Name: Generazione di retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Scopri una tecnica ottimizzata per generare retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo riduce l'adesione e la fusione degli organoidi, migliorando l'efficienza e la ripetibilità per lo screening farmacologico.

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Questo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico Istituzionale dell'Ospedale Generale Cinese del PLA. La linea ESC WA09 (H9) è stata ottenuta dall'Istituto di Ricerca WiCell.
1. Terreni di coltura e preparazione dei reagenti
<ol><li>Terreno di coltura ESC umano e soluzione di passaggio<ol><li>Terreno di mantenimento (MM): Preparare 500 mL di MM completo (terreno basale + supplemento 5x; vedere la tabella dei materiali) in modo asettico. Scongelare 5 volte l'integratore a temperatura ambiente (RT) o per una notte a 2-8 °C. Mescolare bene prima dell'uso fino a quando l'integratore non è privo di torbidità.</li>
		<li>Matrice extracellulare (ECM) all'1%: utilizzare un puntale per pipette pre-raffreddato e provette sterili per erogare 200 μL di ECM (vedere la tabella dei materiali) per provetta su ghiaccio. Conservare le provette in un congelatore a -20 °C. Sciogliere l'ECM su ghiaccio e diluire con DMEM/F12 preraffreddato a 1:100.</li>
		<li>0,5 mM pH = 8,0 EDTA: Per preparare 500 mL di EDTA 0,5 mM, aggiungere 500 μL di EDTA 0,5 M e 0,9 g di NaCl a 500 mL di 1x soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) (vedi Tabella dei materiali). Mescolare accuratamente e conservare a 2-8 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Mezzo di differenziazione retinica<ol><li>Terreno chimicamente definito privo di fattore di crescita (gfCDM): preparare il gfCDM combinando il 45% di GlutaMAX di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM-GlutaMAX), il 45% di F12-GlutaMAX di prosciutto (F12-Glutamax), il 10% di sostituzione del siero knockout (KSR), l'1% di concentrato lipidico di colesterolo e 450 μM di tioglicerolo (vedere la tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
	<li>Composti di piccole molecole<ol><li>Y-27632 2HCl: Aggiungere 50 mg di polvere di Y-27632 a 3,122 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Erogare e conservare Y-27632 (vedere la tabella dei materiali) ad una concentrazione di 50 mM a -80 °C per 2 anni, al riparo dalla luce. Diluire lo stock 2.500 volte (20 μM) per l'uso, equivalente a 0,4 μL di Y-27632 per mL di gfCDM.</li>
		<li>IWR1-endo: Aggiungere 2,4424 mL di DMSO per sciogliere 10 mg di IWR1-endo (vedere la tabella dei materiali) per ottenere una soluzione madre di 10 mM. Dosare le aliquote e conservarle a -80 °C per un massimo di 2 anni. Aggiungere 0,3 μL di 10 mM IWR1-endo per mL di gfCDM per la concentrazione di 3 μM per induzione.</li>
		<li>SB431542: Per preparare 50 mM SB431542, aggiungere 10 mg di SB431542 (vedi Tabella dei materiali) a 0,5203 mL di DMSO e mescolare accuratamente. Conservare a -80 °C in solvente per un massimo di 2 anni. Per la preparazione di SB431542 a una concentrazione di lavoro di 10 μM, aggiungere 2 μL della soluzione madre 50 mM a 10 mL di gfCDM.</li>
		<li>LDN-193189 2HCl: Sciogliere 5 mg di LDN-193189 2HCl (vedere la tabella dei materiali) in 10,4297 mL di DMSO per ottenere 1 mM di soluzione madre. Conservare a -20 °C o -80 °C (come raccomandato dal produttore). Aggiungere 0,1 μL di materiale ogni 10 mL di gfCDM, ottenendo 100 nM di LDN-193189 per l'induzione.</li>
		<li>Proteina morfogenetica 4 dell'osso umano ricombinante (BMP4): ricostituita a 50-200 μg/mL in HCl 4 mM (vedi Tabella dei materiali). Conservare a 2 °C a 8 °C per 1 mese o a -20 °C per 1 anno dopo la ricostituzione. Eseguire l'induzione di NR utilizzando 1,5 nM BMP4.</li>
	</ol></li>
