Name: Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Scopri la microscopia intravitale a due fotoni per studiare la distribuzione di nanoparticelle fluorescenti nel glioblastoma utilizzando un modello murino. Questa tecnica avanzata permette di ottimizzare le strategie di somministrazione terapeutica attraverso la barriera ematoencefalica.

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Vorremmo ringraziare il servizio di microscopia neuroscientifica di Stanford Wu Tsai, il centro di Stanford per le innovazioni nell'imaging in vivo (SCi3) - centro di imaging per piccoli animali, NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) e Stanford Preclinical Imaging Facility a Porter Drive per aver fornito l'attrezzatura e l'infrastruttura per questo progetto. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Istituto Nazionale per la Salute del Bambino e lo Sviluppo Umano, numero di sovvenzione R01HD103638. Ringraziamo lo Schnitzer Group, l'Università di Stanford; il laboratorio Zuo, Università di Santa Cruz; e il Neurovascular Imaging Laboratory, Boston Photonic Center, Università di Boston, per discussioni educative sull'imaging a due fotoni e sui modelli di finestre craniche.

Tracciamento in tempo reale di nanoparticelle nei tumori cerebrali utilizzando 2P-IVM nei topi

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpupillary+two-photon+in+vivo+imaging+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.</a> J Vis Exp. 168, 61970(2021).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+reveals+the+contribution+of+Sox9%2B+to+kidney+regeneration+in+a+mouse+model+with+extracellular+vesicle+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment.</a> J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).</li>
<li>Jang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+of+Paneth+cells+in+the+small+intestine+of+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice.</a> Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).</li>
<li>Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+allows+imaging+and+characterization+of+cochlear+microvasculature+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo.</a> Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).</li>
<li>Matsuura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+with+two-photon+microscopy+reveals+cellular+dynamics+in+the+ischeamia-reperfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart.</a> Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 17 (1), (2019).</li>
<li>Birkner, A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+imaging+in+vivo+with+a+red-shifted+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator.</a> Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).</li>
<li>Busche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+hippocampal+neurons+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models.</a> Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-photon+probe+to+selectively+detect+monoamine+oxidase+B+activity+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models.</a> Nat Commun. 5, 3276(2014).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Sci Rep. 6, 26381(2016).</li>
<li>Soubéran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+VEGF+blockade+on+the+dynamics+of+the+inflammatory+landscape+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice.</a> J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+vivo+reveals+specific+nanoparticle+target+binding+in+a+syngeneic+glioma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model.</a> Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).</li>
<li>Wartchow, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+cyclic+AMP+activators+reduces+glioblastoma+growth+and+invasion+as+assessed+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy.</a> Cells. 10 (3), 556(2021).</li>
<li>Jiang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+fibrillar+collagen+deposition+associated+with+vascular+elements+in+glioblastoma+multiforme+by+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).</li>
<li>Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+imaging+reveals+distinct+morphology+and+infiltrative+properties+of+glioblastoma-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+human+mesenchymal+stem+cells+with+gold+nanocages+for+in+vitro+and+in+vivo+tracking+by+two-photon+microscopy+and+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy.</a> Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thermal+damage+from+robot-drilled+craniotomy+for+cranial+window+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice.</a> J Vis Exp. 189, 64188(2022).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Sci Rep. 6, 27818(2016).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+access+to+an+estimated+one+million+neurons+in+the+live+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex.</a> Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Kılıç, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Front Physiol. 11, 612678(2021).</li>
<li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium-implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li>
<li>Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+albumin-conjugated+pegylated+nanoparticles+allow+gene+delivery+into+brain+tumors+via+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration.</a> Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-glioblastoma+efficacy+by+PTX-loaded+PEGylated+poly%28%C9%9B-caprolactone%29+nanoparticles%3A+In+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation.</a> Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).</li>
<li>Valable, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+tracking+of+exogenous+monocytes%2Fmacrophages+targeting+brain+tumors+in+a+rat+model+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma.</a> Neuroimage. 40 (2), 972(2008).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototheranostics%3A+Active+targeting+of+orthotopic+glioma+using+biomimetic+proteolipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles.</a> ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).</li>
