Name: Un approccio di clonazione senza soluzione di continuità per la costruzione di vettori di espressione del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria dei suini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Scopri la clonazione senza soluzione di continuità per costruire vettori di espressione del gene PRRSV usando ricombinazione omologa e PCR. Questo metodo consente l'assemblaggio efficiente di frammenti multipli in biologia molecolare.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal sostegno finanziario dei fondi per l'avvio della ricerca di dottorato forniti dalla China West Normal University (n. 20E059).

1. Preparazione del modello del gene PRRSV
<ol><li>Scongelare lo stock virale in 1 mL di reagente per l'estrazione dell'RNA (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Aggiungere 0,2 mL di cloroformio e mescolare accuratamente. Incubare per 3 min.</li>
	<li>Centrifugare la miscela per 15 minuti a 12.000 × g a 4 °C. NOTA: La miscela è divisa in tre fasi, vale a dire una fase acquosa incolore, un'interfase e una fase fenolo-cloroformio rosso.</li>
	<li>Pipett la fase acquosa incolore e trasferirla in un nuovo tubo.</li>
	<li>Miscelare accuratamente la fase acquosa con 0,5 mL di isopropanolo e incubare per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Centrifugare per 10 minuti a 12.000 × g a 4 °C. NOTA: Il fondo della provetta ha un precipitato di RNA bianco.</li>
	<li>Utilizzare una micropipetta per scartare il surnatante della provetta.</li>
	<li>Aggiungere 1 ml di etanolo al 75% per risospendere il pellet e agitare brevemente.</li>
	<li>Centrifugare per 5 minuti a 7.500 × g a 4 °C. Utilizzare una micropipetta per scartare il surnatante della provetta.</li>
	<li>Asciugare l'RNA per 5 minuti, aggiungere 20-50 μL di acqua priva di RNasi per risospendere l'RNA e mescolare accuratamente.</li>
	<li>Procedere all'esecuzione della trascrizione inversa; impostare le reazioni per eseguire la trascrizione inversa come mostrato nella Tabella 1. NOTA: Per garantire il successo della trascrizione inversa, utilizzare modelli di RNA di alta qualità.</li>
	<li>Utilizzare il cDNA risultante per la PCR o conservarlo a -20 °C.</li>
</ol>2. Progettazione del primer PCR
<ol><li>Progettazione del primer in avanti<ol><li>Apri il software e scegli Nuovo file DNA.</li>
		<li>Incolla la sequenza genica PRRSV (GenBank: FJ548852.1) da NCBI nel software. Fare clic su OK per generare i file di sequenza.</li>
		<li>Analizza la sequenza e segna le giunzioni dei frammenti. Progetta il primer di sequenza specifico in avanti dei frammenti. Nella maggior parte dei casi, la temperatura di fusione (Tm) preferibile è compresa tra 55 °C e 62 °C e il contenuto di GC è del 40-60%.</li>
		<li>Fare clic su Primer e scegliere Aggiungi primer.</li>
		<li>Incolla la sequenza specifica e aggiungi le sequenze sovrapposte del vettore al primo nucleotide 5' del primer di sequenza specifica. Vicino a ciascuna giunzione, scegli 20-40 bp come regione di sovrapposizione tra i due frammenti adiacenti.</li>
		<li>Assegnare un nome all'innesco in avanti contenente le sporgenze e la sequenza specifica (vedere la Figura S1 supplementare).</li>
		<li>Fare clic su Aggiungi primer al modello.</li>
	</ol></li>
	<li>Progettazione del primer inverso<ol><li>Analizza la sequenza e contrassegna le giunzioni dei frammenti nel software. Progetta il primer della sequenza specifica inversa dei frammenti.</li>
		<li>Fare clic su Primer e scegliere Aggiungi primer.</li>
		<li>Incolla la sequenza specifica e aggiungi il sito di restrizione al primo nucleotide 5' del primer della sequenza specifica. NOTA: I siti di restrizione aggiunti devono essere assenti dal frammento di inserimento e dal vettore, ad eccezione dei siti di clonazione multipli.</li>
		<li>Aggiungere sequenze di 20-40 bp di vettori al primo nucleotide 5' del sito di restrizione.</li>
		<li>Nominare il primer inverso contenente le sporgenze e la sequenza specifica (vedi Figura supplementare S1).</li>
		<li>Fare clic su Aggiungi primer al modello.</li>
	</ol></li>
</ol>3. PCR per amplificare i frammenti
<ol><li>Impostare sei reazioni PCR individuali (Tabella 2): per il frammento 1, utilizzare i primer P1 e P2 (vedere la Figura S2 supplementare); per il frammento 2, utilizzare i primer P3 e P4 (vedi Figura Supplementare S2); per il frammento 3, utilizzare i primer P5 e P6 (vedi Figura S2 supplementare); per il frammento 4, utilizzare i primer P7 e P8 (vedi Figura S2 supplementare); per il frammento 5, utilizzare i primer P9 e P10; e utilizzare i primer P11 e P12 per amplificare il frammento 6 (vedi Figura supplementare S2). NOTA: Scongelare, mescolare e centrifugare brevemente ogni componente prima dell'uso.</li>
	<li>Eseguire la PCR utilizzando il protocollo in tre fasi nella Tabella 2.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di tampone di caricamento DNA 6x a 5 μL di prodotto PCR, mescolare e centrifugare brevemente il contenuto.</li>
	<li>Analizzare i campioni utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio all'1%.</li>
</ol>4. Purificazione dei frammenti di PCR
NOTA: La purificazione dei prodotti PCR da un gel utilizzando un kit di estrazione del gel (vedere la Tabella dei materiali) è importante per la costruzione del vettore.
<ol><li>Aggiungere 9 μL di tampone di caricamento DNA 6x a 45 μL di prodotti PCR, mescolare e centrifugare brevemente il contenuto.</li>
	<li>Eseguire l'elettroforesi con gel di agarosio/goldview all'1% per separare i frammenti di DNA. NOTA: Non riutilizzare il tampone di corsa TAE poiché il suo valore di pH influenzerà il recupero del frammento di DNA.</li>
	<li>Dopo un'adeguata separazione delle bande, utilizzare un bisturi affilato per asportare accuratamente le bande di DNA. NOTA: Ridurre al minimo le dimensioni della fetta di gel tagliando l'agarosio in eccesso.</li>
	<li>Pesare la fetta di gel in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 ml, aggiungere un volume uguale di tampone legante alla fetta di gel (ad esempio, 0,3 ml per una fetta di 0,3 g) e incubare a 60 °C per 7 minuti.</li>
