Name: Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per lisolamento delle isole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Impara la perfusione chirurgica del pancreas suino per l'isolamento delle isole con tecniche di cannulazione aortica e digestione enzimatica. Questo metodo ottimizza la resa e la purezza delle isole per la xenotrapianto.

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<meta charset="utf8"></head><body>Purificazione delle isole suine mediante perfusione chirurgica del pancreas suino

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M NaOH, 100 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS, 500 mL (da 15 a 30 &deg; C)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>1x D-PBS, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 1 L</td><td>Thermo Fisher</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Provette coniche</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430236-6EA</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B [50 mg]</td><td>Millipore Sigma</td><td>PHR1662</td><td></td></tr><tr><td>Antisettico Povidone Iodio 10%</td><td>Millipore Sigma</td><td>25655-41-8</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Gradient Former</td><td>BioRad</td><td>395</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Thermo Fisher</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>COBE Cell Processor</td><td>Ebay</td><td>317690&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio del circuito di digestione, flacone Gibco, 1 L</td><td>Thermo Fisher</td><td>10341001</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Ditizone</td><td>Thermo Fisher</td><td>60-10-6</td><td></td></tr><tr><td>Kit di connessione per formatore di gradiente</td><td>BioRad</td><td>1652008</td><td></td></tr><tr><td>Eparina [1000 U/mL]</td><td>Prodotti medici di emergenza</td><td>0409-2720-01</td><td></td></tr><tr><td>Tampone HEPES (1 M), 100 ml di</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica umana 25%, 100 ml di</td><td>Celprogen</td><td>HSA2001-25-1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Covetrus</td><td>Articolo#:11695067772</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Patterson</td><td>Articolo #:07-894-8462</td><td></td></tr><tr><td>Liberase (100 mg)</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MORTO Kit di vitalità/citotossicità</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte 1.1 Media 500 mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL5020</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex LS 16 Tubing</td><td>Masterfle</td><td>96419-16</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Pompa peristaltica</td><td>Masterflex</td><td>07522-30</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep (2 mg/mL)</td><td>Celprogen</td><td>PS-30-002</td><td></td></tr><tr><td>Pulmozyme (1 mg/mL, 2,5 mL/fialaDornase</td> <td>Alfa</td><td>8931278</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di recupero, PIM(R)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td><td>PIM-R001GMP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Millipore Sigma</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura standard, PIM(S)</td><td>Prodo Laboratories, Inc.</td><td>PIM-S001GMP</td><td></td></tr><tr><td>Tzed&trade; (tiletamina e zolazepam) Iniezione C</td><td>Patterson</td><td>Articolo #: 07-894-6240</td><td></td></tr><tr><td>Università del Wisconsin (UW) Soluzione, 3 L</td><td>Soluzioni di trapianto globali</td><td>1000-0046-06</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Sigma Alderich</td><td>CLS6783-1EA</td><td></td></tr><tr><td>xilazina</td><td>Patterson</td><td>Articolo #: 07-891-6165</td><td></td></tr></tbody></table>

perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

Surgical Perfusion and Isolation of the Porcine Pancreas for Islet Isolation

La configurazione operatoria e la laparotomia della linea mediana sono mostrate nella Figura 1. L'incisione della laparotomia deve essere curva per evitare l'apertura urogenitale (Figura 1B). Quando si installa il divaricatore, fissare il montante per il divaricatore Omni o Bookwalter nell'angolo sinistro inferiore del tavolo. La retrazione ideale comprende due lame divaricatrici per la parete addominale destra, due per la parete addominale sinistra e 1-2 per il colon destro e l'intestino tenue avvolti in un asciugamano sterile (Figura 1C). È possibile utilizzare lame divaricatrici per pareti del corpo, splancniche o malleabili, a seconda della disponibilità di un assistente e delle preferenze dell'operatore. Se non è disponibile un divaricatore Omni o Bookwalter, è possibile utilizzare 1-2 divaricatori Balfour autobloccanti per ritrarre la parete addominale su entrambi i lati. Un assistente può quindi applicare la retrazione al colon destro e all'intestino tenue avvolti in un asciugamano sterile.
La dissezione retroperitoneale effettuata in Figura 2 può essere eseguita con un mix di dissezione smussata e tagliente. Sebbene sia importante ottenere il controllo circonferenziale dell'IVC infrarenale e dell'aorta, questa dissezione non deve essere continuata fino alla biforcazione. La parte intratoracica della procedura è la più impegnativa dal punto di vista tecnico (Figura 3), poiché la lesione dell'IVC intratoracica o retroepatica può causare sanguinamento significativo e oscurare il campo operatorio. Quando si identifica l'aorta toracica discendente, separare senza mezzi termini l'aorta dall'esofago usando il pollice e l'indice. Per evitare l'avulsione delle piccole arterie intercostali e il conseguente sanguinamento, il controllo circonferenziale non è essenziale fintanto che l'aorta toracica discendente è accessibile con uno spazio chiaramente definito per ospitare un morsetto aortico.
L'incannulamento dell'aorta infrarenale viene eseguito utilizzando la tecnica di Seldinger (Figura 4). Questo può essere fatto con l'aorta infrarenale bloccata prossimalmente e distalmente (Figura 4A), o direttamente senza bloccaggio. Fare attenzione a non inserire l'ago attraverso la parete posteriore dell'aorta. Una guaina più grande può essere utilizzata anche se l'aorta è di dimensioni sufficienti. È importante spurgare l'aria dal tubo di prolunga per flebo e collegare il tubo per flebo dalla soluzione UW alla guaina da 10Fr in modo sterile. Assicurarsi che il canale IV sia aperto, anche se il flusso non inizierà fino a quando l'aorta non sarà bloccata (Figura 4B). Quando si esegue la venotomia nell'IVC infrarenale, è importante che il chirurgo primario afferri saldamente l'IVC utilizzando la pinza DeBakey, in modo da non perdere il sito della venotomia e avere un grande volume di sangue versato nel campo operatorio. Una venotomia lontano dal pancreas, con il posizionamento tempestivo dell'aspirazione in piscina, mantiene un campo operatorio incruento con piani tissutali chiari per la pancreatectomia (Figura 4C). Il drenaggio iniziale sarà sangue venoso scuro, ma questo si alleggerirà man mano che il maiale viene dissanguato e la soluzione UW viene perfusa attraverso i visceri. Assicurati di utilizzare un grande contenitore di aspirazione per questa parte della procedura.
I visceri, e in particolare il pancreas, diventeranno sempre più pallidi man mano che la soluzione UW viene perfusa (Figura 5A). Il dotto pancreatico può essere identificato seguendo il percorso del lobo duodenale nel duodeno. Il dotto deve essere diviso tra due fascette di seta per evitare la contaminazione con il contenuto enterico (Figura 5B). Mentre il parenchima pancreatico dovrebbe apparire pallido e senza sangue, il restante tessuto connettivo che circonda il pancreas deve essere pulito prima dell'isolamento delle isole (Figura 5C).
Il pancreas prelevato può quindi essere sottoposto a un processo di isolamento e purificazione delle isole in più fasi (Figura 6). La Figura 7A mostra la distribuzione rappresentativa delle dimensioni delle isole dopo il processo di isolamento e purificazione delle isole. La Figura 7B mostra le isole purificate utilizzando la microscopia in campo chiaro e dopo la colorazione viva/morta, con la colorazione verde e rossa che rappresentano rispettivamente cellule insulari vitali e non vitali. La resa e la purezza delle isole possono essere valutate utilizzando un contatore di cellule insulari. Le rese rappresentative sono fornite da tre isolamenti pancreatici suini indipendenti e sono riassunte nella Figura 7C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig01.jpg"> Figura 1: Assetto operativo. (A) Suino posizionato in posizione supina con l'addome preparato sterile; (B) Laparotomia della linea mediana da xifoide a pube; (C) Retroperitoneo esposto con divaricatore Omni in posizione. Barre della scala = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig02.jpg"> Figura 2: Dissezione retroperitoneale. (A) Dissezione retroperitoneale completa di controllo circonferenziale dell'IVC infrarenale e delle vene renali. Il rettangolo giallo è ingrandito nella Figura 2B; (B) Immagine ingrandita dell'IVC infrarenale e delle vene renali; (C) Vene renali legate. Barre della scala = 2 cm. Abbreviazione: IVC = vena cava inferiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig03.jpg"> Figura 3: Ottenere il controllo sopraceliaco. (A) Emidiaframma destro inciso. Il quadrato giallo è ingrandito nella Figura 3B; (B) Estensione dell'incisione dell'emidiaframma destro per esporre l'IVC intratoracico e l'aorta toracica discendente; (C) Controllo circonferenziale dell'IVC intratoracico ottenuto. Barre della scala = 2 cm. Abbreviazione: IVC = vena cava inferiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig04.jpg"> Figura 4: Incannulamento dell'aorta infrarenale, isolamento viscerale e perfusione. (A) Controllo prossimale e distale dell'aorta infrarenale ottenuto; (B) guaina 10Fr posizionata nell'aorta infrarenale con tecnica di Seldinger; (C) Perfusione viscerale attraverso la guaina aortica infrarenale e drenaggio tramite venotomia e ventosa in IVC infrarenale. Barre della scala = 2 cm. Abbreviazione: IVC = vena cava inferiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig05.jpg"> Figura 5: Pancreatectomia totale. (A) I visceri diventano più pallidi durante la perfusione; (B) dotto pancreatico isolato; (C) Pancreas suino espiantato. Barre della scala = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig06.jpg"> Figura 6: Isolamento e purificazione delle isole isolate. Rappresentazione schematica dell'infusione della soluzione enzimatica, della digestione del pancreas suino, della raccolta dei tessuti, del lavaggio cellulare con Cell Processor, della coltura cellulare e dell'analisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66350/66350fig07.jpg"> Figura 7: Vitalità e resa rappresentativa delle isole dopo la purificazione. (A) Isole suine dopo imaging in campo chiaro ingrandito e colorazione viva/morta. Green mostra le cellule vive; Il rosso indica le cellule morte. Barre di scala = 100μm (B) Distribuzione dell'istogramma delle dimensioni delle isole suine dopo la purificazione. (C) Tabella indicante la purezza e la resa delle isole di tre isolamenti di isole pancreatiche suine. Abbreviazione: IEQ = isolotto equivalente, l'unità standard per la quantificazione degli isolotti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66350/66350fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