<li>Asan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+correlates+of+gray+matter+volume+changes+in+magnetic+resonance+morphometry+identified+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 11, 4234(2021).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Presentiamo un metodo per il monitoraggio in tempo reale delle NP in vivo utilizzando 2P-IVM attraverso una finestra cranica per valutare la somministrazione tumorale di NP di ossido di ferro marcate con fluorescenza. La tecnica chirurgica per questa procedura richiede una mano ferma e abilità chirurgiche sperimentali avanzate. Si consiglia di esercitarsi nell'uso di carcasse o fantasmi prima di passare all'esperienza animale dal vivo. In alternativa, Hoeferlin et al. hanno implementato un trapano robotico per ridurre il danno termico, minimizzare la variabilità della tecnica chirurgica e standardizzare la chirurgia22.
La dimensione della finestra rappresenta un altro parametro critico. Una finestra più ampia consentirebbe l'imaging di una porzione più ampia del tumore con 2P-IVM. In letteratura sono state descritte dimensioni comprese tra 3-7 mm23. Tuttavia, finestre più grandi non possono adattarsi alla curvatura del cervello, il che può portare ad un aumento della pressione regionale24. Per ovviare a questa restrizione, si può invece utilizzare un cosiddetto "teschio di vetro"25. Rispetto alle tradizionali finestre in vetro, questo metodo utilizza il vetro curvo, assecondando la curvatura del cervello e consentendo così la creazione di finestre più grandi riducendo la pressione focale sulla corteccia. Questo tipo di vetro curvo non è disponibile in commercio e ha solo applicazioni limitate in 2P-IVM, poiché la superficie curva provoca artefatti di riflessione, limitando l'area della finestra che potrebbe essere ripresa. Un'altra alternativa è una finestra24 a base di silicio. Da un lato, questo metodo offre una maggiore flessibilità per quanto riguarda le dimensioni e la forma della finestra da creare. Inoltre, sono stati riportati risultati comparabili in termini di cedimento delle finestre e tassi di infiammazione rispetto alle classiche finestre in vetro. D'altra parte, è stato dimostrato che la qualità dell'imaging a 2 fotoni nelle finestre a base polimerica diminuisce più velocemente rispetto alle finestre di vetro, rendendola non fattibile per applicazioni a lungo termine26. Una finestra cranica del cranio assottigliata rappresenta un'altra alternativa. Pur essendo meno invasiva della classica finestra di vetro, non consente l'impianto di cellule GBM utilizzando la stessa tecnica qui descritta. Inoltre, è difficile ottenere uno spessore costante del cranio e, di conseguenza, ciò può causare artefatti significativi in 2P-IVM27.
La linea cellulare e la quantità di cellule GBM impiantate sono altre considerazioni importanti quando si pianifica la tempistica dello studio. La linea cellulare di glioma di ratto C6 è una delle linee cellulari più utilizzate nella ricerca sul GBM. Nei ratti e nei topi, sono stati riportati numeri di cellule compresi tra 5 x 104 e 5 x 106 per gli impianti intracranici 27,28,29,30,31. Come regola generale, quando si impianta un numero maggiore di cellule, ci si deve aspettare una crescita tumorale più rapida. In questo protocollo, sono state impiantate 1 x 105 cellule e l'imaging è stato eseguito nei giorni 11 e 12 dopo l'impianto. Xin et al. hanno impiantato 1 x 105 cellule C6 in topi nudi BALB/c e hanno riferito di aver rilevato GBM avanzato nella risonanza magnetica il giorno 7 post-impianto e un aumento della mortalità dopo 15 giorni30. In confronto, Jia et al. hanno utilizzato un numero maggiore di cellule (1 x 106) e lo stesso ceppo di topo e hanno rilevato una piccola massa tumorale al giorno 7 nella risonanza magnetica con una barriera emato-encefalica (BBB) leggermente interrotta, come dimostrato da una pallida macchia blu Evans nel tessuto GBM32. Il giorno 14, la macchia blu di Evans era più forte rispetto al giorno 7, indicando che la BBB era altamente disturbata. A sua volta, la crescita del tumore influisce anche sul tempo in cui gli animali possono essere tenuti nell'esperimento. Questa è un'importante considerazione del benessere degli animali per gli studi di imaging longitudinali. È stato riportato che le finestre craniche croniche sono adatte per l'imaging fino a 6 mesi dopo l'impianto26.
Le nanoparticelle utilizzate in questo protocollo sono costituite da ossido di ferro e componenti fluorofori. Le possibili applicazioni includono lo studio della somministrazione tumorale di nuovi farmaci terapeutici, terapie cellulari e interventi sulla vascolarizzazione tumorale e sul microambiente tumorale. Diversi farmaci candidati e terapie combinate possono essere valutati a livello cellulare e molecolare. La componente di ossido di ferro delle NP consente l'imaging multimodale con risonanza magnetica o imaging di particelle magnetiche oltre a 2P-IVM. Sebbene la risonanza magnetica rappresenti una modalità di imaging clinicamente rilevante, la sua risoluzione anatomica è inferiore a quella della microscopia intravitale33.
Questo metodo presenta anche alcune limitazioni. Le coordinate cerebrali secondo un atlante cerebrale del topo sono standardizzate per i topi C57BL/6J e devono essere regolate a seconda del ceppo, del sesso e dell'età del topo. Inoltre, con l'imaging a due fotoni, è possibile accedere solo a una profondità limitata di circa 450 μm9. Pertanto, solo una caratterizzazione parziale del tumore è possibile con 2P-IVM e le differenze regionali nelle caratteristiche del tumore potrebbero non essere rilevate. Inoltre, sono stati inclusi solo due punti temporali successivi alla somministrazione di NP. Studi futuri, che includano più punti temporali dopo la somministrazione endovenosa, consentiranno un'analisi più dettagliata del comportamento spazio-temporale delle NP nel microambiente tumorale.
Per concludere, abbiamo valutato la somministrazione tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro marcate con fluorescenza utilizzando 2P-IVM in un modello murino di GBM. Questo metodo può essere facilmente modificato per adattarsi a varie aree di ricerca e rappresenta uno strumento importante per l'imaging cerebrale in vivo nel campo delle neuroscienze.