	<li>Inserire una mini colonna in una provetta di raccolta da 2 mL. Aggiungere 700 μL di soluzione di DNA/agarosio dalla fase 4.4 alla mini colonna.</li>
	<li>Centrifugare a 10.000 × g per 1 minuto a temperatura ambiente. Eliminare il filtrato e riutilizzare la provetta di raccolta.</li>
	<li>Aggiungere 300 μl di tampone legante e centrifugare a 13.000 × g per 1 minuto a temperatura ambiente. Eliminare il filtrato e riutilizzare la provetta di raccolta.</li>
	<li>Aggiungere 700 μl di tampone di lavaggio e centrifugare a 13.000 × g per 1 minuto a temperatura ambiente. Eliminare il filtrato e riutilizzare la provetta di raccolta.</li>
	<li>Centrifugare la mini colonna vuota per 2 minuti alla massima velocità per asciugare la matrice della colonna. Posizionare la mini colonna in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di acqua deionizzata direttamente al centro della membrana della colonna e lasciare riposare a temperatura ambiente per 2 minuti. Centrifugare a 13.000 × g di velocità per 1 min.</li>
	<li>Conservare il DNA a -20 °C.</li>
</ol>5. Preparazione di un vettore linearizzato
NOTA: Dopo aver preparato il plasmide, gli enzimi selezionati possono essere utilizzati per tagliarlo. La digestione lunga o digestione a doppio enzima è fondamentale per garantire la digestione di tutto il DNA. Ciò ridurrà il numero di cloni falsi positivi negli esperimenti successivi.
<ol><li>Linearizzazione pVAX1
	<ol><li>Preparare la miscela di reazione a temperatura ambiente nell'ordine indicato (Tabella 3). NOTA: Il volume d'acqua deve essere aggiunto per mantenere il volume totale di reazione indicato. Qui, 1 μg del plasmide è stato digerito con enzimi nella miscela di reazione. A seconda della concentrazione del plasmide, il volume del plasmide può essere regolato nella miscela di reazione.</li>
		<li>Mescolare delicatamente; Quindi gira verso il basso. Incubare a 37 °C in un blocco termico o in un termostato ad acqua per 60 min.</li>
		<li>Eseguire la purificazione su gel in modo simile alla purificazione dei frammenti della PCR nella sezione 4 utilizzando il kit di estrazione del gel (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
	<li>Linearizzazione pVAX1-F1 NOTA: pVAX1-F1 è il vettore ottenuto dal primo ciclo di ricombinazione di pVAX1 (NdeI e HindIII) e frammento 1. pVAX1-F2 è il vettore ottenuto dal ciclo di ricombinazione di pVAX1-F1 (NdeI) e frammento 2. pVAX1-F3 è il vettore ottenuto dal ciclo di ricombinazione di pVAX1-F2 (NdeI) e frammento 3. pVAX1-F4 è il vettore ottenuto dal ciclo di ricombinazione di pVAX1-F3 (NdeI) e frammento 4. pVAX1-F5 è il vettore ottenuto dal ciclo di ricombinazione di pVAX1-F4 (EcoRV e NtoI) e dal frammento 5.<ol><li>Per ciascun vettore, preparare separatamente la miscela di reazione a temperatura ambiente nell'ordine indicato (tabella 3).</li>
		<li>Mescolare delicatamente; Quindi gira verso il basso. Incubare a 37 °C in un blocco termico o in un termostato ad acqua per 60 min.</li>
		<li>Eseguire la purificazione su gel in modo simile alla purificazione dei frammenti della PCR nella sezione 4 utilizzando il kit di estrazione del gel (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Subclonazione su un nuovo vettore
NOTA: È possibile ottenere una buona efficienza di clonazione utilizzando 50-200 ng di vettore e inserti.
<ol><li>Impostare la clonazione senza soluzione di continuità e la reazione di assemblaggio ExonArt (Tabella 4). Regolare il volume totale di reazione a 10 μl utilizzando H2O deionizzato sterilizzato e mescolare.</li>
	<li>Incubare la reazione in un termociclatore per 15-60 minuti a 50 °C. Conservare i campioni sul ghiaccio. NOTA: Estendere l'incubazione fino a 60 minuti può migliorare l'efficienza dell'assemblaggio.</li>
	<li>Scongelare le cellule DH5α chimicamente competenti sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 10 μl di prodotto di assemblaggio alle celle competenti; Quindi, miscelare delicatamente pipettando su e giù.</li>
	<li>Mettere il composto sul ghiaccio per 30 minuti.</li>
	<li>Shock termico a 45 °C per 45 s e trasferire i tubi sul ghiaccio per 3 min.</li>
	<li>Aggiungere 900 μl di terreno SOC alla provetta.</li>
	<li>Agitare il tubo a 225 giri/min per 1 ora in un'incubatrice con agitazione a 37 °C.</li>
	<li>Centrifugare la reazione di trasformazione a 6.000 × g per 2 min. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μl di terreno SOC fresco.</li>
	<li>Stendere la sospensione cellulare trasformata su una piastra LB separata con 50 μg/mL di kanamicina.</li>
	<li>Incubare tutte le piastre per una notte a 37 °C. Scegli le singole colonie isolate da ogni piastra sperimentale.</li>
</ol>7. Analisi dei trasformanti
<ol><li>Prelevare otto colonie in 20 μL di terreno LB contenente 50 μg/mL di kanamicina.</li>
	<li>Impostare la reazione di PCR della colonia ed eseguire la PCR (Tabella 5). NOTA: Per la reazione di PCR della colonia per il frammento 1, utilizzare i primer P1 e P2 (vedi File supplementare 1); per il frammento 2, utilizzare i primer P3 e P4 (vedi File supplementare 1); per il frammento 3, utilizzare i primer P5 e P6 (vedi File supplementare 1); per il frammento 4, utilizzare i primer P7 e P8 (vedi Figura S2 supplementare); per il frammento 5, utilizzare i primer P9 e P10; e utilizzare i primer P11 e P12 per rilevare il frammento 6 (vedi Figura supplementare S2).</li>
	<li>Aggiungere 1 μl di tampone di caricamento del DNA 6x a 5 μl del prodotto PCR, mescolare e centrifugare brevemente il contenuto.</li>
	<li>Analizzare i risultati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio all'1%.</li>
	<li>Selezionare una colonia positiva in 5 mL di terreno LB contenente 50 μg/mL di kanamicina e far crescere per una notte a 37 °C.</li>
	<li>Ottenere il plasmide utilizzando un mini kit di DNA plasmidico (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Visualizzare i risultati utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio all'1%.</li>
</ol>

