Name: Utilizzo dellimaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dellippocampo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Scopri come misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo utilizzando l'imaging su cellule vive. Questo metodo aiuta a identificare i meccanismi di neurotossicità indotta dalla proteina tau.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualizzazione delle proteine nei neuroni primari dell'ippocampo mediante imaging di cellule vive

<ol><li>Kneynsberg, A., Combs, B., Christensen, K., Morfini, G., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+degeneration+in+tauopathies%3A+disease+relevance+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal degeneration in tauopathies: disease relevance and underlying mechanisms.</a> Front Neurosci. 11, 572(2017).</li>
<li>Combs, B., Mueller, R. L., Morfini, G., Brady, S. T., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+and+axonal+transport+misregulation+in+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Tau and axonal transport misregulation in tauopathies.</a> Adv Exp Med Biol. 1184, 81-95 (2019).</li>
<li>Brady, S. T., Morfini, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+motor+proteins%2C+axonal+transport+deficits+and+adult-onset+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases.</a> Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+defects+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport defects in neurodegenerative diseases.</a> J Neurosci. 29 (41), 12776-12786 (2009).</li>
<li>Brady, S. T., Lasek, R. J., Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+axonal+transport+in+extruded+axoplasm+from+squid+giant+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fast axonal transport in extruded axoplasm from squid giant axon.</a> Science. 218 (4577), 1129-1131 (1982).</li>
<li>LaPointe, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminus+of+tau+inhibits+kinesin-dependent+axonal+transport%3A+implications+for+filament+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">The amino terminus of tau inhibits kinesin-dependent axonal transport: implications for filament toxicity.</a> J Neurosci Res. 87 (2), 440-451 (2009).</li>
<li>Kanaan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+forms+of+tau+inhibit+kinesin-dependent+axonal+transport+through+a+mechanism+involving+activation+of+axonal+phosphotransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenic forms of tau inhibit kinesin-dependent axonal transport through a mechanism involving activation of axonal phosphotransferases.</a> J Neurosci. 31 (27), 9858-9868 (2011).</li>
<li>Kanaan, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+in+the+amino+terminus+of+tau+prevents+inhibition+of+anterograde+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation in the amino terminus of tau prevents inhibition of anterograde axonal transport.</a> Neurobiol Aging. 33 (4), 826.e15-826.e30 (2012).</li>
<li>Pigino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+fast+axonal+transport+is+a+pathogenic+mechanism+for+intraneuronal+amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Disruption of fast axonal transport is a pathogenic mechanism for intraneuronal amyloid beta.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5907-5912 (2009).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+huntingtin+inhibits+fast+axonal+transport+by+activating+JNK3+and+phosphorylating+kinesin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathogenic huntingtin inhibits fast axonal transport by activating JNK3 and phosphorylating kinesin.</a> Nat Neurosci. 12 (7), 864-871 (2009).</li>
<li>Morfini, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fast+axonal+transport+by+pathogenic+SOD1+involves+activation+of+p38+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fast axonal transport by pathogenic SOD1 involves activation of p38 MAP kinase.</a> PLoS One. 8 (6), e65235(2013).</li>
<li>Combs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontotemporal+lobar+dementia+mutant+tau+impairs+axonal+transport+through+a+protein+phosphatase+1gamma-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Frontotemporal lobar dementia mutant tau impairs axonal transport through a protein phosphatase 1gamma-dependent mechanism.</a> J Neurosci. 41 (45), 9431-9451 (2021).</li>
<li>Christensen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphomimetics+at+Ser199%2FSer202%2FThr205+in+tau+impairs+axonal+transport+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Phosphomimetics at Ser199/Ser202/Thr205 in tau impairs axonal transport in rat hippocampal neurons.</a> Mol Neurobiol. 60 (6), 3423-3438 (2023).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J Vis Exp. (65), 3634(2012).</li>
<li>Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KymoAnalyzer%3A+a+software+tool+for+the+quantitative+analysis+of+intracellular+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons.</a> Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).</li>
<li>Cox, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+isoform-specific+tau+aggregates+suggests+a+common+toxic+mechanism+involving+similar+pathological+conformations+and+axonal+transport+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Analysis of isoform-specific tau aggregates suggests a common toxic mechanism involving similar pathological conformations and axonal transport inhibition.</a> Neurobiol Aging. 47, 113-126 (2016).</li>
<li>Tiernan, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudophosphorylation+of+tau+at+S422+enhances+SDS-stable+dimer+formation+and+impairs+both+anterograde+and+retrograde+fast+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pseudophosphorylation of tau at S422 enhances SDS-stable dimer formation and impairs both anterograde and retrograde fast axonal transport.</a> Exp Neurol. 283 (Pt A), 318-329 (2016).</li>
<li>Mueller, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau%3A+a+signaling+hub+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tau: a signaling hub protein.</a> Front Mol Neurosci. 14, 647054(2021).</li>
