Name: Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Impara l'imaging del calcio in monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori geneticamente codificati. Questo metodo consente di studiare le alterazioni della segnalazione nel tessuto epiteliale infetto.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni R01DK115507 e R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) del National Institutes of Health (NIH). Il supporto ai tirocinanti è stato fornito da NIH grants F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) e F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Vorremmo ringraziare il Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core per aver fornito i terreni di mantenimento dell'organoide.

Imaging del calcio di monostrati di organoidi intestinali umani infetti da virus

<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Danese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+as+a+result+of+calcium+signaling+modulation%3A+A+cancer-centric+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061(2021).</li>
<li>Harr, M. W., Distelhorst, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+autophagy%3A+Decoding+calcium+signals+that+mediate+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579(2010).</li>
<li>Barak, P., Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Ca2%2B+microdomains+from+store-operated+CRAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097(2020).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP%2C+a+family+of+single-fluorophore+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Evol+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators.</a> J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).</li>
<li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li>
<li>Nászai, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells%3A+Got+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells: Got calcium.</a> Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).</li>
<li>Barrett, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+chloride+secretion+in+the+intestinal+epithelium%3A+Significance+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation.</a> Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptor+regulates+intestinal+dipeptide+absorption+via+Ca2%2B+signaling+and+IKCa+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation.</a> Physiol Rep. 8 (1), e14337(2020).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genetic+knockout+human+intestinal+tissue%E2%80%93derived+enteroid+lines+by+lentivirus+transduction+and+single-cell+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).</li>
<li>Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+dissect+gastrointestinal+virus-host+interactions%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned.</a> Viruses. 13 (6), 999(2021).</li>
<li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPbase%3A+a+community-editable+fluorescent+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li>
<li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-triggered+secretion+by+hydrocarbon-stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides.</a> Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+induces+intercellular+calcium+waves+through+ADP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling.</a> Science. 370 (6519), eabc3621(2020).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoctamin+1%2FTMEM16A+controls+intestinal+Cl%E2%88%92+secretion+induced+by+carbachol+and+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin.</a> Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+TMEM16A+control+luminal+chloride+secretion+in+a+NHERF1+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100912(2021).</li>
<li>Mroz, M. S., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+chronically+upregulates+Ca2%2B-dependent+Cl%E2%88%92+conductance+and+TMEM16A+expression+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells.</a> J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).</li>
<li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li>
<li>Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+as+a+key+for+pathogens+invasion+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (5), 2506(2021).</li>
<li>Samak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2FAsk1%2FMKK7%2FJNK2%2Fc-Src+signalling+cascade+mediates+disruption+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+by+dextran+sulfate+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium.</a> Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+Ca2%2B+regulates+intestinal+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li>
<li>Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+host+cell+calcium+signaling+during+viral+infections%3A+Emerging+paradigm+with+high+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance.</a> Mol Aspects Med. 81, 101004(2021).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).</li>
<li>Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+disrupts+calcium+homeostasis+by+NSP4+viroporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity.</a> mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).</li>
<li>Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rotavirus+NSP4+viroporin+domain+is+a+calcium-conducting+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel.</a> Sci Rep. 7, 43487(2017).</li>
<li>Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+hijacked+through+viroporin-activated+calcium%2Fcalmodulin-dependent+kinase+kinase-%CE%B2+signaling+is+required+for+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).</li>
<li>Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPII+vesicle+transport+is+required+for+Rotavirus+NSP4+interaction+with+the+autophagy+protein+LC3+II+and+trafficking+to+viroplasms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms.</a> J Virol. 94 (1), e01341(2019).</li>
<li>Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+calcium+on+the+early+steps+of+Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection.</a> Virology. 295 (1), 190-200 (2002).</li>
<li>Hyser, J. M., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+consequences+of+calcium-conducting+viroporins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins.</a> Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).</li>
<li>Strtak, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovirus+NS1-2+has+viroporin+activity+that+induces+aberrant+cellular+calcium+signaling+to+facilitate+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication.</a> mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> J Vis Exp. (146), 59357(2019).</li>
<li>Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+intestinal+organoid+technology+and+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling.</a> Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).</li>
<li>Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+rotavirus+entry+and+release+from+differentiated+small+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells.</a> Virology. 499, 65-71 (2016).</li>
<li>Mirabelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Norovirus+efficiently+replicates+in+differentiated+3D-human+intestinal+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids.</a> J Virol. 96 (22), e0085522(2022).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), 28749075(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+NEMO+as+calcium+indicators+with+large+dynamics+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity.</a> Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da divulgare.