Clonazione del gene PRRSV a lunghezza intera nel vettore di espressione pVAX1

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<li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

La tecnica di assemblaggio di Gibson è un metodo di clonaggio molecolare basato sulla ricombinazione in vitro per l'assemblaggio di frammenti di DNA8. Questo metodo consente l'assemblaggio di più frammenti di DNA in un plasmide circolare in una reazione isotermica a provetta singola. Tuttavia, uno degli ostacoli alla tecnica di assemblaggio di Gibson è l'acquisizione di lunghi frammenti dal cDNA. I frammenti lunghi sono difficili da amplificare con precisione per molte ragioni. Ad esempio, i primer sono più facili da disaccoppiare durante lunghi periodi di estensione, il cDNA potrebbe non essere di buona qualità o le regioni ricche di GC smetteranno di polimerizzare il DNA. Quando il frammento a lunghezza intera non può essere facilmente ottenuto dal cDNA utilizzando la PCR, il frammento a lunghezza intera deve essere diviso in più frammenti per l'amplificazione. Tuttavia, all'aumentare del numero e della lunghezza dei frammenti di DNA inseriti, anche l'efficienza e i cloni positivi del saggio di ricombinazione omologa diminuiranno in modo significativo. Quindi, abbiamo provato una soluzione alternativa introducendo siti di restrizione adeguati all'estremità 3' degli inserti. Quindi, potremmo linearizzare il vettore e unire i frammenti di DNA nel vettore uno per uno attraverso la tecnologia di ricombinazione omologa ed eliminare i siti di restrizione indesiderati tramite la reazione di ricombinazione omologa.
Essendo uno dei patogeni economicamente più significativi nei mercati globali, il PRRSV ha sempre attirato l'attenzione dei ricercatori negli ultimi 30 anni 10,21,22. È un virus a RNA a filamento positivo, lungo circa 15 kb, e il lungo frammento di DNA non può essere facilmente amplificato dal cDNA. Quindi, per indagare se questo metodo può essere utilizzato per la clonazione di frammenti lunghi, abbiamo utilizzato il PRRSV come modello per la clonazione del genoma a lunghezza intera. In questo studio, abbiamo diviso la sequenza completa in sei frammenti e aggiunto siti di restrizione appropriati al primer inverso, ottenendo sei frammenti mediante PCR. Abbiamo quindi ottenuto con successo il vettore di espressione pVAX1-PRRSV a lunghezza intera mediante diversi cicli di reazioni di ricombinazione. Inoltre, il vettore di espressione PRRSV costruito può fungere da modello per la trascrizione in vitro per ottenere RNA con cappuccio per la trasfezione o la ricerca di vaccini a mRNA. Nel frattempo, il plasmide virale mRNA costruito può essere utilizzato per lo screening in batch di composti naturali antivirali in vitro attraverso tecniche di interazione molecolare, come la risonanza plasmonica di superficie23,24. Il plasmide pVAX1 soddisfa i requisiti perché un test di trascrizione in vitro richiede un plasmide ad alta copia con un promotore T7. Inoltre, il plasmide pVAX1-PRRSV contenente il promotore del CMV può essere trasfettato in cellule BHK-21 per l'espressione del genoma virale25,26.
In sintesi, con questo protocollo, dimostriamo che i geni lunghi a lunghezza intera possono essere divisi in diversi frammenti ottenuti mediante amplificazione PCR. È importante che i primer inversi siano introdotti nei siti di restrizione appropriati in modo che il vettore di espressione genica a lunghezza intera possa essere ottenuto mediante diversi cicli di reazioni di ricombinazione. Questo metodo può essere utilizzato per geni a lunghezza intera che non possono essere ottenuti direttamente da una singola PCR o per geni a lunghezza intera che non possono essere ottenuti dalla ricombinazione omologa di più inserti. Quindi, questo approccio è un importante complemento alla tecnica di assemblaggio di Gibson, prevediamo che possa essere ampiamente utilizzato per la clonazione di lunghi frammenti di DNA e la costruzione di geni di fusione.