<li>Hedstrom, K. L., Ogawa, Y., Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AnkyrinG+is+required+for+maintenance+of+the+axon+initial+segment+and+neuronal+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AnkyrinG is required for maintenance of the axon initial segment and neuronal polarity.</a> J Cell Biol. 183 (4), 635-640 (2008).</li>
<li>Basu, H., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuoVadoPro%2C+an+autonomous+tool+for+measuring+intracellular+dynamics+using+temporal+variance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">QuoVadoPro, an autonomous tool for measuring intracellular dynamics using temporal variance.</a> Curr Protoc Cell Biol. 87 (1), e108(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,4% Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL provette per microcentrifuga</td><td>DOT</td><td>RN1700-GMT</td><td></td></tr><tr><td>2,5% tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>3 mL siringa con ago da 21 G</td><td>Fisher</td><td>14-826-84</td><td></td></tr><tr><td>10 mL siringa in plastica</td><td>Fisher</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>14 G ago</td><td>Fisher</td><td>14-817-203</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 15 G</td><td>Medline</td><td>SWD200029Z</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 16 G</td><td>Fisher</td><td>14-817-104</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 18 G</td><td>Fisher</td><td>14-840-97</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 22 G</td><td>Fisher</td><td>14-840-90</td><td></td></tr><tr><td>32% paraformaldeide</td><td>Fisher</td><td>50-980-495</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 IgG di capra anti-coniglio (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21244</td><td>RRID:AB_2535813</td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>Arruga Micro Embrionale Capsula Forcipe, Curvo; 4"&nbsp;</td>Integratore B-27 <td>per autoclave</td> <td>Roboz</td><td>RS-5163</td></tr><tr><td>(50x), senza siero</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat Piastre di lisina Poly D a 24 pozzetti&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-774-124</td><td></td></tr><tr><td>acido borico</td><td>Sigma</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 3 1/2" Lungo 8 x 0,15 mm Angolo Forbici affilate</td><td>Autoclave</td><td>Roboz</td><td>RS-5658</td></tr><tr>Dispositivo <td></td><td></td><td>di conteggio delle cellule</td> Microscopio confocale <td>automatico o manuale</td></tr><tr><td>con attacco</td> <td>per camera cellulare viva</td><td></td><td></td></tr><tr>Software <td></td><td></td><td></td><td>di imaging confocale</td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I (Worthington)</td><td>Fisher</td><td>NC9185812</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher</td><td>O2783-100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Fatal-Plus</td><td>Vortech Prodotti farmaceutici, LTD</td><td>NDC 0298-9373-68</td><td>pentobarbital sodico; possono essere utilizzati altri metodi approvati di eutanasia.</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione reattiva per gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>sostituto della glutammina</td></tr> Soluzione <tr><td>salina bilanciata di Hanks</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ versione 1.51n</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Life-Line versione 2017 30 maggio: https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>KymoAnalyzer (versione 1.01)</td><td>Encalada Lab</td><td></td><td>La confezione include tutti e 6 i macro: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Invitrogen</td><td>100022050</td><td>Utilizzare con il reagente potenziatore di trasfezione P3000</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Fisher</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MES idrato</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per micro dissezione 3,5" Dritto Affilato/Affilato</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>autoclave</td></tr><tr><td>Neurobasal Plus medium</td><td>Gibco</td><td>A3582901</td><td></td></tr><tr><td>Neurofascin (A12/18) Topo IgG2a</td><td>UC Davis/NIH NeuroMab</td><td>75-172</td><td>RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Funziona nei neuroni di ratto, NON nei neuroni di topo</td></tr><tr><td>Neurofascin 186 (D6G60) Segnalazione cellulare IgG di coniglio</td><td></td><td>15034</td><td>RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Funziona nei neuroni di topo, non abbiamo testato nei neuroni di ratto</td></tr><tr><td>siero di vitello neonato</td><td>Gibco</td><td>16010-167</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>P3000</td><td>Invitrogen</td><td>100022057</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri, 100 x 10 mm di vetro</td><td>Fisher</td><td>08-748B</td><td>Per dissezione; autoclave</td></tr><tr><td>Piastra di Petri, 100 x 20 mm di vetro</td><td>Fisher</td><td>08-748D</td><td>Per inserire le corna uterine; autoclave</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P7886-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche in polipropilene (15 mL)</td><td>Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche in polipropilene (50 mL)</td><td>Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>borato di sodio decaidrato</td><td>VWR</td><td>MK745706</td><td></td></tr><tr><td>Forbici operative a lama dritta Blunt/Sharp</td><td>Fisher</td><td>13-810-2</td> filtri per siringhe <td>per autoclave</td></tr><tr><td>, 0,22 e micro; m</td><td>VWR</td><td>514-1263</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per medicazione pollice, seghettata, 4,5"</td> <td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>autoclave</td></tr><tr><td>&micro;-Slide 4 pozzetti fondo in vetro</td><td>Ibidi</td><td>80427</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzo dell'imaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