	<li>Terreno di coltura NR a lungo termine<ol><li>Acido retinoico (RA): Misurare 6 mg di polvere di RA (vedere la tabella dei materiali) e aggiungere a 3,9941 mL di DMSO. Conservare in aliquote di 5 mM a −80 °C e consumare entro 3 mesi. Per ottenere una concentrazione di lavoro di 0,5 μM, aggiungere 10 μL della miscela principale a 100 mL di mezzo di differenziazione della retina neurale (NRDM). Aggiungere poco prima dell'uso. NOTA: Tenere al riparo dalla luce durante la preparazione e la conservazione.</li>
		<li>Taurina: aggiungere la polvere di taurina (vedi Tabella dei materiali) del peso di 200 mg a 7,9904 mL di DMSO per ottenere una soluzione madre di 200 mM. Erogare e conservare a 2-8 °C. Una concentrazione di lavoro di 0,1 mM di taurina si ottiene aggiungendo 50 μL della soluzione madre per 100 mL di NRDM.</li>
		<li>NRDM: Comporre NRDM con DMEM/F12-GlutaMAX medium, integratore di N2 all'1%, siero bovino fetale al 10%, AR 0,5 mM e taurina 0,1 mM (vedere la tabella dei materiali). Conservare a 2-8 °C per un massimo di 2 settimane o 6 mesi a -20 °C per garantire l'attività dei componenti.</li>
	</ol></li>
	<li>Tampone bloccante: Diluire 1:9 con DPBS per ottenere una soluzione di lavoro al 10% per l'uso (vedi Tabella dei Materiali). Conservare a -20 °C per un massimo di 5 anni. NOTA: Eseguire tutte le altre procedure in una cabina di biosicurezza di Classe II per garantire la sterilità, ad eccezione della pesatura. Se è necessaria l'aggiunta di reagenti pesati durante il processo di preparazione, utilizzare filtri da 0,22 μm per la filtrazione.</li>
</ol>2. Coltura di H9-ESC
<ol><li>Scongelamento degli H9-ESC<ol><li>Aggiungere 1 mL di ECM all'1% a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare per 1 ora in incubatrice a 37 °C in atmosfera con il 5% di CO2 . NOTA: Evitare l'aggiunta di ECM lungo le pareti del pozzetto, perché potrebbe attaccarsi alla superficie.</li>
		<li>Prelevare un materiale crioviale H9-ESC dal serbatoio di azoto liquido e agitarlo rapidamente in acqua a 37 °C per 30 s. NOTA: Non lasciare che il flaconcino si scongeli completamente.</li>
		<li>Rimuovere il flaconcino e sterilizzarlo accuratamente con alcol spray disinfettante al 75%. Aggiungere l'H9-ESC scongelato dal crioviale a una provetta da 15 mL contenente 9 mL MM con 10 μM Y-27632.</li>
		<li>Centrifugare la provetta a 190 × g per 5 minuti a RT. Rimuovere con cautela la maggior parte del surnatante con una pipetta da 1 mL, lasciando circa 50 μL di surnatante per evitare la perdita di cellule.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di MM contenente 10 μM di Y27632 al sedimento cellulare e risospendere delicatamente il sedimento cellulare con una pipetta da 1 mL pipettando su e giù 5-10 volte.</li>
		<li>Rimuovere il rivestimento ECM dopo 1 ora di incubazione. Aggiungere 2 mL di MM preriscaldato contenente 10 μM Y-27632 a ciascun pozzetto.</li>
		<li>Erogare 0,5 mL di sospensione cellulare per pozzetto. Agitare delicatamente la piastra lateralmente per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.</li>
		<li>Incubare la piastra a 37 °C con il 5% di CO2 per almeno 24 ore senza toccarla.</li>
		<li>Cambiare il mezzo ogni giorno. Quando la densità del clone raggiunge il 70% e oltre, è necessario il passaggio.</li>
	</ol></li>
	<li>Passaggio di H9-ESC<ol><li>Preparare la piastra rivestita con ECM come descritto sopra (passaggio 2.1.1) e aggiungere 2 mL di MM per pozzetto.</li>
		<li>Rimuovere il terreno esausto dalle piastre a 6 pozzetti. Lavare ogni pozzetto due volte con 1 ml di DPBS.</li>
		<li>Lavare ogni pozzetto due volte aggiungendo lentamente 1 mL di EDTA e incubando con 1 mL di EDTA per 4-7 minuti a RT. NOTA: Durante l'incubazione, esaminare la piastra a 6 pozzetti per 3 minuti al microscopio. Procedere immediatamente al passaggio successivo se la maggior parte delle cellule sta per staccarsi dalla capanna. Evitare l'incubazione prolungata per ridurre l'impatto negativo sulle cellule.</li>
		<li>Eliminare l'EDTA e aggiungere 1 mL di MM per interrompere la digestione.</li>