Come tecnica essenziale per costruire strumenti sperimentali basati sul DNA per l'espressione in cellule procariotiche ed eucariotiche, il clonaggio molecolare è una componente molto importante della biologia sperimentale. Il clonaggio molecolare prevede quattro processi: l'acquisizione del DNA dell'inserto, la legatura dell'inserto nel vettore appropriato, la trasformazione del vettore ricombinante in Escherichia coli (E. coli) e l'identificazione dei cloni positivi1. Finora, sono stati adottati diversi metodi per unire le molecole di DNA utilizzando gli enzimi di restrizione 2,3 e la ricombinazione mediata da PCR 4,5,6. La ricombinazione omologa, nota come tecnologia di clonazione senza soluzione di continuità, è l'insieme dei metodi di clonaggio, che consente l'inserimento indipendente dalla sequenza e senza cicatrici di uno o più frammenti di DNA in un vettore. Questa tecnologia include il clonaggio indipendente dalla sequenza e dalla legatura (SLIC), l'estratto di clonazione per ligazione senza soluzione di continuità (SLiCE), l'In-Fusion e l'assemblaggio Gibson. Impiega un'esonucleasi per degradare un filamento dell'inserto e un vettore per generare estremità coesive, e la riparazione in vivo o la ricombinazione in vitro per unire covalentemente l'inserto al vettore formando legami fosfodiestere. La possibilità di unire un singolo inserto a un vettore in qualsiasi sequenza senza cicatrici è molto interessante. Inoltre, la tecnologia ha la capacità di unire 5-10 frammenti in un ordine predeterminato senza restrizioni di sequenza.
Come una delle tante tecniche di DNA ricombinante, la tecnica di assemblaggio di Gibson, attualmente il metodo di clonazione più efficace 7,8, è un metodo robusto ed elegante basato sull'esonucleasi per assemblare uno o più frammenti di DNA linearizzati senza soluzione di continuità. La reazione di assemblaggio di Gibson viene eseguita in condizioni isoterme utilizzando una miscela di tre enzimi, vale a dire l'esonucleasi 5', la polimerasi ad alta fedeltà e una DNA ligasi termostabile. Le sporgenze a filamento singolo di 3' create dall'esonucleasi 5'-3' contribuiscono alla ricottura di frammenti che condividono complementarità a un'estremità. La polimerasi ad alta fedeltà riempie efficacemente le lacune nelle regioni a singolo filamento ricotto aggiungendo dNTP e la DNA ligasi termostabile sigilla le tacche per formare molecole di DNA congiunte8. Pertanto, questo metodo tecnico è stato ampiamente utilizzato per la costruzione di vettori di espressione genica.
La sindrome riproduttiva e respiratoria dei suini (PRRS) è una malattia virale che porta a compromissione riproduttiva e insufficienza respiratoria nei suini causata da PRRSV a qualsiasi età di9 anni. La sindrome si manifesta con febbre, anoressia, polmonite, letargia, depressione e distress respiratorio. Inoltre, in alcune epidemie sono stati osservati segni clinici, tra cui la colorazione rosso/blu delle orecchie. Come membro della famiglia degli arterivirus, il PRRSV è ampiamente trasmesso ai paesi produttori di carne suina attraverso il contatto diretto e lo scambio di fluidi, tra cui urina, colostro e saliva. A causa della diffusione del PRRSV negli Stati Uniti, le perdite economiche totali dell'industria suina sono state stimate in circa 664 milioni di dollari all'anno, sulla base della scala di allevamento di 5,8 milioni di scrofe e 110 milioni di suini10,11. Il rapporto dell'Animal and Plant Health Inspection Service mostra che il 49,8% dei suini non vaccinati mostra la presenza di PRRSV nel siero12 e bassi livelli di PRRSV nei suini infetti vengono escreti attraverso la saliva, le secrezioni nasali, l'urina e le feci13. Sono state implementate diverse strategie per controllare la propagazione del PRRSV 14,15,16. Oltre alle procedure di eliminazione per creare popolazioni completamente negative al virus o migliorare la biosicurezza e la gestione, la somministrazione di vaccini è un mezzo efficace per controllare la PRRS.
Il PRRSV è un virus a RNA a senso positivo con involucro, a filamento singolo, con una lunghezza di circa 15 kilobasi (kb). Il genoma del PRRSV è costituito da almeno 10 frame di lettura aperti (ORF), una breve regione non tradotta di 5' (5' UTR) e una coda di poli(A) al terminale di 3' (Figura 1A)17. Il genoma di un virus a RNA a filamento negativo non è infettivo, mentre il genoma dei virus a RNA a filamento positivo è infettivo. Esistono due strategie principali per la trasfezione dell'RNA e del DNA per generare la progenie virale18. Tuttavia, la clonazione del frammento a lunghezza intera corrispondente al genoma dell'RNA è fondamentale per la costruzione di cloni infettivi. A causa della natura lunga e complessa del genoma del PRRSV, il genoma completo non può essere facilmente ottenuto attraverso la PCR in una sola volta. Inoltre, sebbene la sintesi artificiale dei geni del PRRSV sia una soluzione efficace, la sintesi di frammenti lunghi è spesso costosa. Quindi, per ottenere il vettore di espressione a lunghezza intera del PRRSV, abbiamo tentato di crearlo con il metodo di ricombinazione omologa a inserti multipli19,20. Sfortunatamente, non siamo stati in grado di ottenere il vettore di espressione genica a lunghezza intera. Pertanto, in questo studio, abbiamo aggiunto siti di restrizione appropriati al primer inverso e abbiamo ottenuto con successo il vettore di espressione pVAX1-PRRSV mediante diversi cicli di reazioni di ricombinazione omologa. Inoltre, questo metodo può anche ottenere la delezione o la mutazione di geni bersaglio e unire in modo efficiente un gran numero di frammenti di DNA al vettore di espressione.

<table><tbody><tr><td>1 kb più DNA Ladder</td><td>Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>MD113-02</td><td></td></tr><tr><td>2x Universal Green PCR Master Mix</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A303-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga da banco</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FRESCO17</td><td></td></tr><tr><td>Banco pulito</td><td>Sujing Antai Air Technology&nbsp; Co., Ltd</td><td>VD-650-U</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura per elettroforesi del DNA</td><td>Mannaia Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>170905117</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di caricamento del DNA (6x)</td><td>Biosharp Biotechnology Co., Ltd</td><td>BL532A</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel E. Z. N. A. Omega</td><td>Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D2500-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit di DNA plasmidico E.Z.N.A. I</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>Coltivatore a temperatura eretta con elettroriscaldamento</td><td>Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd</td><td>DHP-9082</td><td></td></tr><tr><td>Kit di clonazione e assemblaggio senza cuciture ExonArt</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A101-02</td><td></td></tr><tr><td>ExonScript RT SuperMix con dsDNase</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A502-1</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest Eco321 (EcoRV)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0303</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HindIII</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0504</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NheI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0974</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NotI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0596</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR</td><td>Bio-Rad Laboratories Co., Ltd</td><td>721BR07925</td><td></td></tr><tr><td>Goldview Colorazione in gel per acido nucleico</td><td>Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd</td><td>YB10201ES03</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per fabbricare il ghiaccio</td><td>Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd</td><td>FMB100</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Platinum SuperFi II DNA polimerasi</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Plate (Kanamicina)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B530113-0010</td><td></td></tr><tr><td>LB terreno liquido sterile (Kanamicina)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B540113-0001</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettatori</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>Forno a microonde</td><td>Panasonic Electric (China) Co., Ltd</td><td>NN-GM333W</td><td></td></tr><tr><td>Agitatori orbitali</td><td>Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd</td><td>ZHWY-2102C</td><td></td></tr><tr><td>PRRSV virus</td><td>Sichuan Agricultural University</td><td>...</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>GSL Biotech, LLC</td><td>v5.1</td><td>Per progettare primer</td></tr><tr><td>T100 PCR Gradient Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories&nbsp; Co., Ltd</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>TAE buffer</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B040123-0010</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>15596026</td><td>Reagente per estrazione di RNA</td></tr></tbody></table>

un approccio di clonazione senza soluzione di continuità per la costruzione di vettori di espressione del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria dei suini

