il 44,79% dei mitocondri MAM 9X. Il movimento retrogrado era inferiore per i mitocondri MAM 1X rispetto ai mitocondri Mito-RFP e MAM 9X. Anche il movimento anterogrado dei mitocondri MAM 1X è stato ridotto rispetto alla mito-RFP. La percentuale stazionaria di mitocondri MAM 1X era significativamente più alta dei mitocondri MAM 9X, riflettendo una riduzione della motilità, mentre la velocità complessiva dei mitocondri MAM 1X era significativamente inferiore rispetto ai mitocondri MAM 9X.