Name: Fabbricazione di griglia di affinità streptavidina per la preparazione di campioni di microscopia crioelettronica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Impara a fabbricare griglie di affinità streptavidina per la microscopia crioelettronica. Questo protocollo stabilizza campioni biotinilati, riduce la denaturazione proteica e risolve i problemi di orientamento preferenziale nelle immagini.

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T.C. è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences borsa di studio per la formazione in biofisica molecolare GM-08295 e dalla borsa di studio per la ricerca universitaria della National Science Foundation con numero di sovvenzione DGE 2146752. R.G. e B.H. sono stati sostenuti dalla sovvenzione R21-GM135666 del National Institute of Health assegnata a R.G. e B.H. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato attraverso la sovvenzione R35-GM127018 del National Institute of General Medical Sciences assegnata a E.N. E.N. è un ricercatore dell'Howard Hughes Medical Institute.

Fabbricazione di griglie di affinità per streptavidina per studi strutturali Cryo-EM

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<li>Domínguez-Martín, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+a+phycobilisome+in+light-harvesting+and+photoprotected+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states.</a> Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).</li>
<li>Kasinath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JARID2+and+AEBP2+regulate+PRC2+in+the+presence+of+H2AK119ub1+and+other+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications.</a> Science. 371 (6527), eabc3393(2021).</li>
<li>Lahiri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3.1+structure+of+yeast+RNA+polymerase+II+elongation+complex+stalled+at+a+cyclobutane+pyrimidine+dimer+lesion+solved+using+streptavidin+affinity+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids.</a> Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638(1988).</li>
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</ol>