		<li>Picchiettare delicatamente la piastra del pozzetto fino a quando la maggior parte delle cellule non si è staccata.</li>
		<li>Trasferire con cautela la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL con una pipetta da 5 mL. Risospendere delicatamente le colonie H9-ESC su e giù per 3-5 volte per mescolarle con una pitetta di Pasteur. Trasferire 20-100 μL di sospensione cellulare in una nuova piastra di coltura a 6 pozzetti rivestita con ECM e agitarla avanti e indietro.</li>
		<li>Quando la densità cellulare è rilevata come sufficiente al microscopio, incubare la piastra a 37 °C con il 5% di CO2 per almeno 24 ore senza toccarla.</li>
		<li>Cambia il supporto ogni giorno. Al 70% di densità del clone e oltre, è necessario il passaggio.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Generazione di NR umani
NOTA: Una volta che le colonie raggiungono circa il 70% di confluenza, possono essere indirizzate verso la differenziazione in organoidi retinici (RO) utilizzando i passaggi procedurali descritti nella Figura 1.
<ol><li>Giorno 0 - Formazione del corpo embrioide (EB)<ol><li>Dopo aver lavato le cellule con 2 mL di DPBS, aggiungere 0,5 mL di CDS (vedere la tabella dei materiali) contenente 20 μM Y27632 al pozzetto. Incubare per 3 minuti a 37 °C in incubatore umidificato al 5% di CO2 . NOTA: Controllare al microscopio. Ridurre il più possibile il tempo di incubazione per evitare effetti dannosi sulle cellule.</li>
		<li>Interrompere la digestione aggiungendo 3 mL di MM contenente 20 μM Y27632. Centrifugare a 190 × g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di gfCDM contenente 20 μM Y27632 e contare le cellule. Aggiungere il volume corrispondente per 1,2 × 106 cellule (1,2 × 104 cellule per pozzetto) a 10 mL di gfCDM, che è pre-incorporato con 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 e 100 nM LDN-193189 (vedere la tabella dei materiali).</li>
		<li>Aggiungere 100 μL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di pozzetti conici con fondo a 96 V. Mettere la piastra in un'incubatrice umidificata al 5% di CO2 fino al giorno 6. NOTA: Non spostare le stoviglie per almeno 24 ore per migliorare l'aderenza degli EB.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 6 - Induzione della retina<ol><li>Il giorno 6, aggiungere 10 mL di gfCDM contenente 55 ng/mL di BMP4 per consentire un cambio completo del terreno di coltura sugli EB. Rimettere la piastra nell'incubatrice. NOTA: Pipettare verso le pareti del pozzetto conico con fondo a 96 V per evitare bolle d'aria. Evitare di prendere organoidi quando si cambia il terreno.</li>
		<li>Effettuare il cambio semi-medio il giorno 9, il giorno 12 e il giorno 15. Sostituire metà del terreno con gfCDM fresco per diluire gradualmente il BMP4.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 18 - Cultura NR a lungo termine<ol><li>Il giorno 18, trasferire con cura gli EB formati in provette da centrifuga da 15 mL utilizzando pipette Pasteur da 5 mL e risciacquare delicatamente con NRDM. Trasferire gli EB su piastre a 6 o 24 pozzetti a basso adsorbimento (vedere la tabella dei materiali). Rimettere la piastra nell'incubatrice.</li>
		<li>Sostituire il terreno con NRDM fresco ogni 3 giorni. NOTA: Spegnere la luce durante il cambio del fluido perché l'AR è sensibile alla luce. Rimuovere gli organoidi mal differenziati e separare gli organoidi aderenti al microscopio.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Analisi delle NR umane