A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

La costruzione di vettori di espressione genica è una componente importante del lavoro di laboratorio in biologia sperimentale. Con i progressi tecnici come Gibson Assembly, la costruzione vettoriale diventa relativamente semplice ed efficiente. Tuttavia, quando il genoma completo del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina (PRRSV) non può essere facilmente amplificato da una singola reazione a catena della polimerasi (PCR) dal cDNA, o è difficile acquisire un vettore di espressione genica a lunghezza intera mediante ricombinazione omologa di più inserti in vitro, l'attuale tecnica di assemblaggio di Gibson non riesce a raggiungere questo obiettivo.
Di conseguenza, abbiamo mirato a dividere il genoma del PRRSV in diversi frammenti e a introdurre siti di restrizione appropriati nel primer inverso per ottenere frammenti amplificati con PCR. Dopo aver unito il precedente frammento di DNA nel vettore mediante la tecnologia di ricombinazione omologa, il nuovo vettore ha acquisito il sito di scissione dell'enzima di restrizione. Pertanto, possiamo linearizzare il vettore utilizzando il sito di scissione enzimatica appena aggiunto e introdurre il successivo frammento di DNA a valle del frammento di DNA a monte.
Il sito di scissione dell'enzima di restrizione introdotto all'estremità 3' del frammento di DNA a monte sarà eliminato e un nuovo sito di scissione sarà introdotto all'estremità 3' del frammento di DNA a valle. In questo modo, possiamo unire i frammenti di DNA al vettore uno per uno. Questo metodo è applicabile per costruire con successo il vettore di espressione PRRSV ed è un metodo efficace per assemblare un gran numero di frammenti nel vettore di espressione.

