Name: AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Scopri la tecnica AQRNA-seq per quantificare piccoli RNA come microRNA e tRNA in campioni biologici. Questo metodo supera i limiti del RNA-Seq tradizionale e permette di studiare la dinamica dei tRNA durante la dormienza in Mycobacterium bovis BCG.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori del presente lavoro sono grati agli autori dell'articolo originale che descrive la tecnologia AQRNA-seq7. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) e della National Research Foundation di Singapore attraverso la Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Antimicrobial Resistance IRG.

Analisi della dinamica del tRNA con AQRNA-seq

<ol><li>Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+RNA+sequencing+into+clinical+diagnostics%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges.</a> Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).</li>
<li>Grillone, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+cancer%3A+platforms+and+strategies+for+investigating+the+genomic+%26%2334%3Bdark+matter.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic &#34;dark matter.&#34.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Goh, J. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+multiplexed+RNA+imaging+in+tissues+with+split-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.</a> Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Cummings, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+diagnosis+in+Mendelian+disease+with+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing.</a> Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).</li>
<li>Hu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+the+cellular+small+RNA+landscape+with+AQRNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq.</a> Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).</li>
<li>Alon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+bias+in+high-throughput+multiplex+sequencing+of+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA.</a> Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).</li>
<li>Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cell+stresses+induce+unique+patterns+of+tRNA+up-+and+down-regulation%3A+tRNA-seq+for+quantifying+changes+in+tRNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number.</a> Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+impact+of+RNA+secondary+structure+across+the+Arabidopsis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome.</a> Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).</li>
<li>García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+diversity+is+a+systematic+source+of+variation+in+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data.</a> PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).</li>
<li>FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+an+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+a+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: a language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).</li>
<li>Ougland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlkB+restores+the+biological+function+of+mRNA+and+tRNA+inactivated+by+chemical+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation.</a> Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).</li>
<li>Bernhardt, H. S., Tate, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+soup+or+vinaigrette%3A+did+the+RNA+world+evolve+at+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH.</a> Biol Direct. 7, 4(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.+J%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
</ol>

P.C.D. è inventore di due brevetti (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) relativi all'opera pubblicata.

Il flusso di lavoro di preparazione della libreria AQRNA-seq è progettato per massimizzare la cattura di RNA all'interno di un campione e ridurre al minimo la caduta della polimerasi durante la trascrizione inversa7. Attraverso una legatura del linker in due fasi, i nuovi oligo di DNA (Linker 1 e Linker 2) vengono legati in eccesso per completare completamente l'RNA all'interno del campione. I linker in eccesso possono essere rimossi in modo efficiente con RecJf, un'esonucleasi da 5' a 3' specific...