La microscopia intravitale a due fotoni (2P-IVM) è una tecnica di imaging a fluorescenza che consente la visualizzazione di tessuti viventi1.
Sviluppato per la prima volta negli anni '90, 2P-IVM è stato utilizzato per l'analisi in vivo della retina2, del rene3, dell'intestino tenue4, della coclea5, del cuore6, della trachea7 e del cervello in vari modelli preclinici 8,9. Nel campo delle neuroscienze, la 2P-IVM ha acquisito importanza come tecnica per l'imaging in tempo reale del cervello sano in animali svegli10, nonché per lo studio di malattie del sistema nervoso come l'Alzheimer11, il Parkinson12 e il glioblastoma (GBM)13,14,15,16.
2P-IVM offre una soluzione elegante per lo studio del microambiente tumorale durante lo sviluppo del GBM. Mentre alcuni studi precedenti si sono concentrati su modelli in vitro17 ed ex vivo 18, altri hanno implementato modelli ortotopici19 e xenotropi20 in vivo per l'esame del GBM. Madden et al. hanno eseguito l'imaging nativo della linea cellulare di glioma di ratto CNS-1 in un modello murino13. Utilizzando un modello murino ortotopico GL261-DsRed, Ricard et al. hanno eseguito una somministrazione endovenosa di un fluoroforo per migliorare i vasi sanguigni nella regione tumorale in 2P-IVM14.
Qui, applichiamo 2P-IVM per monitorare la consegna tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro (NP) marcate con fluorescenza in un modello murino ortotopico di GBM. Utilizzando una finestra cranica, questo metodo ci permette di studiare in dettaglio la distribuzione spazio-temporale in tempo reale delle NP nel cervello.