Le alterazioni dei livelli citosolici di Ca2+ possono essere sia causa che effetto di patologie all'interno dell'epitelio 10,16,17. L'aumento del calcio citosolico può guidare direttamente la secrezione attraverso l'attivazione del canale del cloro calcio-dipendente TMEM16A18,19. L'attivazione di TMEM16A in risposta a Ca2+ consente l'efflusso apicale del cloruro, stabilendo un gradiente osmotico che favorisce la secrezione di liquidi20,21. Inoltre, l'aumento di Ca2+ all'interno delle cellule enteroendocrine innesca il rilascio di serotonina, che stimola i neuroni sensoriali afferenti in grado di modulare l'attività all'interno del sistema nervoso enterico22. I segnali di Ca2+ possono anche modulare le giunzioni strette per influenzare la funzione di barriera23,24 e regolare la proliferazione nelle cellule staminali intestinali25. Pertanto, la disregolazione di Ca2+ può avere effetti ampi e di vasta portata.
Molti virus manipolano il Ca2+ citosolico per creare un ambiente cellulare favorevole alla replicazione26. Il rotavirus ne è un ottimo esempio all'interno dell'epitelio intestinale27. La proteina non strutturale 4 del rotavirus (NSP4) è un canale conduttore di Ca2+ che consente l'efflusso di Ca2+ dal reticolo endoplasmatico nel citosol28,29. Questo stimola l'autofagia e aiuta l'assemblaggio del capside esterno 30,31,32. L'infezione da rotavirus induce anche il rilascio di ADP, innescando ondate intercellulari di Ca2+ che contribuiscono alla patogenesi17. Altri virus enterici, tra cui sia i calicivirus che gli enterovirus, codificano viroporine conduttrici di Ca2+ che innescano una simile disregolazione di Ca2+ all'interno delle cellule infette33,34.
L'imaging Ca2+ su cellule vive di organoidi intestinali umani offre una piattaforma versatile per studiare la segnalazione indotta da virus all'interno dell'epitelio. Tuttavia, la forza delle conclusioni tratte dai dati di imaging dipende, indissolubilmente, dalla salute e dalla qualità degli HIO, dai parametri di imaging appropriati e da un solido approccio analitico.
Un'efficiente trasduzione lentivirale è spesso il passo limitante quando si stabiliscono nuove linee HIO, ma i lentivirus ad alto titolo e le trasduzioni multiple aiutano a garantire una sufficiente espressione del transgene. È importante sottolineare che questo dovrà essere bilanciato con il potenziale di un significativo stress cellulare durante la trasduzione. Questo è il più delle volte temporaneo e si attenua dopo la selezione e più passaggi. Ciononostante, è fondamentale che gli HIO progettati per esprimere GECI mostrino una crescita e una proliferazione normali prima di iniziare gli esperimenti. Allo stesso modo, la dispersione di HIO tridimensionali e la loro riforma come monostrati induce stress cellulare. È buona norma attendere tre o più giorni affinché i monostrati si adattino dopo la placcatura. Il rivestimento delle piastre con collagene IV è fondamentale per l'integrità del monostrato35,36. Aliquotare il collagene IV e conservarlo a -80 °C tra un utilizzo e l'altro aiuta a garantire l'aderenza del monostrato. Anche la determinazione della densità di semina ottimale per ogni linea HIO può contribuire a migliorare la coerenza. Infine, l'inclusione dei controlli appropriati e il loro confronto tra gli esperimenti è indispensabile per garantire che qualsiasi osservazione rappresenti una risposta alla variabile in questione, piuttosto che un fattore confondente tecnico.
Mentre il punteggio di un monostrato può causare danni cellulari indesiderati, migliora notevolmente l'infezione da RV di HIO 2D. La Figura 2 illustra questo aspetto, poiché quasi tutte le cellule infette sono direttamente adiacenti al graffio. Evidenze sperimentali suggeriscono che la RV infetta in modo più efficiente sulla superficie basolaterale delle cellule epiteliali intestinali37. Pertanto, si prevede che l'incisione di un monostrato aumenti l'infettività esponendo la superficie basolaterale. Un'efficiente infezione monostrato può essere ottenuta anche placcando HIO su membrane in policarbonato sospese in pozzetti contenenti terreno di coltura, che consentono l'accesso alla superficie basolaterale. Tuttavia, la distanza relativamente lunga tra la piastra e la membrana in policarbonato, la membrana in policarbonato stessa e la superficie in plastica alla base del pozzetto li rendono inappropriati per l'imaging a epifluorescenza. Pertanto, il metodo di punteggio descritto in questo protocollo rimane l'approccio preferito. Dato che il punteggio stesso può portare a perturbazioni di segnalazione, l'inclusione del controllo non infetto e segnato è fondamentale per l'interpretazione. Per i virus, come il norovirus umano, che infettano in modo efficiente attraverso la membrana apicale, non è necessario segnare il monostrato38.
Come con qualsiasi sistema di imaging dal vivo, la fototossicità può facilmente confondere gli esperimenti che utilizzano monostrati HIO. Durante un esperimento di imaging, è importante monitorare la vacuolizzazione inaspettata, il blebbing della membrana o altri indicatori morfologici di stress39. Se viene rilevato uno di questi segni, la durata, la frequenza o la potenza di eccitazione devono essere ridotte. L'aumento del rapporto segnale/rumore spesso va a scapito della salute delle cellule a lungo termine, quindi l'ottimizzazione empirica dei parametri è fondamentale. Il fotosbiancamento, come indicato da una diminuzione dell'intensità della fluorescenza basale nel tempo, è un presagio di stress cellulare e dovrebbe essere evitato.
La visualità dei dati di imaging può portare i ricercatori a privilegiare analisi qualitative, piuttosto che quantitative. Tuttavia, come per qualsiasi modalità, le conclusioni riproducibili richiedono una quantificazione. L'analisi quantitativa delle immagini contiene molta più complessità di quella che può essere trattata in un singolo manoscritto, ma vale la pena evidenziare alcuni punti chiave. In primo luogo, una quantificazione coerente richiede un'acquisizione coerente. Una pipeline di analisi sviluppata per un determinato set di parametri di acquisizione potrebbe non essere efficace per le immagini acquisite a frequenze, tempi di esposizione, potenze laser o lunghezze d'onda diverse. In secondo luogo, la molteplicità delle infezioni ha un'influenza smisurata sulla frequenza dei segnali di calcio indotti viralmente. Pertanto, è importante valutare il numero di cellule infette per campo visivo e garantire la coerenza tra le condizioni di trattamento. In alternativa, la normalizzazione della frequenza del segnale al numero di cellule infette per campo visivo può aiutare a ridurre l'errore. Infine, mentre l'indicatore di calcio basato su mNG (NEMO) recentemente sviluppato offre un approccio promettente per determinare le concentrazioni assolute di Ca2+ nelle cellule40, la maggior parte dei biosensori trasmette solo informazioni relative sui sistemi biologici. Pertanto, la sottrazione in background, la normalizzazione e il confronto con un controllo sono fondamentali.
Sebbene questo protocollo si concentri sull'imaging del calcio durante l'infezione virale, l'approccio generale è facilmente adattabile. L'infezione virale può essere facilmente sostituita da una condizione di trattamento alternativa e c'è una litania sempre crescente di biosensori per monitorare molti percorsi e processi cellulari diversi. Con qualsiasi adattamento del protocollo, i ricercatori devono tenere a mente l'analisi, progettando esperimenti con risultati chiari e quantificabili.
Nel complesso, l'imaging dal vivo fornisce una risoluzione temporale senza rivali, migliorando la caratterizzazione di processi altamente dinamici. L'incorporazione di organoidi in esperimenti di imaging dal vivo consente l'osservazione di questi processi in un modello realistico e fisiologicamente rilevante. Ci auguriamo che il protocollo qui descritto faciliti la progettazione e l'ottimizzazione sperimentale, consentendo ai ricercatori di scoprire nuovi aspetti della segnalazione cellulare e tissutale.