Il nostro protocollo descrive come creare e utilizzare griglie di affinità della streptavidina e come elaborare i dati contenenti il segnale di diffrazione della streptavidina. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo che richiedono un'attenzione speciale.
I batch di griglia non riusciti possono essere ricondotti a diversi errori comuni. La fonte di errore più comune deriva dall'utilizzo di reagenti obsoleti o di scarsa qualità. È particolarmente importante preparare la soluzione lipidica biotinilata esattamente come descritto nel protocollo. Inoltre, eventuali impurità, come residui di detersivo sul materiale da laboratorio o oli naturalmente presenti sulla pelle, possono influire sulla qualità dei cristalli di streptavidina e, quindi, sulla qualità delle immagini risultanti. Si consiglia quindi di eseguire tre cicli di lavaggio delle griglie prima della prima evaporazione del carbonio per rimuovere l'eventuale contaminazione da tensioattivi dal produttore della griglia (fase 2.1). Inoltre, è stato osservato che la contaminazione o l'impurità dell'olio di ricino ostacola la formazione di cristalli sulla griglia.
Realizzare e raccogliere il monostrato lipidico è un'attività che dovrebbe essere praticata un paio di volte per avere un'idea dei piccoli volumi lipidici. Non è insolito che questo passaggio fallisca le prime due o tre volte prima che possa essere prodotto un monostrato lipidico adeguato, come si riflette in ultima analisi nella qualità dei cristalli di streptavidina che si vedono nelle griglie colorate negativamente (Figura 4C).
È importante non lasciare mai che la parte posteriore (lato oro, lato lipidico) della griglia si bagni durante il processo di fabbricazione della griglia (passaggi 3.12-3.20). Nel caso in cui la parte posteriore si bagni, si consiglia di scartare la griglia. Ciò può causare la comparsa di vescicole lipidiche di grandi dimensioni che interrompono la qualità dell'immagine (Figura 5D) (Riga 3, Tabella 1). Le vescicole lipidiche possono essere osservate anche a causa di un lavaggio insufficiente dopo l'applicazione del monostrato lipidico (passaggio 3.13). Si raccomandano tre lavaggi successivi con tampone di cristallizzazione dopo aver toccato il monostrato lipidico prima di aggiungere streptavidina.
Dopo che un sottile strato di carbonio è stato evaporato su griglie incorporate in trealosio, la parte posteriore della griglia può essere bagnata senza danneggiare la qualità del reticolo. Ad esempio, la bagnatura della parte posteriore si osserva spesso quando il tampone del campione contiene quantità anche minime di detersivo. La bagnatura della parte posteriore da parte del campione può provocare un legame non specifico dei campioni al sottile film di carbonio sul retro, il che riduce l'efficacia di impedire alle particelle di diffondersi all'interfaccia aria-acqua o l'uso del legame di affinità per le strategie di purificazione in griglia. Se possibile, aggiungere il campione alla griglia in assenza di detersivo. Il detersivo e altri additivi possono essere aggiunti successivamente durante le fasi di lavaggio della griglia o aggiunti in una fase finale prima della vetrificazione. Questa è una limitazione all'uso delle griglie di affinità della streptavidina; Tuttavia, se l'obiettivo è quello di migliorare l'orientamento preferenziale, la preparazione del campione con tamponi, compreso il detergente, è stata eseguita con successo11.
Una fonte comune di errore può essere ricondotta all'età delle griglie rispetto a entrambe le fasi di evaporazione del carbonio (fase 2.3 e fase 3.21). In questo protocollo, il periodo di attesa raccomandato è di 5-7 giorni dopo l'evaporazione del carbonio posteriore prima di utilizzare le griglie di streptavidina per la crio-EM. Quando le griglie vengono utilizzate troppo presto dopo la fabbricazione, è stato osservato che il reticolo e il monostrato lipidico si mobilizzano fuori dai fori della griglia. Un'osservazione simile può essere fatta quando le griglie sono troppo vecchie e utilizzate dopo sei mesi (Figura 5A) (Riga 1, Tabella 1). Ipotizziamo che questa osservazione sia spiegata da cambiamenti nell'idrofobicità del supporto di carbonio che viene applicato per stabilizzare il monostrato lipidico e i cristalli di streptavidina. Inoltre, i reticoli di streptavidina possono apparire a mosaico (Figura 5B) (Riga 3, Tabella 1) e rotti sia nella colorazione negativa che nella crio-EM se il monostrato viene applicato a griglie in cui il primo strato di evaporazione del carbonio (fase 2.3) non è sufficientemente invecchiato.