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS), noto anche come sequenziamento massivamente parallelo, è una tecnologia di sequenziamento del DNA che prevede la frammentazione del DNA, la legatura degli oligonucleotidi adattatori, l'amplificazione basata sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), il sequenziamento del DNA e il riassemblaggio delle sequenze di frammenti in un genoma. L'adattamento dell'NGS all'RNA di sequenza (RNA-seq) è un approccio potente per identificare e quantificare i trascritti di RNA e le loro varianti1. Gli sviluppi innovativi nei flussi di lavoro per la preparazione delle librerie di RNA e nelle pipeline di analisi bioinformatica, insieme ai progressi nella strumentazione di laboratorio, hanno ampliato il repertorio delle applicazioni RNA-seq, progredendo oltre il sequenziamento dell'esoma verso omiche funzionali avanzate come la profilazione dell'RNA non codificante2, l'analisi di singole cellule3, la trascrittomica spaziale 4,5, l'analisi di splicing alternativo6, tra gli altri. Questi metodi avanzati di RNA-seq rivelano funzioni complesse dell'RNA attraverso l'analisi quantitativa del trascrittoma in cellule e tessuti normali e malati.
Nonostante questi progressi nell'RNA-seq, diverse caratteristiche tecniche chiave limitano la potenza quantitativa del metodo. Sebbene la maggior parte dei metodi RNA-seq consenta una quantificazione precisa e accurata dei cambiamenti nei livelli di RNA tra variabili sperimentali (ad esempio, campioni biologici e/o stati fisiologici), non possono fornire confronti quantitativi dei livelli di molecole di RNA all'interno di un campione. Ad esempio, la maggior parte dei metodi RNA-seq non è in grado di quantificare con precisione il numero relativo di copie di singole molecole isoaccettori di tRNA in un pool cellulare di tRNA espressi. Come evidenziato nella pubblicazione complementare7, questa limitazione all'RNA-seq deriva da diverse caratteristiche della struttura dell'RNA e dalla biochimica della preparazione della libreria. Ad esempio, l'attività degli enzimi di ligazione utilizzati per legare i linker di sequenziamento delle estremità 3' e 5' alle molecole di RNA è fortemente influenzata dall'identità dei nucleotidi terminali dell'RNA e dei linker di sequenziamento. Ciò porta a grandi variazioni nell'efficienza delle legature dei linker e a profondi aumenti artefatti nelle letture del sequenziamento 8,9,10.
Una seconda serie di limitazioni deriva dalle proprietà strutturali intrinseche delle molecole di RNA. In particolare, la formazione della struttura secondaria dell'RNA e i cambiamenti dinamici nelle dozzine di modifiche post-trascrizionali dell'RNA dell'epitrascrittoma possono causare la caduta o la mutazione della polimerasi durante la trascrizione inversa. Questi errori provocano una sintesi incompleta o troncata del cDNA o un'alterazione della sequenza dell'RNA. Sebbene entrambi questi fenomeni possano essere sfruttati per mappare strutture secondarie o alcune modifiche, degradano l'accuratezza quantitativa dell'RNA-seq se le successive fasi di preparazione della libreria non riescono a catturare cDNA troncati o se l'elaborazione dei dati elimina sequenze mutate che non corrispondono a un set di dati di riferimento11,12. Inoltre, l'immensa diversità chimica, di lunghezza e strutturale dei trascritti di RNA, così come la mancanza di strumenti per frammentare uniformemente gli RNA lunghi, diminuisce l'applicabilità della maggior parte dei metodi RNA-seq a tutte le specie di RNA13.
Il metodo AQRNA-seq (absolute quantification RNA sequencing) è stato sviluppato per rimuovere molti di questi vincoli tecnici e biologici che limitano l'accuratezza quantitativa7. Riducendo al minimo le distorsioni sequenza-dipendenti nella cattura, nella legatura e nell'amplificazione durante la preparazione della libreria di sequenziamento dell'RNA, AQRNA-seq raggiunge una linearità superiore rispetto ad altri metodi, quantificando con precisione il 75% di una libreria di riferimento di 963 miRNA con un'accuratezza di 2 volte. Questa correlazione lineare tra sequenziamento, conteggio delle letture e abbondanza di RNA è osservata anche in un'analisi di un pool di standard di oligonucleotidi di RNA a lunghezza variabile e in riferimento a metodi ortogonali come il northern blotting. Stabilire la linearità tra il conteggio delle letture di sequenziamento e l'abbondanza di RNA consente ad AQRNA-seq di ottenere una quantificazione accurata e assoluta di tutte le specie di RNA all'interno di un campione.
Di seguito è riportata una descrizione del protocollo per il flusso di lavoro di preparazione della libreria AQRNA-seq e della pipeline di analisi dei dati a valle associata. Il metodo è stato applicato per chiarire le dinamiche dell'abbondanza di tRNA durante la dormienza indotta dalla fame e la successiva rianimazione nel modello di tubercolosi Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). I risultati sono stati presentati per la visualizzazione esplorativa dei dati di sequenziamento, insieme alle successive analisi di clustering e di espressione differenziale che hanno svelato modelli distinguibili nell'abbondanza di tRNA associati a vari fenotipi.