<ol><li>Montaggio degli RO<ol><li>Selezionare diverse generazioni di H9-ESC per indurre tre lotti di RO. NOTA: Per valutare il tasso di successo dell'induzione, vengono calcolate tre piastre del numero di NR di formatura per ciascuno dei tre metodi valutati (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 e il metodo modificato nel presente studio). L'induzione è considerata efficace se la microscopia ottica rivela la formazione di strutture simili a quelle neuroepiteliali al giorno 30.</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione immunofluorescente di RO<ol><li>Trasferire 3-5 RO in provette da 1,5 mL. Pipettare il terreno in eccesso e lavare gli RO una volta con 1 mL di DPBS a RT. Lasciare che gli RO affondino e rimuovere con cautela i DPBS. Aggiungere 1 mL di paraformaldeide al 4% (vedere la tabella dei materiali) per provetta da 1,5 mL e fissare a 4 °C. NOTA: RO il giorno 6 e il giorno 18, fissare 2 ore. Fissare per 12 ore il giorno 30 e 14 ore il giorno 60.</li>
		<li>Dopo la fissazione, disidratare con alcool a gradiente. Lasciare riposare gli RO per 15 minuti ciascuno con alcol al 50%, 60% e 70% e successivamente per 10 minuti ciascuno con alcol all'80%, 90%, 95%, 100% e 100%. Quindi, aggiungere una miscela 1:1 di alcol al 100% e xilene per 10 minuti, seguita da xilene due volte per 10 minuti ciascuna.</li>
		<li>Posizionare gli RO in stampi metallici riempiti di paraplasto fuso (vedi Tabella dei materiali) per 40 minuti, quindi spegnere gli stampi su ghiaccio per fissare gli RO. Posizionare le scatole da incasso negli stampi e congelarle a -20 °C per una notte. Successivamente, staccare con cautela le scatole da incasso. Infine, conservali presso RT.</li>
		<li>Creare sezioni continue (spessore 5 μm) con un'affettatrice per paraffina. Fissare le fette sui vetrini del microscopio di adesione, asciugarle e conservarle a RT.</li>
		<li>Eseguire la deceratura e la reidratazione prima della riparazione dell'antigene12,27.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di soluzione per il recupero dell'antigene citrato 20x pH 6,0 (vedere la tabella dei materiali) a 190 mL di ddH2O (H2O a doppia distillazione). Scaldare nel microonde in modalità alta per 4 minuti fino all'ebollizione. Dopo aver aggiunto le sezioni di paraffina, riscaldare le sezioni in modalità bassa per 20 minuti per completare la riparazione dell'antigene.</li>
		<li>Lasciare raffreddare naturalmente le sezioni di paraffina in un'area ventilata e poi metterle in una camera umida.</li>
		<li>Usa un pap pen (vedi Tabella dei materiali) per delineare le sezioni. Incubare con Triton X-100 allo 0,2% a RT per 30 minuti per rompere le membrane, quindi lavare i vetrini tre volte con TPBS, per 5 minuti ciascuno.</li>
		<li>Bloccare con siero d'asina al 10% diluito in DPBS a RT per 1 ora in camera umida con 10 μL per area di colorazione.</li>
		<li>Aggiungere gli anticorpi primari diluiti in siero d'asina al 10%. Incubare per una notte a 4 °C in camera umida. Lavare i campioni tre volte con TPBS per 10 minuti ciascuno per rimuovere l'anticorpo non legato. NOTA: Gli anticorpi primari sono i seguenti: anti-PAX6 (1: 250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulina III (1: 250) e anti-NESTIN (1: 200) (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Incubare con anticorpi secondari diluiti in DPBS per 1 ora a RT in camera umidificata. Ripetere la fase di lavaggio con TPBS tre volte per 10 minuti ciascuna. NOTA: Tenere al buio per evitare l'estinzione dell'anticorpo secondario fluorescente. Gli anticorpi secondari sono Alexa Fluor 488 coniugato con IgG anti-topo asino e Alexa Fluor 568 coniugato con IgG anti-coniglio asino ad una diluizione di 1:400 (vedi Tabella dei materiali).</li>
		<li>Incubare con DPBS contenente DAPI (1: 500; vedere la tabella dei materiali) per 10 minuti a RT al buio. Lavare tre volte con TPBS per 10 minuti ciascuna.</li>
		<li>Far cadere una quantità adeguata di sigillante antifluorescente (vedere la tabella dei materiali) sul vetrino e coprire con i vetrini di copertura.</li>
		<li>Visualizzare utilizzando un analizzatore quantitativo di cellule tissutali a flusso (vedere la tabella dei materiali) o simile.</li>
		<li>Conservare i vetrini a -20 °C al buio dopo l'analisi microscopica.</li>
	</ol></li>
</ol>