Il calcio è un secondo messaggero ampiamente conservato che svolge un ruolo fondamentale nella regolazione della fisiologia cellulare1. Data la sua forte carica, le piccole dimensioni e l'elevata solubilità in condizioni fisiologiche, il calcio è un manipolatore ideale della conformazione proteica. Ciò rende il calcio un potente mezzo per trasdurre i segnali elettrochimici in alterazioni enzimatiche, trascrizionali o post-trascrizionali. I rigidi gradienti di concentrazione di calcio attraverso il reticolo endoplasmatico (ER) e le membrane plasmatiche creano un'elevata forza motrice che consente rapidi cambiamenti nella concentrazione citosolica di calcio. Diversi meccanismi, tra cui sia il buffering che il trasporto attivo, mantengono strettamente questo gradiente. Sebbene sia necessaria per le normali funzioni cellulari, questa manutenzione è energeticamente costosa, il che la rende particolarmente suscettibile negli stati di stress 2.
In quanto tale, la disregolazione del calcio all'interno del citosol è un segnale quasi universale di molti tipi di stress cellulare. Disturbi metabolici, tossine, agenti patogeni, danni meccanici e perturbazioni genetiche possono interrompere la segnalazione del calcio. Indipendentemente dallo stimolo, a livello di cellula intera, aumenti sostenuti e incontrollati del calcio citosolico possono promuovere l'apoptosi e infine la necrosi 3,4. Alterazioni dei livelli citosolici di calcio di minore ampiezza o di maggiore frequenza, tuttavia, hanno effetti variabili2. Allo stesso modo, gli esiti delle fluttuazioni del calcio possono differire in base al microdominio spaziale in cui si verificano5. Il monitoraggio dei livelli di calcio può quindi offrire informazioni sui processi di segnalazione dinamica, ma ciò richiede un campionamento con una risoluzione temporale e spaziale relativamente elevata.
Gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) sono potenti strumenti per il campionamento continuo in sistemi di cellule vive6. Alcune delle GECI più utilizzate sono proteine fluorescenti reattive al calcio a base di GFP note come GCaMPs7. Il GCaMP canonico è una fusione di tre domini proteici distinti: una GFP permutata circolarmente (cpGFP), calmodulina e M136. Il dominio calmodulina subisce un cambiamento di conformazione al momento del legame con il calcio, permettendone l'interazione con M13. L'interazione calmodulina-M13 induce un cambiamento conformazionale nella cpGFP che aumenta la sua emissione fluorescente durante l'eccitazione. Pertanto, un aumento della concentrazione di calcio è correlato a un aumento dell'intensità della fluorescenza GCaMP. Questi sensori possono essere citosolici o mirati a specifici organelli8.
Simile alla maggior parte dei tessuti, il calcio regola una varietà di funzioni all'interno dell'epitelio gastrointestinale. L'epitelio intestinale è fondamentale per l'assorbimento dei nutrienti e dei liquidi, ma deve anche formare una barriera stretta e un'interfaccia immunitaria per evitare l'invasione di agenti patogeni o insulti tossici. Le vie calcio-dipendenti influenzano quasi tutte queste funzioni vitali 9,10,11. Tuttavia, la segnalazione del calcio all'interno dell'epitelio intestinale rimane una frontiera poco esplorata con un potenziale promettente come bersaglio terapeutico. Mentre il monitoraggio della dinamica del calcio all'interno dell'epitelio intestinale in vivo continua a presentare sfide, gli organoidi intestinali umani (HIO) offrono un sistema ex vivo adattabile per la sperimentazione12. Gli HIO sono sferoidi tridimensionali (3D) derivati da cellule staminali intestinali umane e, una volta differenziati, ricapitolano gran parte della diversità cellulare dell'epitelio intestinale nativo12.
Questo protocollo descrive metodi completi per ingegnerizzare HIO che esprimono GECI e quindi preparare HIO ingegnerizzati come monostrati per l'imaging del calcio su cellule vive. Offre l'infezione virale come esempio di manipolazione patologica che interrompe la segnalazione del calcio e fornisce un approccio analitico per quantificare questi cambiamenti.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>0,05% tripsina EDTA</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>5408137</td><td></td></tr><tr><td>provette coniche da 15 ml</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldeide</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M</td><td>HEPES Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Ago calibro 25</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-antimicocitico&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-antimicotico&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 Integratore</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP1600100</tr><tr><td>CellView Vetrino per colture cellulari, PS, 75/25 MM, fondo in vetro, 10 scomparti</td><td>Greiner</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrite</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico umano</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>Vettore di lentivirusCostruttore</td><td></td> <td>(variabile)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231/CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>N2 Integratore</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Piastre a 24 pozzetti trattate con coltura cellulare</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzima, senza fenolo rosso</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Worthington</td><td>Biochemical NC9811754</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