<table><tbody><tr><td>soluzione per infusione di cloruro di sodio allo 0,9%</td><td>Baxter Corp</td><td>533-JB1301P</td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>siringhe da 1 ml Siringa</td><td>BD</td><td>Luer-Lok, REF309628</td><td></td></tr><tr><td>10%&nbsp; FBS</td><td>Thermo fisher</td><td>Cytiva SH30910.03HI</td><td></td></tr><tr><td>10% DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a 2 fotoni</td><td>Prairie Technologies, Bruker</td><td>Prairie Ultima IV</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori di alcol, 70%</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS093810</td><td></td></tr><tr><td>Alcool, flacone spray</td><td>Decon Labs Inc</td><td>Decon SaniHol, 04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Reynold Brands</td><td>Reynold Wrap foglio di alluminio</td><td></td>antiaderente</tr><tr><td>Macchina per anestesia</td><td>Patterson Scientific</td><td>SAS3</td><td></td></tr><tr><td>Monitoraggio dell'anestesia&nbsp;</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>MouseSTAT Jr. Pulsossimetro</td><td></td>per roditori</tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico (100x), liquido</td><td>Invitrogen</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori Betadine</td><td>Professional Disposables International, Inc</td><td>S41125</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia, 5 mm&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>Size 5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina a rilascio prolungato</td><td>Zoo Pharm</td><td>Bup SR Lab, 1,0 mg/mL</td><td>Un farmaco generico può essere utilizzato in alternativa.</td></tr><tr><td>linea cellulare di glioma di ratto C6</td><td>ATCC (American Tissue Culture Collection)</td><td>CCL-107</td><td></td></tr><tr><td>Cannule</td><td>BD</td><td>16 G, 1.1/2", 30 G, 1"</td><td></td></tr><tr><td>Carprofene</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl, 50 mg/ml</td><td>Un farmaco generico può essere utilizzato al suo posto.</td></tr><tr><td>Cefazolina</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25021-101-10, 1 g/fiala</td><td>Un farmaco generico può essere utilizzato in alternativa.</td></tr><tr><td>Filtro cellulare, 40 & micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone, 6" &nbsp;</td><td>Dyad Medical Sourcing, LLC</td><td>HCS1005</td><td></td></tr><tr><td>Cemento dentale</td><td>Stoelting Co</td><td>51459</td><td>Kit di cemento dentale, trasparente, 2 componenti</td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Bimeda</td><td>138RX, 2 mg/mL</td><td>È possibile utilizzare un farmaco generico.</td></tr><tr><td>DietGel</td><td>ClearH2O</td><td>Recupero, 72-06-502</td><td></td></tr><tr><td>Drape&nbsp;</td><td>Cardinal Health</td><td>Bio Shield Wrap Drill</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Saeyang Microtech</td><td>Escort Pro, B08350</td><td></td></tr><tr><td>Punte per trapano&nbsp;</td><td>Hager & Meissinger GmbH</td><td>REF310104001001005</td><td>Misura 005, US 1/4</td></tr><tr><td>Software di analisi di imaging FIJI</td> National <td>Institute of Health</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>Forcipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td></td></tr><tr><td>Garza</td><td>Fisher HealthCare</td><td>Garza di cotone sterile, 4 x 4", 22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam&nbsp;</td><td>Ethicon Inc.</td><td>Spugna di gelatina assorbibile Surgifoam, Ref. 1972</td><td></td></tr><tr><td>Germinator&nbsp;</td><td>Cellpoint Scientific&nbsp;</td><td>Germinatore 500, n. 11688</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti, diametro 5 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Menzel Vetro di copertura&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guanti, non sterili</td><td>Fisher Scientific</td> Guanti <td></td>da <td>visita medica senza polvere in nitrile</td></tr><tr><td>Guanti, sterili</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS104070</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Church & Dwight</td><td>Nair Lozione depilatoria</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton</td><td>Hamilton Company Inc</td><td>Gastight #1701, 10 &micro; </td><td></td>L</tr><tr><td>HBSS senza Ca, Mg</td><td>Fisher Scientific PI88284</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barra di testa</td><td>Hongway</td><td>5 mm di diametro interno O-ring</td><td></td></tr><tr><td>Pad riscaldante</td><td>Stoelting Co.</td>Siringhe da insulina <td>scaldaroditori X2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exel International Medical Products&nbsp;</td><td>29G x 1/2& Primo;</td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticelle di ossido di ferro</td><td>Covis Pharma GmbH</td><td>Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Dechra</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Topi</td><td>Jackson Laboratories</td><td>NSG, ceppo 005557</td><td></td></tr><tr><td>microscopio (chirurgia)</td><td>Seiler Medical</td><td>Seiler IQ Q-100-220</td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticelle</td><td>personalizzate</td><td></td><td>Nanoparticelle di ossido di ferro (Ferumoxytol) marcate con isotiocianato di fluoresceina</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico</td><td>Principali prodotti farmaceutici</td><td>Unguento notturno Lubrifresh PM, 203964</td><td></td></tr><tr><td>Ossigeno</td><td>Linde Gas & Attrezzature Inc.</td><td>Cilindro stile K in acciaio ad alta pressione, 249CF, 2000PSIG, CGA 540</td><td></td></tr><tr><td>Bicchieri in plastica</td><td>Georgia-Pacirif Prodotti di consumo</td><td>Tazza per porzioni Dixie, 2 once, plastica, trasparente, tubo in polietilene PK2400</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Braintree Scientific</td><td>50-195-5494</td><td></td></tr><tr><td>Scala</td><td>Ohaus Corp</td><td>CR2200</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Integra Life Sciences Production Corp</td><td>Integra Miltex Forbici monouso per bisturi in acciaio inossidabile</td> Fisher Scientific 13-804-18 Sigillante Henkel Corp Loctite 4014 Camice da laboratorio monouso Conversioni ad alta tecnologia 17-444-081 Telaio stereotassico Stoelting Co.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Stoelting New Standard TM</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi di filtrazione per bottiglie sottovuoto sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Scatola di polistirolo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Guanti chirurgici</td><td>Cardinal Health</td><td>19-163-108</td><td></td></tr><tr><td>Colla chirurgica, adesivo per tessuti 3M Vetbond</td><td>3M Animal Care Prodcuts</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Coda catetere venoso</td><td>Custom</td><td></td><td>Consiste in due cannule da 30 G collegate con tubo silconico&nbsp;</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x), senza rosso fenolo</td><td>Invitrogen</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>Torcia a raggi ultravioletti</td><td>Tecnologia solare primaverile</td><td>Consciot</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