<table><tbody><tr><td>2-chetoglutarato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75890</td><td>Preparare una soluzione funzionante (1 M) e conservarla a -20&ordm; C</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-Trifosfato (ATP)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (componente #: N0437AVIAL)</td><td>NEB M0437M contiene T4 RNA Ligasi 1 (30 U/&mu; l), tampone di reazione dell'RNA ligasi T4 (10X), PEG 8000 (1X) e ATP (100 mM); preparare una soluzione funzionante (10 mM) e conservarla a -20&ordm; C</td></tr><tr><td>AGAROSIO GPG/LE</td><td>AmericanBio</td><td>AB00972-00500</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Ammonio ferro (II) solfato esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2262</td><td>Preparare una soluzione di lavoro (0,25 M) e conservarla a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Bioanalizzatore Analisi di piccoli RNA</td><td>Agilent</td><td>5067-1548&nbsp;</td><td>L'analisi degli small RNA viene utilizzata per verificare la qualità degli RNA in ingresso e l'efficienza delle reazioni enzimatiche (ad esempio, legatura del Linker 1)</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA; 10 mg/mL)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000</td><td>Questo prodotto è stato interrotto il 15/12/2022 ed è stato sostituito con Albumina Ricombinante, Grado di Biologia Molecolare (NEB B9200).</td></tr><tr><td>Cloroformio&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4441-10</td><td></td></tr><tr><td>Demetilasi&nbsp;</td><td>ArrayStar</td><td>AS-FS-004</td><td>Demetilasi viene fornito con il tRNA rtStar Pretrattamento & Kit di sintesi del cDNA del primo filamento (AS-FS-004)</td></tr><tr><td>Miscela di soluzioni di deossinucleotide (dNTP)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L (componente #: N0447LVIAL)</td><td>Questa miscela di soluzioni dNTP contiene concentrazioni equimolari di dATP, dCTP, dGTP e dTTP (10 mM ciascuno)</td></tr><tr>Blocco riscaldante <td>digitale a doppio blocco termico</td><td>VWR Scientific Products</td><td>13259-052</td><td>viene utilizzato con il QIAquick&nbsp; Kit di estrazione del gel&nbsp;</td></tr><tr><td>DyeEx&nbsp; 2.0 Kit di rotazione&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>63204&nbsp;</td><td>Efficace nella rimozione di residui corti (ad esempio, oligo di lunghezza inferiore a 10 bp)</td></tr><tr><td>Elettroforesi Alimentazione</td><td>Bio-Rad Labrotories</td><td>PowerPac 300</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf PCR (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>0030124537</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363611</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico (etanolo), Pure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&nbsp;</td><td>L'etanolo puro viene utilizzato con il kit Oligo Clean e Concentratore di Zymo Research</td></tr><tr><td>Sistema di imaging su gel</td><td>Alpha Innotech</td><td>FluorChem 8900</td><td></td></tr><tr><td>Colorante a caricamento di gel, viola (6X), senza SDS</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (componente #: B7025SVIAL)</td><td>NEB N0556S contiene colorante a caricamento rapido viola 50 bp DNA ladder e caricamento su gel, viola (6X), senza spettrofotometro</td></tr><tr><td>UV-Vis SDS GENESYS 180</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840-309000</td><td>Lo spettrofotometro viene utilizzato per misurare le concentrazioni di oligo utilizzando la legge di Beer</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>Preparare una soluzione di lavoro (1 M; pH = 8 con NaOH) e conservarla a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)&nbsp;</td><td>Prodotti VWR Scientific</td><td>BDH3028&nbsp;</td><td>Preparare una soluzione di lavoro (5 M) e conservarla a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Alcool isopropilico (isopropanolo), Pure</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3032-16</td><td>L'isopropanolo viene utilizzato con il QIAquick&nbsp; Kit di estrazione del