La segnalazione del calcio è un regolatore integrale di quasi tutti i tessuti. All'interno dell'epitelio intestinale, il calcio è coinvolto nella regolazione dell'attività secretoria, nella dinamica dell'actina, nelle risposte infiammatorie, nella proliferazione delle cellule staminali e in molte altre funzioni cellulari non caratterizzate. Pertanto, la mappatura delle dinamiche di segnalazione del calcio all'interno dell'epitelio intestinale può fornire informazioni sui processi cellulari omeostatici e svelare risposte uniche a vari stimoli. Gli organoidi intestinali umani (HIO) sono un modello ad alto rendimento, derivato dall'uomo, per studiare l'epitelio intestinale e rappresentano quindi un sistema utile per studiare la dinamica del calcio. Questo documento descrive un protocollo per trasdurre stabilmente HIO con indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), eseguire microscopia a fluorescenza dal vivo e analizzare i dati di imaging per caratterizzare in modo significativo i segnali di calcio. Come esempio rappresentativo, gli HIO tridimensionali sono stati trasdotti con lentivirus per esprimere stabilmente GCaMP6s, un GECI citosolico basato su proteine fluorescenti verdi. Gli HIO ingegnerizzati sono stati poi dispersi in una sospensione a cellula singola e seminati come monostrati. Dopo la differenziazione, i monostrati HIO sono stati infettati con rotavirus e/o trattati con farmaci noti per stimolare una risposta al calcio. Un microscopio a epifluorescenza dotato di una camera di imaging dal vivo umidificata a temperatura controllata ha consentito l'imaging a lungo termine di monostrati infetti o trattati con farmaci. Dopo l'imaging, le immagini acquisite sono state analizzate utilizzando il software di analisi ImageJ, disponibile gratuitamente. Nel complesso, questo lavoro stabilisce una pipeline adattabile per la caratterizzazione della segnalazione cellulare negli HIO.