La somministrazione di terapie antitumorali somministrate per via endovenosa ai tumori cerebrali è limitata dalla barriera emato-encefalica. Un metodo per visualizzare direttamente l'accumulo e la distribuzione di macromolecole nei tumori cerebrali in vivo migliorerebbe notevolmente la nostra capacità di comprendere e ottimizzare la somministrazione di farmaci nei modelli preclinici. Questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio in vivo in tempo reale di nanoparticelle marcate con fluorescenza somministrate per via endovenosa con microscopia intravitale a due fotoni (2P-IVM) in un modello murino di glioblastoma (GBM).
Il protocollo contiene una descrizione in più fasi della procedura, tra cui l'anestesia e l'analgesia degli animali da esperimento, la creazione di una finestra cranica, l'impianto di cellule GBM, il posizionamento di una barra per la testa, la conduzione di studi 2P-IVM e l'assistenza post-chirurgica per studi di follow-up a lungo termine. Mostriamo sessioni rappresentative di imaging 2P-IVM e analisi delle immagini, esaminiamo i vantaggi e gli svantaggi di questa tecnologia e discutiamo le potenziali applicazioni.
Questo metodo può essere facilmente modificato e adattato per diverse domande di ricerca nel campo dell'imaging cerebrale preclinico in vivo .