Differenziazione avanzata della retina neurale 3D dalle cellule staminali embrionali umane

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<li>Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurological+disorders+in+3D+organoids+using+human-derived+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 640212(2021).</li>
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<li>Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+cultivation%2C+differentiation%2C+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation.</a> Front Cell Neurosci. 15, 638439(2021).</li>
<li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Yamasaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+Chk1+inhibitor+and+BMP4+cooperatively+promotes+retinal+tissue+formation+in+self-organizing+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture.</a> Regen Ther. 19, 24-34 (2022).</li>
<li>Döpper, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+protocol+for+3D+Retinal+organoids%2C+immunostaining+and+signal+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120(2020).</li>
<li>Norrie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+from+human+stem+cell-derived+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids.</a> Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).</li>
</ol>

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Gli RO umani possono ricapitolare spazialmente e temporalmente lo sviluppo della retina fetale e i RO precoci mostrano un alto grado di somiglianza con la retina fetale a stadi equivalenti di sviluppo15. In termini di morfologia tissutale ed espressione molecolare, l'RO umana rispecchia da vicino l'effettivo stato di crescita del tessuto retinico, offrendo opportunità straordinarie e senza precedenti nei campi della modellazione delle malattie, dello screening dei farmaci e della medicina rigenera...

L'occhio funge da fonte primaria di informazioni tra gli organi sensoriali umani, con la retina che è il principale tessuto sensoriale visivo negli occhi dei mammiferi1. La retinopatia è una delle principali cause globali di malattie oculari, che porta alla cecità2. Circa 2,85 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di vari gradi di disabilità visiva a causa della retinopatia3. Di conseguenza, indagare la sua patogenesi è fondamentale per una diagnosi precoce e un trattamento tempestivo. La maggior parte degli studi sulla retinopatia umana si è concentrata principalmente su modelli animali 4,5,6. Tuttavia, la retina umana è un tessuto complesso e multistrato che comprende vari tipi di cellule. I tradizionali sistemi di coltura cellulare bidimensionale (2D) e i sistemi di modelli animali in genere non riescono a ricapitolare fedelmente il normale sviluppo spazio-temporale e il metabolismo farmacologico della retina umana nativa 7,8.
Recentemente, le tecniche di coltura 3D si sono evolute per generare organi simili ai tessuti da cellule staminali pluripotenti (PSCs)9,10. Gli organoidi retinici (RO) generati da PSC umane in un sistema di coltura in sospensione 3D non solo contengono sette tipi di cellule retiniche, ma mostrano anche una struttura stratificata distinta simile alla retina umana in vivo 11,12,13. Gli RO umani derivati da PSC hanno guadagnato popolarità e ampia disponibilità e sono attualmente i migliori modelli in vitro per lo studio dello sviluppo e della malattia della retina umana14,15. Negli ultimi decenni, numerosi ricercatori hanno dimostrato che le PSC umane, comprese le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), possono differenziarsi in RO utilizzando vari protocolli di induzione. Questi progressi hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening farmacologico e le terapie basate sulle cellule staminali 16,17,18.
Tuttavia, la generazione di retina neurale (NR) da cellule staminali pluripotenti umane (PSC) è un processo complesso, ingombrante e dispendioso in termini di tempo. Inoltre, le variazioni da lotto a lotto negli organoidi tissutali possono portare a una minore riproducibilità dei risultati19,20. Numerosi fattori intrinseci ed estrinseci possono influenzare la resa degli organoidi retinici (RO), come il numero o la specie di cellule di partenza e l'uso di fattori di trascrizione e composti a piccole molecole 21,22,23. Da quando il primo RO umano è stato generato dal laboratorio Sasai11, nel corso degli anni sono state proposte molteplici modifiche per migliorare la facilità e l'efficacia del processo di induzione 13,21,24,25. Purtroppo, ad oggi, non è stato stabilito alcun protocollo gold standard per la generazione di RO in tutti i laboratori. In effetti, c'è un certo grado di discrepanza negli RO risultanti da diversi metodi di induzione, così come un'ampia variazione nell'espressione dei marcatori retinici e nella robustezza della loro struttura22,26. Questi problemi possono complicare gravemente la raccolta dei campioni e l'interpretazione dei risultati dello studio. Pertanto, è necessario un protocollo di differenziamento più consolidato e robusto per massimizzare l'efficienza con una minima eterogeneità di generazione di RO.
Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato basato su una combinazione di Kuwahara et al.12 e Döpper et al.27 con istruzioni dettagliate. Il nuovo metodo riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione degli organoidi, aumentando il tasso di successo della generazione di NR. Questo sviluppo è molto promettente per la modellazione delle malattie, lo screening dei farmaci e le applicazioni di terapia cellulare per i disturbi della retina.