Pancreatic islet transplantation is an emerging treatment for type I diabetes; however, it is limited by donor matching and availability. Porcine islet ...

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Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (I parte: la digestione e la raccolta di tessuto pancreatico) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

La fornitura di diabete di tipo 2 isolotti per la ricerca è insufficiente. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare isolotti da pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale. Questo approccio rappresenta un luogo unico per l'ottenimento di isolotti da diabete di tipo 2 e clinicamente abbinati soggetti non diabetici ed in numero sufficiente per gli studi di base e clinica.

Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che producono ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Questo protocollo spiega un metodo per isolare le isole pancreatiche mediante prima perfusione di collagenasi tramite l'ampolla di Vater per digerire il tessuto pancreatico esocrino e una centrifugazione semplificata in gradiente di densità per purificare le isole dai topi.

Isolamento delle isole pancreatiche attraverso la perfusione di collagenasi: un metodo enzimatico per isolare le cellule delle isole pancreatiche

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Ingegneria tissutale di intero pancreas è una sfida a causa delle sue funzioni esocrine ed endocrine. Vi mostriamo un metodo per la dissezione di un pancreas suino intatto e il processo di decellularizzazione successo tramite aspersione di detergenti Triton X-100, sodio desossicolato e desossiribonucleasi.

Isolamento e decellularizzazione di un Pancreas suino intero

L'articolo video riassume la tecnica di pancreatectomia e allotrapianto del pancreas in un modello di sopravvivenza suina di 3 giorni con una descrizione passo-passo del metodo e l'enfasi sui suggerimenti e trucchi chirurgici per affrontare la precaria e delicata anatomia viscerale suina.

Suggerimenti chirurgici e trucchi per eseguire il trapianto di pancreas suino

Qui, forniamo dettagli sull'esecuzione della secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) attraverso la perfusione attraverso il sistema vascolare del topo con un pancreas intatto come tecnica aggiuntiva per valutare la funzione endocrina del pancreas con riduzione di possibili fattori confondenti.

Secrezione di insulina stimolata dal glucosio attraverso la perfusione attraverso il sistema vascolare dei topi con un pancreas intatto

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato per il prelievo chirurgico, la digestione enzimatica e la purificazione con gradiente di densità degli isolotti pancreatici del ratto Lewis, consentendo preparazioni ad alta resa e alta purezza per l'uso diretto in studi di trapianto o in vitro .

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Impara la perfusione chirurgica del pancreas suino per l'isolamento delle isole con tecniche di cannulazione aortica e digestione enzimatica. Questo metodo ottimizza la resa e la purezza delle isole per la xenotrapianto.

Perfusione chirurgica e isolamento del pancreas suino per l'isolamento delle isole

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