La Figura 1A mostra una cupola BMM contenente organoidi intestinali umani tridimensionali che sono stati trasdotti per esprimere stabilmente GCaMP6. La Figura 1B mostra la stessa linea di organoidi riplaccati come monostrato a 24, 48 e 72 ore dopo la semina. Per convalidare la funzione di GCaMP6s, il monostrato è stato sottoposto a imaging mediante microscopia a fluorescenza ogni 2 secondi per 4 minuti e 100 nM di ADP sono stati aggiunti al terreno dopo ~ 20 secondi. L'ADP provoca il rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico, aumentando il calcio citosolico. L'intensità di fluorescenza rilevata sul canale a 488 nm ad ogni esposizione è tracciata nella Figura 1C. La traccia mostra un'intensità di fluorescenza basale costante seguita da un rapido aumento dopo l'aggiunta di ADP e un graduale ritorno verso il basale. È incluso un controllo del veicolo per verificare che la risposta sia un vero evento di segnalazione e non semplicemente un cambiamento nell'intensità della fluorescenza che può derivare dall'aggiunta di media.
Il punteggio di un monostrato HIO aumenta l'efficienza dell'infezione da rotavirus. Sebbene le tecniche per il punteggio varino, è più facile ottenere un'infezione coerente utilizzando un singolo punteggio lungo la lunghezza del monostrato, come mostrato nella Figura 2A. Quando si utilizzano ceppi ricombinanti di rotavirus che esprimono proteine fluorescenti, l'infezione può essere verificata durante l'imaging dal vivo (Figura 2B). Quando si utilizza un ceppo che non esprime un marcatore, l'infezione può essere rilevata mediante immunofluorescenza dopo l'imaging. Data la motilità delle cellule nei monostrati HIO, è spesso difficile tracciare una singola cellula infetta nel tempo. Utilizzare invece la colorazione dell'endpoint come metodo per verificare l'infezione e confermare che la molteplicità dell'infezione corrisponda tra i campi visivi (Figura 2C).
Le onde intercellulari di calcio negli HIO possono essere osservate qualitativamente, come illustrato nella Figura 3A. Tuttavia, la determinazione della frequenza delle onde di calcio in un determinato campo visivo richiede un'analisi quantitativa. I passaggi per una segmentazione di successo, come descritto nel passaggio 6 del protocollo precedente, sono illustrati nella Figura 3A. La figura mostra l'immagine grezza (Figura 3Ai), l'immagine dopo che le intensità dei pixel del fotogramma precedente sono state sottratte (Figura 3Aii), quindi l'onda di calcio segmentata (Figura 3Aiii).
Una volta che le onde di calcio sono state segmentate e quantificate per ciascun campo visivo nel corso dell'esecuzione dell'imaging, è spesso utile confrontare la frequenza delle onde in monostrati esposti a varie condizioni. Il grafico a strisce nella Figura 3B mostra il numero totale di onde di calcio per campo visivo in monostrati finti e inoculati con rotavirus. Questo esempio include due ceppi di RV: un ceppo di rotavirus umano (Ito HRV) e un ceppo ricombinante di rotavirus delle scimmie SA11 che esprime mRuby (SA11-mRuby). Il controllo finto-infetto è preso come frequenza basale dell'onda di calcio, i monostrati infetti da rotavirus non trattati fungono da controlli positivi e i monostrati infettati da rotavirus e trattati sono le condizioni sperimentali. I monostrati con infezione simulata e con infezione da RV trattati con farmaci, incluso l'inibitore del recettore ADP, BPTU, possono quindi essere confrontati con entrambe le condizioni di controllo mediante ANOVA unidirezionale. I dati suggeriscono che la BPTU diminuisce efficacemente la frequenza delle onde intercellulari di calcio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig01.jpg"> Figura 1: Validazione dell'espressione di GCaMP6s in organoidi intestinali umani digiunali. (A) Dopo la trasduzione dei lentivirus, gli HIO che esprimono GCaMP sono stati sottoposti a selezione e passaggi multipli, mostrati qui a 7 giorni dal passaggio più recente. Dopo la stimolazione con il laser a 488 nm, l'espressione di GCaMP6s è evidente negli HIO trasdotti placcati in una matrice di membrana basale da 15 μL come sferoidi tridimensionali (Ai). Esposizioni di 50 ms sono state acquisite al 50% della potenza laser utilizzando un obiettivo 20x, quindi unite insieme per visualizzare l'intera cupola della matrice della membrana del basamento. Un processo simile è stato eseguito utilizzando esposizioni in campo chiaro (Aii) di 4 ms. Nell'immagine in campo chiaro, gli HIO scuri al centro della cupola sono un'indicazione che le culture sono pronte per il passaggio. (B) Gli HIO sono stati digeriti enzimaticamente in una sospensione a singola cellula, quindi riplaccati a una densità di 150.000 cellule per pozzetto (5 mm di diametro) di una piastra inferiore di imaging pre-rivestita con collagene IV. Entro 72 ore dalla semina, il monostrato era confluente e pronto per le applicazioni a valle. Per