gel&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Preparare una soluzione di lavoro (0,5 M) e conservarla a -20&ordm; </td></tr><tr><td>C Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spettrofotometro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 (10X)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (componente #: B7002SVIAL)</td><td>NEB M0264L contiene RecJf (30 U/&mu; L) e NEBuffer 2 (10X); Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oligo pulito & Kit concentratore&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4061&nbsp;</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>PEG 8000 (soluzione al 50%)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (componente #: B1004SVIAL)</td><td>NEB M0437M contiene T4 RNA Ligasi 1 (30 U/&mu; l), tampone di reazione dell'RNA ligasi T4 (10X), PEG 8000 (1X) e ATP (100 mM); preparare una soluzione funzionante (10 mM) e conservarla a -20&ordm; C</td></tr><tr><td>Peltier Termociclatore</td><td>MJ Research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo:cloroformio:isoamil&nbsp; alcol 25:24:1 pH = 5,2&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J62336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript Buffer (5X)</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript Trascrittasi inversa</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick&nbsp; Kit di estrazione del gel&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Questo kit richiede un blocco riscaldante e isopropanolo per funzionare con</td></tr> la <tr><td>scala DNA viola a caricamento rapido da 100 bp</td><td>New England Biolabs</td><td>N0551S (componente #: N0551SVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA viola a caricamento rapido da 50 bp</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (componente #: N0556SVIAL)</td><td>NEB N0556S contiene una scala DNA viola a caricamento rapido da 50 bp e colorante a caricamento di gel, viola (6X), senza SDS</td></tr><tr><td>RecJf&nbsp; (30 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (componente #: M0264LVIAL)</td><td>NEB M0264L contiene RecJf (30 U/&mu; L) e NEBuffer 2 (10X); Conservare a -20 &deg; </td></tr><tr><td>C RNasi Inibitore (murino; 40 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314L&nbsp;( componente #: M0314LVIAL)</td><td>Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; DNA polimerasi&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 contiene SeqAMP&nbsp; DNA polimerasi&nbsp; e SeqAMP&nbsp; Tampone PCR (2X)</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; Tampone PCR (2X)&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 contiene SeqAMP&nbsp; DNA polimerasi&nbsp; e SeqAMP&nbsp; Tampone PCR (2X)</td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina per gamberetti (1 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371L&nbsp;( componente #: M0371LVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; S5881</td><td>Preparare una soluzione di lavoro (5 M) e conservarla a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi (400 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L&nbsp;( componente #: M0202LVIAL)</td><td>NEB M0202L contiene DNA ligasi T4 (400 U/&mu; L) e tampone di reazione della DNA ligasi T4 (10X)Tampone</td></tr> di <tr><td>reazione della DNA ligasi T4 (10X)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L&nbsp;( componente #: B0202SVIAL)</td><td>NEB M0202L contiene DNA ligasi T4 (400 U/&mu; L) e tampone di reazione t4 DNA ligasi (10X)</td></tr><tr><td>T4 RNA ligasi 1 (30 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (componente #: M0437MVIAL)</td><td>NEB M0437M contiene T4 RNA Ligasi 1 (30 U/&mu; L), tampone di reazione della RNA ligasi T4 (10X), PEG 8000 (1X) e ATP (100 mM)Tampone</td></tr> di <tr><td>reazione della RNA ligasi T4 (10X)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (componente #: B0216SVIAL)</td><td>NEB M0437M contiene T4 RNA Ligasi 1 (30 U/&mu; L), tampone di reazione dell'RNA ligasi T4 (10X), PEG 8000 (1X) e ATP (100 mM)</td></tr></tbody></table>