Un'ulteriore fonte comune di errore può essere ricondotta alla fragilità del monostrato cristallino della streptavidina (il monostrato lipidico è esso stesso fluido e può espandersi o comprimersi in modo reversibile). L'evaporazione del carbonio sul retro (fase 3.21) fornisce una stabilità critica sia al monostrato che al reticolo di streptavidina durante il processo di adsorbimento del campione, lavaggio e crio-EM blotting. In assenza di una sufficiente evaporazione del carbonio sul retro della griglia, i reticoli di streptavidina appariranno spesso frammentati dopo la tamponazione/congelamento (Figura 5C) (Riga 2, Tabella 1). In questo protocollo, suggeriamo l'uso di un congelatore a immersione automatizzato su un lato per il blotting su un lato. Questo metodo produce condizioni di blotting altamente riproducibili che preservano il reticolo di streptavidina durante il processo di congelamento e consentono un'ottimizzazione semplificata dell'applicazione del campione e dei parametri di blotting. In alternativa, sono stati utilizzati altri apparecchi di surgelazione automatica in combinazione con il tamponamento manuale. Per fare ciò, l'effettiva funzione di tamponamento è disabilitata nelle impostazioni del dispositivo e la griglia viene invece tamponata raggiungendo con un paio di pinzette che tengono la carta assorbente attraverso l'ingresso laterale. Questo metodo può ottenere risultati di alta qualità per i laboratori che non dispongono di un dispositivo di tamponamento e surgelazione su un solo lato; Tuttavia, la riproducibilità da rete a rete è impegnativa.
Sebbene l'utilizzo delle griglie di affinità della streptavidina abbia molti vantaggi, è necessario prendere in considerazione alcune limitazioni di questo metodo. A causa della natura della procedura, di solito non è possibile valutare la qualità del reticolo di streptavidina fino a quando l'intero processo non è stato completato. Si consiglia di selezionare rapidamente la qualità di ciascun lotto in base alla colorazione negativa prima di congelare i campioni. A causa del segnale fornito dal reticolo della streptavidina alle immagini grezze, può essere difficile in alcuni casi valutare, dalle sole immagini, se c'è un numero sufficiente di particelle intatte e disperse. Per lo stesso motivo, l'elaborazione al volo dei dati crio-EM durante l'acquisizione dei dati non è possibile a meno che la procedura di sottrazione del segnale della streptavidina non sia stata inclusa nella pipeline di pre-elaborazione dei dati. Poiché il segnale della streptavidina viene solitamente sottratto dalle immagini corrette per il movimento e non dai fotogrammi stessi, la lucidatura bayesiana, implementata nelle suite software più diffuse, potrebbe non riuscire quando si utilizzano le procedure di sottrazione descritte. Si raccomanda quindi di eseguire la correzione del movimento in più patch per ridurre al minimo il movimento delle particelle dall'inizio dell'elaborazione dei dati16.
Nonostante queste limitazioni, le griglie di affinità della streptavidina offrono molti vantaggi. Due dei principali vantaggi che le griglie di affinità della streptavidina offrono rispetto alle griglie crio-EM standard a foro aperto sono un mezzo per proteggere i campioni dall'interfaccia aria-acqua e concentrare i campioni di bassa abbondanza (10-100 nM) sulla griglia. Anche altri strati di supporto, come l'ossido di carbonio e l'ossido di grafene, possono essere utilizzati come strategie per superare questi colli di bottiglia nella preparazione dei campioni. In un esempio, le griglie di affinità della streptavidina erano l'unica soluzione per ottenere una ricostruzione intatta di un'interazione proteina-acido nucleico che era incompatibile con gli approcci di cross-linking. 12
Un altro grande vantaggio fornito dalle griglie di affinità della streptavidina è una soluzione per i campioni che si adsormono ad altri strati di supporto, come l'ossido di carbonio o di grafene, con orientamenti preferenziali che ostacolano la capacità di ottenere una ricostruzione 3D del campione di interesse. La biotinilazione casuale dei campioni utilizzando kit disponibili in commercio consente l'attacco casuale del campione di interesse al monostrato di streptavidina per ottenere più viste potenziali per superare questa sfida.
Inoltre, le griglie di affinità della streptavidina offrono vantaggi unici rispetto alle griglie basate sull'affinità. L'elevata affinità e specificità dell'interazione streptavidina-biotina consente l'accoppiamento delle griglie di affinità della streptavidina con altri flussi di lavoro che coinvolgono la biotina per purificare i complessi di interesse. In un esempio pubblicato, gli autori hanno immobilizzato un complesso sulle griglie di affinità della streptavidina e hanno incubato un partner di legame di stechiometria sconosciuta in grande eccesso. Dopo aver lavato via qualsiasi proteina non legata, il supercomplesso correttamente assemblato è stato ottenuto e ha potuto essere immediatamente analizzato con cryo-EM11. Una possibile applicazione futura potrebbe essere quella di combinare i tag proteici leganti la streptavidina, il sistema Avi-tag o gli approcci di marcatura di prossimità con le griglie di affinità della streptavidina per estrarre singole proteine e/o complessi proteici direttamente da fonti ricombinanti o endogene senza schemi di purificazione elaborati standard.
Fornendo questo protocollo, i laboratori dovrebbero essere in grado di riprodurre facilmente la fabbricazione di griglie di affinità della streptavidina e stabilirle come uno strumento più comunemente usato per l'analisi strutturale di complessi proteici mediante crio-EM.