<table><tbody><tr><td>0,01 M TPBS</td><td>Servicebio</td><td>G0002</td><td>Lavaggio fette</td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide</td><td>Servicebio</td><td>G1101-500ML</td><td>Fissare organoidi retinici</td></tr><tr><td>5 mL Pipetta</td><td>Pasteur NEST Biotechnology</td><td>318516</td><td>Pipetta organoidi retinici</td></tr><tr><td>96 pozzetti conici con fondo a V</td><td>Sumitomo Bakelit</td><td>MS-9096VZ</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio ad adesione</td><td>CITOTEST</td><td>188105</td><td>Fette fisse</td></tr><tr><td>AggreWell medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5893</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo medio anidro</td><td>SINOPHARM</td><td>10009218</td><td>Disidratare&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CHX10</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365519</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr>Soluzione<td>antidissolvenza</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9556</td><td></td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Anti-NESTIN</td><td>Sigma</td><td>N5413</td><td>Anticorpo primario Anti-neuronale</td></tr><tr><td>di classe III &beta;-Tubulina (TUJ1)</td> <td>Beyotime</td><td>AT809</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Anti-PAX6</td><td>Abcam</td><td>ab195045</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Soluzione di dissociazione cellulare (CDS)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7922</td><td>Dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td>GSK-3&alfa;/&beta; Concentrato</td></tr> di <tr><td>lipidi per colesterolo</td><td>Gibco</td><td>12531018</td><td>250&volte;</td></tr><tr><td>Soluzione per il recupero dell'antigene citrato</td><td>Servicebio</td><td>G1202-250ML</td><td>20&times;, pH 6.0</td></tr><tr><td>CS10</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001061</td><td>Terreno di congelamento cellulare</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>Controcolorante nucleare</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>Medium</td></tr><tr><td>DMEM/F12-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>Asino medio</td></tr><tr><td>anti-topo Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32766</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA)</td><td>Biosharp</td><td>BL518A</td><td>0,5 M, pH 8,0, dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Matrice extracellulare (ECM)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Piastre di rivestimento</td></tr><tr><td>F12-Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td> medio <td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore quantitativo di cellule tissutali a flusso</td><td>TissueGnostics</td><td>TissueFAXS Plus</td><td>Sezioni di scansione</td></tr><tr><td>IMDM-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31980030</td><td>Medium</td></tr><tr><td>IWR1-endo</td><td>Selleckchem</td><td>S7086</td> Siero knockOut <td>inibitore</td></tr> di <tr><td>Wnt</td><td>Gibco</td><td>di ricambio 10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189 2HCl</td><td>Selleckchem</td><td>S7507</td><td>Inibitore BMP</td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti a bassa adesione</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti a bassa adesione</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di manutenzione (MM)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Integratore