In questo articolo, presentiamo un sistema di ricombinazione in vitro per assemblare e riparare molecole di DNA sovrapposte utilizzando il primer inverso tramite siti di restrizione introdotti continuamente (Figura 1B). Questo sistema è una procedura semplice ed efficiente che comprende la preparazione del vettore lineare e dei frammenti di inserto contenenti sporgenze introdotte mediante PCR con primer aventi appropriate sequenze di estensione 5' e siti di restrizione; una singola reazione isoterma in vitro e la trasformazione chimica standard dei prodotti di ricombinazione in batteri ospiti idonei; e la selezione di una colonia positiva e l'ottenimento del vettore ricombinante per il successivo ciclo di clonazione. Per ottenere il vettore pVAX1-PRRSV passo dopo passo, i siti di restrizione devono essere assenti dagli inserti e dai siti di clonazione multipli del vettore ricombinante.
Poiché è difficile ottenere sequenze geniche complete e complesse con una singola PCR, i frammenti di PRRSV possono essere amplificati solo con sei reazioni PCR (Figura 1C). Durante il primo ciclo di ricombinazione, il frammento 1 di PRRSV è stato inserito con successo nel vettore pVAX1 e il nuovo plasmide ricombinante con i siti di restrizione introdotti (NheI, un singolo sito di scissione enzimatica) è stato chiamato pVAX1-F1 (Figura 1D). Al secondo ciclo di ricombinazione, il vettore pVAX1-F1 è stato linearizzato con l'enzima di restrizione NheI. Il frammento 2 è stato inserito con successo nel vettore pVAX1-F1, producendo il plasmide ricombinante pVAX1-F2 con siti di restrizione (NheI, un singolo sito di scissione enzimatica) (Figura 1D). Per il terzo ciclo di ricombinazione, come mostrato nella Figura 1D, il frammento 3 è stato inserito con successo nel vettore pVAX1-F2 per ottenere pVAX1-F3 con siti di restrizione (NheI, un singolo sito di scissione enzimatica). Nel quarto ciclo di ricombinazione, abbiamo ottenuto il vettore pVAX1-F4 introducendo il frammento 4 con i siti di restrizione EcoRV (un singolo sito di scissione enzimatica). Quindi, il vettore pVAX1-F4 è stato linearizzato dall'enzima di restrizione EcoRV e NotI. Il frammento 5 è stato clonato nel vettore pVAX1-F4 per ottenere pVAX1-F5 con siti di restrizione (NotI, un singolo sito di scissione enzimatica). Dopo l'ultimo ciclo di ricombinazione, il vettore di sovraespressione a lunghezza intera del PRRSV (pVAX1-PRRSV) è stato ottenuto con successo (File supplementare 1). Come illustrato nella Figura 1D, il nuovo plasmide ricombinante diventa sempre più grande con l'introduzione continua di frammenti. Pertanto, questi risultati hanno indicato che la combinazione dell'aggiunta di siti di restrizione appropriati e l'utilizzo della tecnica di assemblaggio di Gibson può ottenere l'introduzione efficiente di frammenti di DNA nel vettore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66320/66320fig01.jpg"> Figura 1: Organizzazione e costruzione di vettori pVAX1-F6 (pVAX1-PRRSV) mediante ricombinazione omologa. (A) Organizzazione del genoma del PRRSV. ORF1b codifica per l'RNA polimerasi RNA-dipendente, l'RNA elicasi e i domini multinucleari di legame dello zinco. Altri ORF codificano glicoproteine associate alla membrana (GP2, GP3, GP4 e GP5), la proteina E, la proteina dell'involucro di membrana e la proteina nucleocapside. (B) Diagramma schematico del processo di generazione del vettore pVAX1-PRRSV. (C) Il gel di DNA agarosio mostra l'amplificazione PCR dei frammenti bersaglio. (D) Con l'inserimento dei frammenti, la dimensione del vettore ricombinante aumenta gradualmente. Abbreviazioni: PRRSV = Virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina; ORF = cornice di lettura aperta; GP = glicoproteina; E = proteina E; M = proteina dell'involucro di membrana; N = proteina nucleocapside. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>PRRSV RNA</td>
			<td>2 μl (25 ng)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Acqua priva di RNasi</td>
			<td>11 μl</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5x Miscela di reazione</td>
			<td>4 μl</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Miscela di enzimi supremo</td>
			<td>3 μl</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Temperatura</td>
			<td>Durata</td>
			<td>Cicli</td>
		</tr><tr><td>25 °C</td>
			<td>10 minuti</td>
			<td>Rimuovi il DNA genomico, i primer casuali si accoppiano con i modelli di RNA</td>
		</tr><tr><td>55 °C</td>
			<td>15 minuti</td>
			<td>Inattivazione rapida della dsDNasi e trascrizione inversa</td>
		</tr><tr><td>85 °C</td>
			<td>5 minuti</td>
			<td>Inattivazione della trascrittasi inversa</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Configurazione e condizioni della trascrizione inversa.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5x Buffer SuperFi II</td>
			<td>10 μl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Primer in avanti da 10 μM</td>
			<td>2,5 μl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Primer inverso da 10 μM</td>
			<td>2,5 μl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 mM dNTP</td>