Qui, abbiamo eseguito un intervento chirurgico alla finestra cranica e innestato cellule C6 in un modello murino NSG di GBM (n = 5). Una tenuta adeguata tra tutti i componenti coinvolti nella creazione della finestra (Figura 1A) garantirà la durata delle finestre per l'imaging a lungo termine e, inoltre, ridurrà la morbilità. Utilizzando lo stadio adattato per la 2P-IVM in vivo (Figura 2), abbiamo potuto visualizzare gli animali sotto anestesia per un massimo di 2 ore senza grandi artefatti di movimento. Circa 10 minuti dopo l'applicazione endovenosa delle nanoparticelle nei topi portatori di GBM, 2P-IVM mostra il segnale verde e fluorescente dei vasi nella regione del tumore, coerente con la localizzazione intravascolare delle nanoparticelle marcate con FITC. Solo una piccola quantità di segnale verde-fluorescente viene notata al di fuori dei vasi sanguigni, indicando l'inizio dello stravaso di NP (Figura 3A). Si osserva un aumento del segnale FITC proveniente dallo spazio extravascolare, che è in linea con lo stravaso avanzato (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig01.jpg"> Figura 1. Posizionamento della finestra cranica, craniotomia, impianto e imaging. (A) Sezione trasversale del posizionamento anatomico di una finestra cranica. Poiché la barra della testa è priva di metallo, è possibile eseguire la risonanza magnetica o l'imaging di particelle magnetiche oltre alla microscopia intravitale a due fotoni. (B) Panoramica (riga superiore) e una vista dettagliata (riga inferiore) della craniotomia (a sinistra), dell'impianto cellulare (al centro) e della microscopia intravitale a 2 fotoni (a destra). All'apertura del cranio, si verifica un'emorragia superficiale (a sinistra) e viene rapidamente riassorbita (al centro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig02.jpg"> Figura 2. Progettazione assistita da computer (CAD) del palcoscenico. CAD del tavolino utilizzato per la microscopia intravitale a 2 fotoni in vivo , inclusa una barra del morso, la stabilizzazione della barra della testa e viti per la regolazione dell'altezza e dell'angolo. Il file CAD 3D si trova in Supplemental Coding File 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig03.jpg"> Figura 3. Immagini di microscopia intravitale a 2 fotoni in vivo. Immagini acquisite (A) 10 min e (B) 24 h dopo la somministrazione endovenosa di nanoparticelle. Mentre le cellule GBM emettono segnali fluorescenti nello spettro rosso (a sinistra), le nanoparticelle nel tessuto cerebrale sono visualizzate in verde (a destra). # indica NP stravasate, * indica un vaso sanguigno. Solo un numero limitato di particelle ha subito uno stravaso ed è visibile in prossimità delle cellule tumorali 10 minuti dopo la somministrazione di NP. Un'abbondanza di particelle è visibile nella regione delle cellule GBM, suggerendo uno stravaso 24 ore dopo la somministrazione di NP. Le nanoparticelle sono costituite da isotiocianato di fluoresceina (FITC) e nanoparticelle di ossido di ferro (ferossimotolo). Le barre della scala rappresentano 100 μm. Abbreviazioni: 2P-IVM: microscopia intravitale a 2 fotoni, RFP: proteina fluorescente rossa, GBM: glioblastoma, FITC: isotiocianato di fluoresceina, NP: nanoparticelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File di codifica supplementare 1: file CAD 3D del palco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/custom%20stage%203D%20CAD.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

Presentiamo un nuovo approccio per la microscopia a due fotoni della somministrazione tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro marcate con fluorescenza al glioblastoma in un modello murino.

Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

Il glioblastoma è uno dei tumori cerebrali primari più comuni ed è associato a una crescita rapida e a una scarsa aspettativa di vita. Lo sviluppo di terapie efficaci per il glioblastoma rimane una sfida importante poiché la somministrazione di terapie è limitata dalla barriera ematoencefalica. Un metodo per visualizzare direttamente l'accumulo e la distribuzione delle macromolecole nel cervello migliorerebbe notevolmente la nostra capacità di comprendere e ottimizzare la somministrazione dei farmaci.La microscopia a due fotoni offre una soluzione elegante per studiare la distribuzione in tempo reale delle nanoparticelle nel modello preclinico di glioblastoma. Modificando la nanoparticella utilizzata in questo studio, è possibile studiare la somministrazione di diversi farmaci candidati e terapie combinate a livello cellulare e molecolare. Oltre alla microscopia intravitale a due fotoni, la componente di ossido di ferro di queste nanoparticelle consente l'imaging multimodale con risonanza magnetica o MPI.Per il futuro, le strutture di imaging potrebbero servire nella realizzazione della diagnosi precoce del cancro, portando così a terapie più efficaci contro le neoplasie maligne. Un percorso per raggiungere questo obiettivo è quello di fondere la microscopia intravitale a due fotoni con altre modalità di imaging come la tomografia a emissione di positroni e l'ecografia fotoacustica.