convalidare la funzione di GCaMP, le immagini sono state acquisite utilizzando il set di filtri da 488 nm con esposizioni di 50 ms al 50% della potenza laser ogni 2 s per 4 min. (C) Le tracce mostrate qui rappresentano l'intensità di fluorescenza dell'intero campo normalizzata alla prima acquisizione nel corso dell'imaging. A circa 20 s (freccia), dopo la decima esposizione, è stata aggiunta 100 nM di adenosina difosfato (ADP) per suscitare un picco di calcio citosolico (rosso). L'aggiunta di un volume uguale di 1x PBS non ha suscitato una risposta significativa (blu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig02.jpg"> Figura 2: Punteggio di un monostrato HIO per facilitare l'infezione del ventricolo destro. (A) La figura illustra una tecnica adatta per segnare un monostrato utilizzando un ago da 25G. (B) Un monostrato HIO è stato infettato con un ceppo ricombinante di RV che esprime la proteina fluorescente mRuby (magenta, freccia), consentendo l'identificazione delle cellule infette. In alternativa, quando si utilizza un ceppo naturale di RV, le cellule infette possono essere identificate utilizzando l'immunofluorescenza. (C) Le immagini mostrate provengono da 4 diversi monostrati HIO dopo la fissazione, la colorazione DAPI (blu) e la marcatura anticorpale dell'antigene del rotavirus (magenta). Entrambe le tecniche illustrano l'infezione preferenziale da ventricolo destro in prossimità della porzione segnata del monostrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig03.jpg"> Figura 3: Segmentazione e quantificazione delle onde di calcio intercellulari indotte da RV. Le esposizioni a 488 nm di HIO infetti da RV che esprimono GCaMP6 sono state acquisite ogni 1 minuto per 16 ore utilizzando il protocollo. (A) La figura illustra il processo di segmentazione delle onde intercellulari del calcio. Innanzitutto, i valori dei pixel dell'acquisizione precedente (t-1) vengono sottratti da ciascuna immagine grezza (Ai) per quantificare la variazione dell'intensità della fluorescenza (Aii). Viene quindi applicata una soglia basata su un aumento minimo di intensità ottimizzato sperimentalmente rispetto al fotogramma precedente. Le immagini vengono quindi filtrate per un'area minima del segnale contigua per selezionare le onde di calcio intercellulari (Aiii) ed escludere i segnali di calcio a singola cellula. Questa elaborazione consente di quantificare le onde di calcio in ogni campo visivo. In questo esperimento, i monostrati sono stati infettati simulatamente, infettati con il ceppo ITO di rotavirus umano (HRV) o infettati con un ceppo ricombinante di rotavirus delle scimmie che codifica per mRuby sul segmento genico 7, a valle della proteina non strutturale 3 (SA11-mRuby). I monostrati infetti sono stati trattati con l'inibitore del recettore ADP BPTU o non trattati. I monostrati sono stati quindi ripresi in 8 diverse posizioni e le onde di calcio in ciascun campo visivo sono state quantificate utilizzando la pipeline descritta in questo protocollo. I punti sul grafico a strisce indicano il numero di onde di calcio rilevate in ogni posizione sovrapposte a un grafico a barre che segna la media e la SD. L'ANOVA unidirezionale seguita dai test di Dunnett mostrano che mentre entrambi i ceppi di RV aumentano la frequenza delle onde intercellulari di calcio al di sopra di quella del gruppo non infetto, il trattamento BPTU previene l'aumento mediato da RV della frequenza delle onde di calcio. **P<0.01, ***P<0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Trasduzione</td>
			<td>Controllo</td>
		</tr><tr><td>Y-27632 (stock da 1 mM)</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>Polybrene (1 mg/μL di brodo)</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Lentivirus</td>
			<td>variabile*</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HighWnt-WRNE *vedi note</td>
			<td>fino a 400 μL</td>
			<td>fino a 400 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Terreno di trasduzione dei lentivirus. Preparare il terreno di trasduzione e il terreno di controllo combinando i reagenti nei volumi indicati rispettivamente nella seconda e nella terza colonna. Puntare a una molteplicità di infezione (MOI) di 10 unità di trasduzione di lentivirus per cellula. Per il ventricolo sinistro confezionato internamente, di solito sono necessari ~25-50 μL di LV concentrato. Il titolo della maggior parte dei LV confezionati in commercio sarà fornito con il certificato di analisi.
File di codifica supplementare 1: Script macro ImageJ per consentire la quantificazione delle onde di calcio mediante elaborazione batch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/Wave_counter.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Questo protocollo descrive un approccio per l'esecuzione dell'imaging del calcio in organoidi intestinali umani infettati da virus e offre un approccio all'analisi.