			<td>1 μl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>cDNA (PRRSV)</td>
			<td>1 μl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Platino SuperFi II DNA polimerasi</td>
			<td>1 μl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>32 μl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Fase del ciclo</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Durata</td>
			<td>Cicli</td>
		</tr><tr><td>Denaturazione iniziale</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 secondi</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Denaturazione</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 secondi</td>
			<td>35</td>
		</tr><tr><td>Ricottura</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>10 secondi</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Estensione</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>3 minuti</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Estensione finale</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 minuti</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Tenere</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Configurazione e condizioni della reazione PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Linearizzazione pVAX1</td>
			<td>Linearizzazione pVAX1-F1</td>
			<td>Linearizzazione pVAX1-F2</td>
			<td>Linearizzazione pVAX1-F3</td>
			<td>Linearizzazione pVAX1-F4</td>
			<td>Linearizzazione pVAX1-F5</td>
		</tr><tr><td>Componente</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vettore</td>
			<td>10 μL (1 μg) di pVAX1</td>
			<td>6 μL (1 μg) di pVAX1-F1</td>
			<td>3,5 μL (1 μg) di pVAX1-F2</td>
			<td>7,5 μL (1 μg) di pVAX1-F3</td>
			<td>10 μL (1 μg) di pVAX1-F4</td>
			<td>15 μL (1 μg) di pVAX1-F5</td>
		</tr><tr><td>Enzima di restrizione 1</td>
			<td>1 μL di NdeI</td>
			<td>1 μL di NdeI</td>
			<td>1 μL di NdeI</td>
			<td>1 μL di NdeI</td>
			<td>1 μL di EcoRV</td>
			<td>1 μL di Not I</td>
		</tr><tr><td>Enzima di restrizione 2</td>
			<td>1 μL di HindIII</td>
			<td>1 μL di HindIII</td>
			<td>0,5 μl di CIAP</td>
			<td>0,5 μl di CIAP</td>
			<td>1 μL di Not I</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>10x buffer FastDigest</td>
			<td>2 μl</td>
			<td>2 μl</td>
			<td>2 μl</td>
			<td>2 μl</td>
			<td>2 μl</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>6 μl</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>13 μl</td>
			<td>9 μl</td>
			<td>6 μl</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr><tr><td>Totale</td>
			<td>20 μl</td>
			<td>20 μl</td>
			<td>20 μl</td>
			<td>20 μl</td>
			<td>20 μl</td>
			<td>20 μl</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Miscela di linearizzazione di pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 e pVAX1-F5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>Kit di clonazione e assemblaggio senza soluzione di continuità ExonArt</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Vettore linearizzato</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>Frammento</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>fino a 10 μl</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 4: Clonazione senza soluzione di continuità di ExonArt e configurazione della reazione di assemblaggio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>2x Master Mix PCR Verde Universale</td>
			<td>10 μl</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Primer in avanti da 10 μM</td>
			<td>0,4 μl</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Primer inverso da 10 μM</td>
			<td>0,4 μl</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sagoma</td>
			<td>1 μl</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>8,2 μl</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Totale</td>
			<td>20 μl</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Temperatura</td>
			<td>Durata</td>
			<td>Cicli</td>
		</tr><tr><td>95 °C</td>
			<td>30 secondi</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>98 °C</td>
			<td>10 secondi</td>
			<td>28</td>
		</tr><tr><td>56 °C</td>
			<td>10 secondi</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>3 minuti</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>5 minuti</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 5: Configurazione e condizioni della PCR della colonia.
Figura supplementare S1: Schema del processo di progettazione del primer. Vengono mostrati anche altri modelli di primer come P5 e P6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS1.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S2: Sequenze di primer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS2.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 1: dati di sequenziamento del DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/Supplemental_File_2.rar" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere il vettore di espressione di pVAX1-PRRSV introducendo opportuni siti di restrizione all'estremità 3' degli inserti. Possiamo linearizzare il vettore e unire i frammenti di DNA al vettore uno per uno attraverso la tecnologia di ricombinazione omologa.