aqrna-seq per la quantificazione di piccoli rna

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq fornisce una relazione lineare diretta tra i conteggi delle letture di sequenziamento e i piccoli numeri di copie di RNA in un campione biologico, consentendo così una quantificazione accurata del pool di piccoli RNA. La procedura di preparazione della libreria AQRNA-seq qui descritta prevede l'uso di linker di sequenziamento progettati su misura e un passaggio per ridurre le modifiche dell'RNA di metilazione che bloccano la processività della trascrizione inversa, con conseguente aumento della resa di cDNA a lunghezza intera. Inoltre, viene presentata un'implementazione dettagliata della pipeline bioinformatica di accompagnamento. Questa dimostrazione di AQRNA-seq è stata condotta attraverso un'analisi quantitativa dei 45 tRNA in Mycobacterium bovis BCG raccolti in 5 giorni selezionati in un corso di 20 giorni di privazione di nutrienti e 6 giorni di rianimazione. In questa sede verranno discussi anche gli sforzi in corso per migliorare l'efficienza e il rigore di AQRNA-seq. Ciò include l'esplorazione di metodi per ovviare alla purificazione del gel per mitigare i problemi del dimero del primer dopo l'amplificazione della PCR e per aumentare la percentuale di letture a lunghezza intera per consentire una mappatura delle letture più accurata. I futuri miglioramenti di AQRNA-seq si concentreranno sulla facilitazione dell'automazione e dell'implementazione ad alto rendimento di questa tecnologia per quantificare tutte le piccole specie di RNA in campioni di cellule e tessuti provenienti da diversi organismi.

Mycobacterium bovis I BCG (bacilli di Calmette et Guérin) ceppo 1173P2 sottoposti a crescita esponenziale sono stati soggetti a una serie temporale (0, 4, 10 e 20 giorni) di carenza di nutrienti, seguita da una rianimazione di 6 giorni in un terreno ricco di sostanze nutritive, come precedentemente presentato in Hu et al.7. Piccoli RNA sono stati isolati da colture batteriche, con tre repliche biologiche, in ciascuno dei cinque punti temporali designati. Le librerie Illumina sono state co...

Il sequenziamento dell'RNA a quantificazione assoluta (AQRNA-seq) è una tecnologia sviluppata per quantificare il panorama di tutti i piccoli RNA nelle miscele biologiche. Qui, vengono dimostrate sia le fasi di preparazione della libreria che quelle di elaborazione dei dati di AQRNA-seq, quantificando i cambiamenti nel pool di RNA di trasferimento (tRNA) in Mycobacterium bovis BCG durante la dormienza indotta dalla fame.

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

Il sequenziamento dell'AQRNA mappa quantitativamente piccoli RNA come microRNA, tRNA e frammenti di tRNA praticamente in qualsiasi campione di cellule o tessuti. Può essere utilizzato per mappare alcune delle 170 modifiche note del tRNA, ma ci sono altri metodi più specifici per la mappatura. È possibile utilizzare AQRNA-seq per scoprire biomarcatori di malattia nell'RNome ed esplorare i meccanismi di traduzione delle proteine a livello di sistema.La maggior parte dei metodi RNA-seq non è in grado di quantificare con precisione l'abbondanza di singole molecole di RNA in un campione. Ciò è causato sia dalle proprietà strutturali dell'RNA, come le strutture secondarie, le modifiche post-trascrizionali, sia dalla biochimica della preparazione della libreria, come le distorsioni di ligazione di mille volte indotte dai nucleotidi terminali sugli RNA. AQRNA-seq è stato sviluppato per superare diverse sfide tecniche e biologiche, limitando la quantificazione accurata dell'abbondanza di RNA nel campione.Rispetto ad altre materie, raggiunge la linearità tra i riconteggi e il numero di copie delle molecole di RNA, quantifica con precisione il 75% di una libreria di riferimento, comprimendo 9

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

I microRNA (miRNA) sono una classe ampiamente conservata di molecole regolatorie. Qui descriviamo un metodo di clonazione dei miRNA che si basa su due potenti fasi di legatura seguite da un sequenziamento ad alto rendimento. Il nostro metodo consente un'accurata quantificazione dell'intero genoma dei miRNA.