La criomicroscopia elettronica (cryo-EM) ha rivoluzionato il campo della biologia strutturale consentendo la determinazione della struttura macromolecolare di campioni grandi, flessibili ed eterogenei che in precedenza erano inaccessibili con la cristallografia a raggi X o la risonanza magnetica nucleare1. Questo metodo funziona congelando le macromolecole in soluzione per creare un sottile strato di ghiaccio vitreo che può essere successivamente ripreso utilizzando un microscopio elettronico. Negli ultimi anni, i progressi significativi sia nell'hardware del microscopio che nel software di elaborazione delle immagini hanno ulteriormente ampliato i tipi di campioni adatti alla determinazione della struttura ad alta risoluzione mediante crio-EM.
Tuttavia, la preparazione di campioni sottili e vetrificati rimane una delle fasi più critiche nella determinazione della struttura macromolecolare mediante crio-EM. I campioni biologici sono spesso dinamici, fragili, soggetti a denaturazione e talvolta sono disponibili solo in piccole quantità per gli studi crio-EM. Durante il processo di blotting, queste particelle interagiscono con l'interfaccia idrofobica aria-acqua, il che può portare a orientamenti preferiti dalle particelle, disassemblaggio di complessi fragili, denaturazione parziale o completa del campione e aggregazione 2,3,4. L'uso di detergenti o altri tensioattivi, la reticolazione chimica e l'adsorbimento dei campioni per sostenere gli strati sono strategie comuni per preservare i campioni biologici durante il processo di congelamento. Gli strati di supporto come l'ossido di grafene 5,6,7 o il carbonio amorfo8 funzionano anche per concentrare le particelle sulla griglia per adsorbimento quando il campione è disponibile in quantità limitate. Tuttavia, questi metodi non sono generali o affidabili e l'ottimizzazione della preparazione della rete può richiedere molto tempo o fallire del tutto.
Le griglie di affinità della streptavidina 9,10 sono state sviluppate per superare queste carenze e per fornire un metodo blando e generalmente applicabile per sequestrare il complesso di interesse e proteggerlo dall'interfaccia aria-acqua. Queste griglie utilizzano un reticolo cristallino di streptavidina bidimensionale (2D) coltivato su un monostrato di lipidi biotinilati sulla griglia. Dopo che i campioni sono stati a loro volta biotinilati (spesso in modo sparso e casuale, il che significa in media una biotina per complesso), possono essere applicati alla griglia rivestita di streptavidina. Poiché l'adsorbimento del campione si basa sull'affinità estremamente elevata tra streptavidina e biotina, con queste griglie è possibile utilizzare concentrazioni di campione fino a 10 nM. I kit di biotinilazione disponibili in commercio per le proteine e i primer biotinilati per i complessi contenenti DNA rendono relativamente facile attaccare le parti di biotina necessarie alla maggior parte dei campioni di interesse. Oltre a concentrare il campione e tenerlo lontano dalla dannosa interfaccia aria-acqua durante il blotting, la biotinilazione casuale di uno o pochi residui di lisina può migliorare significativamente la gamma di orientamenti della molecola di interesse sulla griglia crio-EM, come dimostrato in una serie di studi11. Mentre il segnale proveniente dal cristallo di streptavidina sottostante è presente nelle immagini grezze, gli schemi di elaborazione dei dati che coinvolgono la filtrazione di Fourier delle nitide riflessioni di Bragg dal cristallo possono essere facilmente rimossi durante l'elaborazione iniziale dei dati, consentendo in ultima analisi ricostruzioni ad alta risoluzione del campione di interesse 11,12,13. In questo caso, viene fornito un protocollo ottimizzato e passo-passo per la produzione robusta di griglie di affinità streptavidina e il successivo utilizzo in esperimenti crio-EM. Il protocollo fornito dovrebbe essere completato in un periodo di 2 settimane (Figura 1A). Le prime parti del protocollo descrivono la preparazione dei reagenti, il pretrattamento delle griglie e le prime fasi di evaporazione del carbonio. Successivamente, vengono descritte le istruzioni per la preparazione del monostrato lipidico e la crescita dei cristalli di streptavidina sulle griglie EM. Inoltre, vengono fornite istruzioni per l'uso delle griglie di affinità della streptavidina negli esperimenti EM e crio-EM con colorazione negativa. Infine, vengono fornite procedure per rimuovere il segnale della streptavidina dalle micrografie una volta acquisiti i dati crio-EM.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(biotinil) sale sodico</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285P</td><td>Viene fornito in polvere. Sciogliere alla concentrazione di 1&ndash; 10 mg/mL in solvente cloroformio/metanolo/acqua, 65:35:8 v/v e conservare in aliquote monouso a -80 gradi; C</td></tr><tr><td>200 prova etanolo puro</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu; L Siringa di Hamilton&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>5 &; Siringa da microlitro L modello 75 RN, ago piccolo rimovibile, 26 G, 2 pollici, stile a punta 2</td></tr><tr><td>Olio di ricino</td><td>Sigma Adrich</td><td>259853</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari non trattate (35 mm)</td><td>Cloroformio</td><td>SP22146</td><td></td>Bio</tr><tr><td>basico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-trealosio diidrato, da amido, &ge; 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>DUMONT Pinzette anticapillari inverse (a chiusura automatica) Grado biologico</td><td>Ted Pella</td><td>510-5NM</td><td></td></tr><tr><td>Grado HPLC Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM ACE600 Rivestimento per polverizzazione catodica ad alto vuoto</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM GP2 Congelatore a immersione automatico</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R 2/1 Au300&nbsp;</td><td>Quantifoil</td><td>Q84994</td><td></td></tr><tr><td>Steptavidin</td><td>New England Bioscience</td><td>N7021S</td><td>Viene fornito in soluzione da 1 mg/mL. Diluire alla concentrazione finale di 0,5 mg/mL in tampone di cristallizzazione con una concentrazione finale di trealosio del 10%. Può essere congelato in 25&ndash; 50 &mu; L aliquote</td></tr><tr><td>di talco in polvere&nbsp;</td><td>Carolina</td><td>896060</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grado 1 carta da filtro</td><td>Cytiva</td><td>1001-085</td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione di griglia di affinità streptavidina per la preparazione di campioni di microscopia crioelettronica