Un approccio di clonazione senza soluzione di continuità per la costruzione di vettori di espressione del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria dei suini

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson ...

Questo protocollo dimostra la costruzione di un lungo e intricato vettore di espressione genica. Quando un frammento di DNA a lunghezza intera non può essere ottenuto mediante una singola PCR dal cDNA, o il vettore di espressione genica a lunghezza intera non può essere ottenuto mediante ricombinazione omologa a più inserti in vitro, questo metodo è applicabile. Attualmente, il clonaggio con legatura a più inserti viene utilizzato per ottenere frammenti di DNA a lunghezza intera per la clonazione in un vettore adatto.Questo metodo può ottenere la delezione o la mutazione di geni bersaglio e unire in modo efficiente un gran numero di frammenti di DNA al vettore di espressione.

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virus vaccinico (VV) è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica e il miglioramento della salute umana. Questo articolo descrive un metodo semplice e altamente efficiente per modificare il genoma VV utilizzando un sistema CRISPR-Cas9.

Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus

Herpesvirus dei tacchini (HVT) è ampiamente usato come una piattaforma di vettore per la generazione di vaccini ricombinanti contro un certo numero di malattie aviarie. Questo articolo viene descritto un approccio semplice e rapido per la generazione di vaccini ricombinanti HVT-vectored utilizzando un sistema di Cre-Lox e integrato NHEJ-CRISPR/Cas9.

Generazione di vettori ricombinanti Herpesvirus aviaria con CRISPR/Cas9 Gene Editing

Descriviamo un metodo per la generazione e amplificando geneticamente modificate virus sinciziale respiratorio (ad) e un saggio della placca ottimizzato per ad. Illustriamo questo protocollo creando due virus ricombinanti che rispettivamente permettono di quantificazione della replica di RSV e live analisi dei corpi di inclusione di RSV e dinamiche di granuli di corpi di inclusione-collegata.

Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante

La generazione di rotavirus ricombinanti dal DNA plasmide fornisce uno strumento essenziale per lo studio della replicazione e della patogenesi del rotavirus e per lo sviluppo di vettori e vaccini di espressione del rotavirus. Qui, descriviamo un approccio semplificato di genetica inversa per la generazione di rotavirus ricombinanti, compresi ceppi che esprimono proteine reporter fluorescenti.

Metodo di genetica inversa semplificato per recuperare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine Reporter

Questo è un metodo per generare virus vaccinia ricombinanti "senza cicatrici" utilizzando la selezione host-range e l'identificazione visiva dei virus ricombinanti.

Generazione rapida e senza soluzione di continuità di poxvirus ricombinanti utilizzando la gamma host e la selezione visiva

Per un'analisi meccanicistica approfondita della sintesi dell'RNA del virus respiratorio sincrezionale (RSV), segnalamo un protocollo di utilizzo della fosfoproteina chaperone (P) per la coespressione della nucleoproteina priva di RNA (N0)per il successivo assemblaggio in vitro dei nucleocapsidi specifici del virus (NC).

Generazione e assemblaggio di nucleocapsidi specifici del virus respiratorio

Scopri la clonazione senza soluzione di continuità per costruire vettori di espressione del gene PRRSV usando ricombinazione omologa e PCR. Questo metodo consente l'assemblaggio efficiente di frammenti multipli in biologia molecolare.

Un approccio di clonazione senza soluzione di continuità per la costruzione di vettori di espressione del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria dei suini (Video) | JoVE Journal

Un approccio di clonazione senza soluzione di continuità per la costruzione di vettori di espressione del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria dei suini

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