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Attraverso il nostro lavoro, miriamo a capire come i virus interrompono la segnalazione all'interno dell'epitelio intestinale. Siamo particolarmente interessati a comprendere i modi in cui le cellule infettate da virus disregolano le cellule non infette vicine per contribuire alla patogenesi. Recentemente abbiamo scoperto che le cellule infettate da rotavirus rilasciano impulsi di ADP, che disregola le cellule non infette vicine e facilita la diffusione virale ed esacerba la malattia.Sebbene l'imaging del calcio sia molto popolare in campi come le neuroscienze, non è stato ampiamente utilizzato per studiare la biologia epiteliale o la virologia. Questo protocollo offre un approccio per adattare le tecnologie esistenti e i sistemi modello per studiare la segnalazione del calcio e il tessuto epiteliale vivo infettato da virus. Ingegnerizzando organoidi per esprimere indicatori di calcio geneticamente codificati, il nostro approccio consente un imaging coerente e riproducibile a lungo termine in un sistema modello che ricapitola la diversità cellulare dell'epitelio intestinale umano.Il nostro obiettivo è comprendere gli effetti della segnalazione purinergica paracrina indotta dal virus sia per l'ospite che per il virus. Il nostro lavoro futuro determinerà anche se questo tipo di segnalazione è ampiamente conservato in altri virus e se gli effetti sono simili.

