Fabbricazione di griglia di affinità streptavidina per la preparazione di campioni di microscopia crioelettronica
29 dicembre 2023
Viene fornito un protocollo passo-passo per la fabbricazione di griglie di affinità per streptavidina da utilizzare in studi strutturali di campioni macromolecolari impegnativi mediante microscopia crioelettronica.
Ci sono stati molti recenti progressi tecnologici nella crio-EM, compresi i progressi nell'hardware del microscopio stesso che migliorano la qualità complessiva delle immagini, e anche gli sviluppi nel software utilizzato per elaborare le immagini crio-EM che possono iniziare a gestire le grandi quantità di eterogeneità presenti in molti dei campioni. La preparazione del campione rimane uno dei maggiori colli di bottiglia nella crio-EM. La quantità di campione può essere limitante e le proteine tendono ad assorbire l'interfaccia idrofobica aria-acqua durante la vetrificazione.
Ciò può portare alla denaturazione del campione, alla rottura di complessi proteici più grandi e agli orientamenti preferiti delle particelle presenti nelle immagini crio-EM. Queste griglie sfruttano l'interazione ad alta affinità tra streptavidina e biotina per legare i campioni biotinilati e proteggerli dall'interfaccia idrofobica aria-acqua. Siamo in grado di lavorare con quantità di campione molto basse e la biotina casuale dei campioni offre una strategia per superare i problemi di orientamento preferenziale che possono essere osservati quando si utilizzano altri strati di supporto.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la fabbricazione di griglie ad affinità per lo streptavidina, essenziali per studi strutturali di campioni macromolecolari difficili mediante microscopia elettronica criogenica (cryo-EM). Il metodo affronta problemi comuni nella preparazione dei campioni, come la denaturazione proteica e i bias di orientamento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microscopia elettronica criogenica
- Biologia strutturale
- Analisi macromolecolare
Sfondo
- I recenti progressi nella tecnologia della criomicroscopia elettronica hanno migliorato la qualità delle immagini.
- La preparazione del campione rappresenta un collo di bottiglia significativo nei flussi di lavoro della criomicroscopia elettronica.
- Le proteine possono denaturarsi o orientarsi in modo preferenziale durante la preparazione del campione.
- Le interazioni streptavidina-biotina possono stabilizzare i campioni e mitigare questi problemi.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo affidabile per la preparazione di griglie a affinità con streptavidina.
- Migliorare la qualità delle immagini di microscopia crioelettronica riducendo la denaturazione del campione.
- Risolvere i problemi di orientamento preferenziale nei campioni di microscopia crioelettronica.
Metodi Utilizzati
- Pulizia e preparazione di siringhe di vetro e griglie con etanolo e cloroformio.
- Creazione di monocapucci lipidici per stabilizzare campioni biotinilati.
- Incubazione delle griglie con streptavidina e lavaggio per rimuovere le proteine non legate.
- Utilizzo dell'evaporazione di carbonio per preparare le griglie per l'analisi mediante imaging.
Risultati principali
- Il protocollo ha prodotto con successo griglie che hanno mantenuto l'integrità del campione.
- I micrografici hanno mostrato un modello di griglia continuo, indicativo di una formazione efficace del reticolo.
- L'analisi della trasformata di Fourier rapida ha confermato la rimozione dei segnali di streptavidina.
- Il metodo consente l'uso di quantità ridotte di campione senza compromettere la qualità.
Conclusioni
- Il protocollo con griglie di affinità alla streptavidina è efficace per studi di microscopia elettronica criogenica.
- Questo approccio può migliorare significativamente l'analisi di campioni macromolecolari difficili.
- Applicazioni future potrebbero ulteriormente potenziare la ricerca in biologia strutturale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La fabbricazione di griglie a affinità per lo streptavidina risolve colli di bottiglia persistenti nella preparazione dei campioni per la microscopia criogenica (cryo-EM), consentendo un'analisi strutturale ad alta fedeltà di macromolecole disponibili in quantità limitate. Riducendo la denaturazione e gli artefatti di orientamento all'interfaccia aria-acqua, questo metodo aumenta l'affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta e nei flussi di lavoro della biologia strutturale. Il suo protocollo robusto ne favorisce l'adozione su scala aziendale per target difficili e assemblaggi complessi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi strutturale di complessi proteici a bassa abbondanza o fragili.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica preservando le conformazioni native durante la vetrificazione.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio grazie al migliorato stato di integrità del campione.
- Facilita la selezione prioritaria di progetti fornendo dati strutturali affidabili per bersagli difficili.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara griglie di criomicroscopia elettronica validate per flussi di lavoro di imaging ad alto rendimento successivi.
- Migliora la riproducibilità del saggio riducendo al minimo la perdita di campione e il bias di orientamento.
- Consente letture strutturali quantitative essenziali per la valutazione dei composti.
- Permette il riutilizzo della piattaforma per diversi bersagli e complessi biotinilati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati strutturali agli assemblaggi biomolecolari rilevanti per la malattia, quando applicabile.
- Garantisce la continuità dalla caratterizzazione nella fase di scoperta alla validazione preclinica.
- Riduce i rischi nell'avanzamento traslazionale confermando l'integrità molecolare in condizioni di microscopia crioelettronica (cryo-EM).
- Supporta decisioni basate sulla valutazione del rischio per biologici complessi e diverse modalità terapeutiche.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di fabbricazione si integra all'interfaccia tra preparazione del campione e analisi strutturale, collegando le fasi iniziali della scoperta e dell'identificazione dei composti promettenti per bersagli strutturalmente complessi.
- Biologia della Scoperta: Fornisce una piattaforma per la verifica di ipotesi e la chiarificazione di vie metaboliche mediante imaging ad alta risoluzione.
- Screening: Consente la preparazione riproducibile e quantitativa di griglie per analisi successive affidabili.
- Analisi: Permette misurazioni solide della formazione del reticolo e dell'integrità del campione attraverso l'analisi di micrografie e FFT.
- Ricerca Translazionale: Facilita la continuità preclinica supportando studi strutturali di complessi rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo Aziendale: Offre un flusso di lavoro standardizzato e riutilizzabile per la preparazione di campioni biotinilati in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce il rischio meccanicistico negli studi strutturali.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione delle griglie, migliorando la riproducibilità e la scalabilità tra i diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate su prosegui/non prosegui fornendo dati affidabili per target difficili.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di asset strutturalmente complessi con una gestione del rischio adeguata.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze tecniche nella manipolazione delle griglie per microscopia crioelettronica e nella chimica della biotinilazione.
- Necessita dell'accesso a strumentazione specializzata per la fabbricazione delle griglie e l'evaporazione del carbonio.
- Trarre beneficio da una standardizzazione tra gruppi di lavoro per garantire riproducibilità e supporto nella risoluzione dei problemi.
- Adattabile a diverse proteine e complessi biotinilati, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per nuovi bersagli.
- La limitata disponibilità commerciale richiede l'adozione e la formazione interna sul protocollo.