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Le griglie di affinità della streptavidina forniscono strategie per superare molte sfide comunemente incontrate nella preparazione dei campioni di microscopia crioelettronica (cryo-EM), tra cui la denaturazione del campione e gli orientamenti preferenziali che possono verificarsi a causa dell'interfaccia aria-acqua. Le griglie di affinità della streptavidina, tuttavia, sono attualmente utilizzate da pochi laboratori crio-EM perché non sono disponibili in commercio e richiedono un attento processo di fabbricazione. I cristalli bidimensionali di streptavidina vengono coltivati su un monostrato lipidico biotinilato che viene applicato direttamente alle griglie crio-EM standard a carbone forato. L'interazione ad alta affinità tra streptavidina e biotina consente il successivo legame di campioni biotinilati che sono protetti dall'interfaccia aria-acqua durante la preparazione del campione crio-EM. Inoltre, queste griglie forniscono una strategia per concentrare i campioni disponibili in quantità limitate e purificare i complessi proteici di interesse direttamente sulle griglie. Qui, viene fornito un protocollo ottimizzato passo dopo passo per la robusta fabbricazione di griglie di affinità per la streptavidina da utilizzare in esperimenti crio-EM e di colorazione negativa. Inoltre, è inclusa una guida alla risoluzione dei problemi per le sfide comunemente riscontrate per rendere l'uso delle griglie di affinità della streptavidina più accessibile alla più ampia comunità crio-EM.