di</td></tr><tr><td>N2</td><td>medio Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Solarbio</td><td>SL050</td><td>Tampone bloccante</td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td>Inclusione tissutale</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 basico (1x)</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Senza Ca+,Mg+</td></tr><tr><td>Proteina morfogenetica ossea umana riconbinante-4(rhBMP4)</td><td>R& D</td><td>314-BP</td><td>Fattore proteico chiave</td></tr><tr><td>Acido retinoico</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Polvere, tenere al riparo dalla luce</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td>ALK5-inibitore</td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Selleckchem</td><td>S7667</td><td>Inibitore della tirosin-chinasi</td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9305</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tioglicerolo</td><td>Sigma</td><td>M1753</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Permeabilizzazione</td></tr><tr><td>WA09 linea di cellule staminali embrionali</td><td>WiCell Research Institute</td><td></td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Xilene</td><td>SINOPHARM</td><td>10023418</td><td>Decerazione</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCL</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td>ROCK-inibitore</td></tr></tbody></table>

generazione di retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

La retinopatia è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo. Indagare la sua patogenesi è essenziale per la diagnosi precoce e il trattamento tempestivo della retinopatia. Sfortunatamente, le barriere etiche ostacolano la raccolta di prove da parte degli esseri umani. Recentemente, numerosi studi hanno dimostrato che le cellule staminali pluripotenti umane (PSC) possono essere differenziate in organoidi retinici (RO) utilizzando diversi protocolli di induzione, che hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening dei farmaci e le terapie basate sulle cellule staminali. Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato per generare la retina neurale (NR) che riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione, aumentando il tasso di successo della produzione fino al giorno 60. Basato sulla capacità delle PSC di auto-riorganizzarsi dopo la dissociazione, combinata con alcuni fattori complementari, questo nuovo metodo può guidare in modo specifico la differenziazione delle NR. Inoltre, l'approccio è semplice, conveniente, mostra una notevole ripetibilità ed efficienza, presenta prospettive incoraggianti per modelli personalizzati di malattie retiniche e fornisce un abbondante serbatoio cellulare per applicazioni come la terapia cellulare, lo screening farmacologico e i test di terapia genica.

Una panoramica grafica del protocollo modificato è mostrata nella Figura 1. Le H9-ESC sono state utilizzate per generare RO quando le cellule sono state cresciute fino a una densità del 70%-80%. Sospensioni a cella singola di H9-ESC in 96 pozzetti conici con fondo a V si sono aggregate il giorno 1 e hanno formato EB rotondi ben circoscritti entro il giorno 6. Con l'aumentare del tempo di coltura, il volume degli EB è aumentato gradualmente. Il giorno 30, le strutture simili a neuroepiteliali...

Il presente protocollo descrive un sistema di induzione retinica neurale 3D ottimizzato che riduce l'adesione e la fusione degli organoidi retinici con elevata ripetibilità ed efficienza.