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Impianto intracranico di GL261 cellule in C57BL / 6 topi produce gliomi maligni che ricapitolano molte delle caratteristiche del glioblastoma multiforme umano. Abbiamo usato GL261 cellule che esprimono stabilmente luciferasi per permetterci di...

Impianto intracranica con 3D successivi In Vivo Bioluminescent Imaging dei gliomi Murine

Descriviamo un metodo integrato per la precisione, l'impianto stereotassico di cellule umane di glioblastoma multiforme nel cervello di topi nudi e seriali...

Stereotassica impianto intracranico e<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent di xenotrapianti di tumori in un sistema modello del mouse di Glioblastoma Multiforme

In questo video, eseguiamo l'imaging intravitale di cellule tumorali pre-iniettate in un modello murino tramite una finestra cranica impiantata. Questa tecnica di imaging time-lapse ad alta risoluzione consente lo studio del comportamento dinamico delle cellule tumorali nel topo vivo.

Imaging intravitale basato su finestra cranica in un modello murino: una tecnica di imaging per studiare il comportamento delle cellule tumorali pre-iniettate nel cervello di un modello murino

In questo video, descriviamo la tomografia molecolare a fluorescenza o FMT per l'imaging in vivo di xenotrapianti di glioblastoma marcati con proteine fluorescenti in modelli murini. La tecnica è utile per chiarire gli effetti delle terapie antitumorali a livello molecolare.

Tomografia molecolare a fluorescenza: una tecnica di imaging per l'imaging in vivo di xenotrapianti di glioblastoma con marcatura proteica fluorescente in un modello murino

Fonte: Clark, A.J., et al. Imaging a bioluminescenza di un modello animale immunocompetente per il glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'imaging a bioluminescenza per monitorare la progressione del glioblastoma in un modello murino immunocompetente, utilizzando cellule tumorali che esprimono luciferasi e luciferina per quantificare la crescita tumorale in modo non invasivo.

Imaging a bioluminescenza di un modello murino immunocompetente per il glioblastoma

Abbiamo stabilito un modello glioblastoma ortotopico corticale nei topi per intravital microscopia a due fotoni che ricapitola i vincoli biofisici normalmente in gioco durante la crescita del tumore. Una finestra di vetro cronica sostituzione del cranio sopra il tumore consente il seguito della progressione tumorale nel tempo mediante microscopia a due fotoni.

Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia

GL261 le cellule di glioma forniscono un utile modello animale immunocompetente di glioblastoma. Gli obiettivi di questo protocollo sono dimostrare tecniche adeguate per il monitoraggio della crescita tumorale intracranica utilizzando l'imaging in bioluminescenza in vivo e verificare l'utilità delle cellule GL261 modificate con luciferasi per lo studio dell'immunologia tumorale e degli approcci immunoterapeutici per il trattamento del glioblastoma.

Bioluminescenza Imaging di un Modello immunocompetenti Animal Glioblastoma

Orthotopic iniezione intracranico delle cellule del tumore è stato utilizzato nella ricerca sul cancro per studiare la biologia del tumore di cervello, la progressione, evoluzione e risposta terapeutica. Qui presentiamo la tomografia molecolare fluorescenza degli xenotrapianti del tumore, che fornisce in tempo reale videomicroscopia imaging e quantificazione di un tumore di massa in modelli preclinici di glioblastoma.

Fluorescenza tomografia molecolare per l'Imaging In Vivo di Glioblastoma xenotrapianti

Comprendere il comportamento maligno del cancro richiede la creazione di modelli accurati di come le cellule tumorali interagiscono con i componenti del microambiente tumorale, come i macrofagi. Qui descriviamo due metodi per studiare l'interazione delle cellule di glioblastoma con i macrofagi e le microglia associati al tumore, dove viene valutato l'effetto sull'invasione del glioblastoma.

Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multifotone per eseguire l'imaging a lungo termine ad alta risoluzione di una singola cellula del polmone intatto in tempo reale utilizzando una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto.

A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

Scopri la microscopia intravitale a due fotoni per studiare la distribuzione di nanoparticelle fluorescenti nel glioblastoma utilizzando un modello murino. Questa tecnica avanzata permette di ottimizzare le strategie di somministrazione terapeutica attraverso la barriera ematoencefalica.

Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

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