Dopo l'evaporazione del carbonio nella fase 3.21 (di solito dopo una settimana), le griglie di affinità della streptavidina possono essere utilizzate per la preparazione di campioni crio-EM o di colorazione negativa seguendo le procedure descritte nelle fasi 4 e 5. Una micrografia rappresentativa catturata utilizzando un rivelatore K3 su un titano Krios a 81.000X di ingrandimento con una dimensione dei pixel di 1,05 Å di un campione biotinilato congelato con griglie di affinità streptavidina è mostrata nella Figura 4A. La corretta formazione del reticolo è osservata dal motivo a griglia continua che appare sullo sfondo dell'immagine. Questo può essere osservato più facilmente dal modello di diffrazione che appare nella trasformata di Fourier veloce (FFT) mostrata nella Figura 4A (a destra). Dopo la raccolta dei dati, seguendo la procedura descritta nella fase 6 di questo protocollo, il segnale che viene fornito all'immagine dal reticolo della streptavidina può essere mascherato computazionalmente per produrre una micrografia sottratta (Figura 4B) che può essere utilizzata per le successive fasi di elaborazione dei dati. La FFT nella Figura 4B (a destra) mostra che il modello di diffrazione osservato nella Figura 4A (a destra) è stato rimosso con successo dall'immagine originale.
La Figura 4C mostra un esempio di micrografia eseguita su un microscopio Tecnai 12 ad un ingrandimento di 49.000x con una dimensione dei pixel di 1,6 Å di un campione biotinilato legato a griglie di affinità streptavidina e colorato negativamente utilizzando formiato di uranile. Le griglie sono state preparate seguendo la procedura descritta nella fase 4 di questo protocollo, lasciando una pellicola di macchia più spessa.
Ci sono diverse osservazioni comuni quando la procedura di fabbricazione della griglia della streptavidina non ha successo che sono descritte ulteriormente nella sezione di discussione e nella Tabella 1. Figura 5 mostra diversi esempi di queste osservazioni. La Figura 5A mostra una micrografia di una griglia di affinità della streptavidina colorata negativamente utilizzata da un lotto prodotto con più di sei mesi di vita. Il monostrato si è mobilitato dai fori nella lamina di carbonio delle griglie quantifoil e si osserva con dimensioni simili ai fori nella griglia. La Figura 5B mostra un esempio di cristalli di streptavidina che hanno un'elevata mosaicità e che vengono facilmente perturbati durante le procedure di preparazione del campione. La Figura 5C mostra una micrografia rappresentativa di una griglia di affinità della streptavidina in cui l'evaporazione del carbonio nella fase 3.21 è troppo sottile o omessa. Il reticolo della streptavidina si è frammentato durante il processo di preparazione del campione crio-EM. La Figura 5D mostra una griglia di affinità della streptavidina colorata negativamente che presenta una contaminazione da vescicole lipidiche, probabilmente a causa di lavaggi insufficienti durante la fase 3.13 o del lato oro della griglia che si bagna durante le fasi 3.13-3.20. Si prega di fare riferimento alla sezione di discussione e alla Tabella 1 per le strategie per superare questi problemi comuni.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg"> Figura 1: Schema della procedura di fabbricazione della griglia di affinità della streptavidina. (A) Cronologia generale della procedura di fabbricazione della griglia di affinità della streptavidina. L'intera procedura può essere completata nell'arco di due settimane, richiedendo due fasi di evaporazione del carbonio e una settimana dopo ciascuna per consentire al carbonio di invecchiare a sufficienza. (B) Ingrandito in vista di un quadrato della griglia di una griglia di affinità streptavidina che mostra gli strati che compongono la griglia dopo il completamento del processo di fabbricazione, tra cui la griglia crio-EM standard con barre d'oro e pellicola di carbonio forata, il primo strato di carbonio evaporato, il monostrato lipidico, il cristallo di streptavidina 2D e lo strato di supporto di carbonio evaporato sul retro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg"> Figura 2: Cristallizzazione del monostrato lipidico e della streptavidina (A) Immagini che dimostrano come formare con successo il monostrato lipidico all'interno della piccola capsula di Petri utilizzando il borotalco per creare un confine per l'olio di ricino che crea una pressione superficiale costante durante la formazione del monostrato lipidico. (B) Immagini che dimostrano come far crescere cristalli di streptavidina su griglie crio-EM. Innanzitutto, il lato carbonio delle griglie viene toccato con il monostrato lipidico e seguito da tre lavaggi consecutivi nel tampone di cristallizzazione. Viene aggiunta la streptavidina e le griglie vengono incubate in una camera di umidità per 2 ore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg"> Figura 3: Parametri di esempio per il file process_subtraction.cfg per l'esecuzione della sottrazione reticolare di streptavidina da micrografie (passaggio 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg"> Figura 4: Risultati rappresentativi della fabbricazione di una griglia di affinità streptavidina di successo. (A) Micrografia crio-EM di complessi proteina/nucleosoma biotinilati preparati con griglie di affinità streptavidina fatte in casa. La FFT è mostrata a destra e mostra il modello di diffrazione dei cristalli di streptavidina. (B) La stessa micrografia del pannello A è mostrata seguendo la procedura di sottrazione reticolare per rimuovere il segnale dal cristallo di streptavidina 2D dall'immagine originale. (C) Un esempio di micrografia ottenuta dalla colorazione negativa di un campione biotinilato legato a griglie di affinità streptavidina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg"> Figura 5: Risultati rappresentativi della fabbricazione di reti di affinità streptavidina non riuscite. (A) Micrografia che mostra la mobilizzazione del monostrato di streptavidina dai fori della griglia quando le griglie sono più vecchie di sei mesi. (B) Micrografia che mostra reticoli di streptavidina con elevata mosaicità che vengono facilmente danneggiati durante le procedure di preparazione del campione sia crio-EM che con colorazione negativa. (C) Micrografia che mostra la frammentazione del reticolo di streptavidina durante la preparazione del campione crio-EM quando lo strato di evaporazione del carbonio nella fase 3.21 è troppo sottile o omesso. (D) Micrografia rappresentativa contaminata da vescicole lipidiche, probabilmente a causa di un lavaggio insufficiente durante la fase 3.13 o dell'umidità del lato oro della griglia durante le fasi 3.13-3.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Guida alla risoluzione dei problemi per superare le sfide comunemente riscontrate durante la fabbricazione non riuscita della griglia di affinità streptavidina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
File di codifica supplementare 1: lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 2: process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 3: process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 4: bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 5: bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 7: bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 8: ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 9: WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 10: WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Viene fornito un protocollo passo-passo per la fabbricazione di griglie di affinità per streptavidina da utilizzare in studi strutturali di campioni macromolecolari impegnativi mediante microscopia crioelettronica.