Generazione di retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

Il nostro gruppo si concentra sulla comprensione della patogenesi e del trattamento delle malattie retiniche umane. Il nostro protocollo descrive una tecnica di induzione ottimizzata per generare una retina neurale che riduce significativamente la probabilità di vascolarizzazione e fusione per aumentare il tasso di successo della produzione retinica fino al giorno 60. Il metodo modificato è più semplice ed efficiente nella generazione della retina neurale, che può rivelarsi un modello di malattia migliore per lo screening farmacologico e la terapia cellulare.In futuro, miriamo a studiare gli effetti dei fattori fisico-chimici sullo sviluppo della retina e sul meccanismo sottostante utilizzando il nostro modello di organoide retinico.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Protocolli per la differenziazione neuronale di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono spesso molto tempo e richiedono notevoli capacità di colture cellulari. Qui, abbiamo adattato una piccola molecola procedura basata differenziazione di un formato di piastra multititre, permettendo la generazione semplice, rapido, efficace e di neuroni umani in modo controllato.

Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre

Le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivate da cellule staminali possono essere utilizzate per molteplici applicazioni, tra cui terapie cellulari per la degenerazione retinica, modelli di malattie e studi farmacologici. Qui presentiamo un semplice protocollo per derivare in modo riproducibile l'RPE dalle cellule staminali.

Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

Qui presentiamo un protocollo accettato dalla comunità in formato multimediale per l'iniezione sottoretinica di un bolo di cellule RPE in ratti e topi. Questo approccio può essere utilizzato per determinare i potenziali di salvataggio, i profili di sicurezza e le capacità di sopravvivenza delle cellule RPE trapiantate dopo l'impianto in modelli animali di degenerazione retinica.

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

Questo protocollo descrive come produrre cellule epiteliali del pigmento retinico (RPE) da cellule staminali pluripotenti. Il metodo utilizza una combinazione di fattori di crescita e di piccole molecole per indirizzare la differenziazione delle cellule staminali in RPE immaturi in quattordici giorni e RPE maturo, funzionale dopo tre mesi.

Rapida, regia di differenziazione delle cellule epiteliali del pigmento retinico da cellule staminali pluripotenti umane embrionali o indotto

La produzione di cellule specializzate della retina da cellule staminali pluripotenti è un punto di svolta nello sviluppo della terapia a base di cellule staminali per malattie retiniche. Il presente documento descrive un metodo semplice per una generazione efficiente dei organoids della retina e dell'epitelio pigmentato retinico per la ricerca di base, traslazionale e clinica.

Condizioni di coltura privo di alimentatore per i modelli di cellula retinica iPSC-derivato generazione umana e definito privo di Xeno

Descriviamo un metodo per progettare un tessuto retinico composto di cellule epiteliali del pigmento retinico derivate da cellule staminali pluripotenti umane coltivate in cima membrane amniotiche umane e la sua preparazione per l'innesto in modelli animali.

Ingegneria del tessuto di trapianto-adatto del pigmento retinico epitelio derivato da cellule staminali embrionali umane

Utilizzando un metodo auto-organizzante, sviluppiamo un protocollo con l'aggiunta di COCO che potrebbe aumentare significativamente la generazione di fotorecettori.

Induzione diretta di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti umane

Qui descriviamo un sistema di induzione organoide retinica ottimizzato, adatto a varie linee di cellule staminali pluripotenti umane per generare tessuti retinici con elevata riproducibilità ed efficienza.

Sistema di induzione organoide retinica per la derivazione di tessuti retinici 3D da cellule staminali pluripotenti umane

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per differenziare le hiPSC in cluster di campi oculari e generare organoidi neuro-retinici utilizzando condizioni di coltura semplificate che coinvolgono sia sistemi di coltura aderenti che in sospensione. Altri tipi di cellule oculari, come l'RPE e l'epitelio corneale, possono anche essere isolati dai campi oculari maturi nelle colture retiniche.

Generazione di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo sane e specifiche per malattie retiniche

Scopri una tecnica ottimizzata per generare retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo riduce l'adesione e la fusione degli organoidi, migliorando l'efficienza e la ripetibilità per lo screening farmacologico.

Generazione di retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane

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