Utilizzando questi metodi, abbiamo caratterizzato il trasporto assonale in presenza di forme wild-type o correlate alla malattia della proteina tau per esaminare i potenziali meccanismi di neurotossicità patologica indotta dalla tau nella malattia12,13. Il software KymoAnalyzer calcola e raggruppa una varietà di parametri diversi da tutti i chimografi all'interno di una determinata cartella. Le tariffe di trasporto sono calcolate solo quando il carico è in movime...

Utilizzo dell'imaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal ...

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L'imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati ​​con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Noi descriviamo un protocollo che permette l'imaging di mitocondri in vita i neuroni tramite microscopia a fluorescenza su durate lunghe. Imaging per lunghi periodi si realizza attraverso lentivirus-mediata espressione di una proteina fluorescente mitocondri mirata e l'uso di un poco costoso stadio-top incubatore che è stato progettato e costruito nel nostro laboratorio.

Neuromodulazione e mitocondriale di trasporto: Imaging Live in neuroni dell&#39;ippocampo oltre durate a lungo

Questo rapporto descrive l'uso di imaging cellulare dal vivo e le tecniche di fotosbiancante per determinare l'espressione di superficie, vie di trasporto e la cinetica di traffico esogeno espresso, sensibile al pH GFP-tagged proteine ​​a livello della membrana plasmatica dei neuroni.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Il trasporto assonale di BDNF, un fattore neurotrofico, è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione di diverse popolazioni neuronali. Alcune malattie degenerative sono contrassegnate dalla rottura della struttura e funzione assonale. Abbiamo dimostrato le tecniche utilizzate per esaminare il traffico in tempo reale di QD-BDNF in camere di microfluidica con neuroni primari.

In tempo reale Imaging del trasporto assonale di Quantum Dot-etichettato BDNF in neuroni primari

Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono rilevato da microscopia chiara di pHluorin fuso con proteine delle vescicole sinaptiche e da microscopia elettronica dell'assorbimento della vescicola.

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

Qui è presentato un protocollo per indagare gli effetti precoci dell'amiloide-β (Aβ) nel cervello.  Questo dimostra che Aβ induce endocytosis clathrin-mediato e crollo dei coni di crescita assonale. Il protocollo è utile per studiare effetti precoci di Aβ sui coni di crescita assonale e può facilitare la prevenzione del morbo di Alzheimer.

Visualizzazione di collasso del cono di crescita assonale ed effetti precoci β amiloide in neuroni coltivati del topo

Qui, abbiamo descritto un protocollo per studiare quantitativamente l'assemblaggio e la struttura dei segmenti iniziali di axon (AIS) dei neuroni ippocampali che mancano di AIS pre-assemblato a causa dell'assenza di un anchirina-G gigante.

Uso di neuroni ippocampali coltivati primari per studiare l'assemblaggio dei segmenti iniziali di Axon

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Utilizzando topi fluorescenti transgenici, vengono descritti protocolli dettagliati per valutare il trasporto assonale in vivo di endosomi e mitocondri di segnalazione all'interno di assoni motori e sensoriali del nervo sciatico intatto in animali vivi.

Espansione del toolkit per l'imaging in vivo del trasporto assonale

Presentiamo qui un protocollo su come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia da cortecce di ratto per l'imaging video time-lapse di Ca2+ intracellulare per la ricerca sulla fisiopatologia della sclerosi laterale amiotrofica nel modello di ratto hSOD1G93A .

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

Scopri come misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo utilizzando l'imaging su cellule vive. Questo metodo aiuta a identificare i meccanismi di neurotossicità indotta dalla proteina tau.

Utilizzo dellimaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dellippocampo (Video) | JoVE Journal

Utilizzo dell'imaging su cellule vive per misurare gli effetti delle proteine patologiche sul trasporto assonale nei neuroni primari dell'ippocampo

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