Fabbricazione di griglia di affinità streptavidina per la preparazione di campioni di microscopia crioelettronica

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

Ci sono stati molti recenti progressi tecnologici nella crio-EM, compresi i progressi nell'hardware del microscopio stesso che migliorano la qualità complessiva delle immagini, e anche gli sviluppi nel software utilizzato per elaborare le immagini crio-EM che possono iniziare a gestire le grandi quantità di eterogeneità presenti in molti dei campioni. La preparazione del campione rimane uno dei maggiori colli di bottiglia nella crio-EM. La quantità di campione può essere limitante e le proteine tendono ad assorbire l'interfaccia idrofobica aria-acqua durante la vetrificazione.Ciò può portare alla denaturazione del campione, alla rottura di complessi proteici più grandi e agli orientamenti preferiti delle particelle presenti nelle immagini crio-EM. Queste griglie sfruttano l'interazione ad alta affinità tra streptavidina e biotina per legare i campioni biotinilati e proteggerli dall'interfaccia idrofobica aria-acqua. Siamo in grado di lavorare con quantità di campione molto basse e la biotina casuale dei campioni offre una strategia per superare i problemi di orientamento preferenziale che possono essere osservati quando si utilizzano altri strati di supporto.

streptavidin-affinity-grid-fabrication-for-cryo-electron-microscopy

Research

Ricerca

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Biochimica

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Impara a fabbricare griglie di affinità streptavidina per la microscopia crioelettronica. Questo protocollo stabilizza campioni biotinilati, riduce la denaturazione proteica e risolve i problemi di orientamento preferenziale nelle immagini.

Fabbricazione di griglia di affinità streptavidina per la preparazione di campioni di microscopia crioelettronica

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