live-calcium-imaging-virus-infected-human-intestinal-organoid

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il reticolo endoplasmatico svolge un ruolo chiave nella biogenesi di proteine ​​e di omeostasi del calcio. Abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci permette di affrontare il ruolo di canali Ca2 + perdite e caratterizzare i meccanismi putativi regolamentazione. Questo sistema comporta silenziamento genico mediato siRNA e cellule vive Ca2 + imaging.

Vivere Imaging calcio cella Combinato con il silenziamento del gene mediata siRNA Identifica Ca 2 + Canali di perdite nella membrana ER e nei relativi meccanismi regolatori

Questo video introduce i concetti alla base dell'imaging del calcio e include un protocollo di esempio per l'imaging time-lapse di vermi contenuti in pozzetti di agarosio modellati.

Imaging del calcio: un metodo per visualizzare l'attività neurale in C. elegans vivo

Fonte: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Imaging del sistema nervoso enterico. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Questo video dimostra il calcio imaging per visualizzare e analizzare l'attività dei neuroni enterici e della glia nelle preparazioni del plesso mienterico del colon di topo.

Imaging del calcio delle attività dei neuroni enterici e della glia in un plesso mienterico del colon di topo

Fonte: Doser, R., et al. Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Questo video mostra l'imaging in vivo del flusso di calcio subcellulare nei neuroni del cordone nervoso ventrale dei ceppi transgenici di Caenorhabditis elegans. Vengono impiegati due indicatori di calcio distinti: un indicatore citoplasmatico in un ceppo e un indicatore mitocondriale in un altro. I neuroni vengono osservati al microscopio a fluorescenza per monitorare in tempo...

Imaging della dinamica subcellulare del calcio nei neuroni di Caenorhabditis elegans

Questo protocollo spiega cultura organoide Lgr5-positivo primaria e la successiva esecuzione di trasduzione retrovirale. Ciò consente sovraespressione Cre-inducibile o knockdown del transgene consegnato e permette studi funzionali da realizzare nel romanzo in vitro organotipica   sistema modello.

Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura

Il sistema nervoso enterico (ENS) è una rete di neuroni e glia situata nella parete intestinale che controlla i riflessi intestinali. Questo protocollo descrive i metodi per registrare l'attività dei neuroni enterici e della glia in preparazioni vive di ENS utilizzando l'imaging Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervoso enterico

Questo metodo fornisce un modo per coppie di optogenetica e sensori di calcio geneticamente codificati per l'immagine dei livelli di calcio citosolico di base e cambiamenti nei transitori di calcio evocati nei muscoli della parete del corpo dell'organismo modello C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

Qui, presentiamo un protocollo in cui le singole cellule vengono monitorate per eventi acuti e infezioni produttive da HIV-1 su un dispositivo nanofluidico. I dati di imaging definiscono le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Questo è il primo metodo per la coltura e l'imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica per studiare la cinetica segnalante e le interazioni molecolari.

Caratterizzazione a una cellula dell'afflusso di calcio e dell'infezione da HIV-1 utilizzando una piattaforma optofluidica multiparametro

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

L'imaging a cellule vive della segnalazione del calcio viene ampiamente utilizzato per studiare la mobilitazione del calcio nelle linee cellulari stabili coltivate in monostrati. Questo protocollo descrive l'imaging di fluorescenza a cellule vive della segnalazione del calcio utilizzando coloranti di cellule vive su tessuti complessi e primari, e utilizza anche software di apprendimento automatico per quantificare simultaneamente l'intensità di fluorescenza di migliaia di singole cellule,...

Imaging del calcio basato sulla fluorescenza nelle colture epiteliali primarie delle vie aeree umane utilizzando segmentazione cellulare automatizzata

Impara l'imaging del calcio in monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori geneticamente codificati. Questo metodo consente di studiare le alterazioni della segnalazione nel tessuto epiteliale infetto.

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (Video) | JoVE Journal

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Esplora altri video