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L'obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l'abbondanza dei microRNA circolanti.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Viene fornito un protocollo per quantificare i geni rRNA 16S batterici e i trascritti dai sedimenti costieri tramite PCR in tempo reale. La metodologia comprende la co-estrazione di DNA e RNA; preparazione di RNA privo di DNA; e quantificazione del gene e della trascrizione dell'rRNA 16S tramite RT-q-PCR, inclusa la costruzione di curve standard.

DNA-RNA simultanea Estrazione da sedimenti costieri e la quantificazione dei geni 16S rRNA e trascrizioni da Real-time PCR

Descriviamo un metodo mirato basato sul sequenziamento dell'RNA che include la preparazione di librerie di cDNA indicizzate, l'ibridazione e la cattura con sonde personalizzate e l'analisi dei dati per interrogare i trascritti selezionati per l'espressione genica, le mutazioni e le fusioni geniche. L'RNAseq mirato consente una valutazione rapida ed economica di trascritti selezionati su un sequenziatore desktop.

Mirati RNA Sequencing test per caratterizzare espressione genica e genomica Alterazioni

Questo protocollo descrive un metodo per la mappatura pre-mRNA 3' fine elaborazione siti.

3' fine sequenziamento preparazione libreria con A-seq2

In questo articolo viene descritta una strategia dettagliata per l'isolamento di piccoli RNA, l'arricchimento dei microRNA e la preparazione di campioni per il sequenziamento ad alto valore di velocità effettiva. Viene quindi descritto come elaborare le letture di sequenza e allinearle ai microRNA, utilizzando strumenti open source.

Una pipeline completa per l'isolamento e la sequenza dei microRNA e la loro analisi tramite gli strumenti open source

Gli RNA circolari (circRNA) sono RNA non codificanti che possono avere ruoli nella regolazione trascrizionale e nelle interazioni di mediazione tra proteine. A seguito della valutazione di diversi parametri per la costruzione di librerie di sequenziamento di circuitRNA, è stato compilato un protocollo che utilizza la preparazione della libreria totale di RNA spiaggiata con il pretrattamento di RNase R ed è presentato qui.

Identificazione di RNA circolari mediante il sequenziamento dell'RNA

Vi presentiamo un piccolo protocollo di riparazione della libreria di RNA dettagliato con meno distorsione rispetto ai metodi standard e una maggiore sensibilità per 2'-O-metilRNA. Questo protocollo può essere seguito utilizzando reagenti fatti in casa per risparmiare sui costi o utilizzando kit per comodità.

Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

Presentato qui è un protocollo per la microdissezione laser-cattura (LCM) di tessuti vegetali. LCM è una tecnica microscopica per isolare aree di tessuto in modo privo di contaminazione. La procedura include fissazione del tessuto, incorporamento di paraffina, sessazione, LCM e estrazione dell'RNA. L'RNA viene utilizzato nell'analisi dei trascrimi specifici del tessuto a valle e tempormente risolta.

Microsezione laser-cattura RNA-Sequenziamento per l'analisi dell'espressione genica spaziale e temporale specifica del tessuto nelle piante

Questo lavoro presenta un metodo per quantificare rapidamente e con precisione la pigmentazione addominale di Drosophila melanogaster utilizzando l'analisi di immagine digitale. Questo metodo semplifica le procedure tra l'acquisizione di fenotipi e l'analisi dei dati e include il montaggio del campione, l'acquisizione di immagini, l'estrazione del valore dei pixel e la misurazione del tratto.

Quantificazione della pigmentazione addominale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Scopri la tecnica AQRNA-seq per quantificare piccoli RNA come microRNA e tRNA in campioni biologici. Questo metodo supera i limiti del RNA-Seq tradizionale e permette di studiare la dinamica dei tRNA durante la dormienza in Mycobacterium bovis BCG.

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

Esplora altri video