Name: Un modello murino tumorale della camera della finestra delle pliche cutanee dorsali per la microscopia intravitale combinata e la risonanza magnetica nella ricerca traslazionale sul cancro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Scopri un modello murino con camera della finestra dorsale per microscopia intravitale combinata a risonanza magnetica nella ricerca traslazionale sul cancro. Questo metodo integra imaging ad alta risoluzione con tecniche clinicamente rilevanti per studiare la risposta tumorale.

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Ringraziamo la Dott.ssa Carla Calçada (Postdoctoral Fellow, Princess Margaret Cancer Centre) e il Dr. Timothy Samuel (Ph.D. Student, Princess Margaret Cancer Centre) per l'aiuto nella coltura delle cellule tumorali e nello sviluppo del protocollo di inoculazione. La dottoressa Kathleen Ma, la dottoressa Anna Pietraszek e la dottoressa Alyssa Goldstein (Animal Research Centre, Princess Margaret Cancer Centre) hanno contribuito allo sviluppo del protocollo chirurgico. Jacob Broske (tecnologo di ingegneria medica, Princess Margaret Cancer Center) e Wayne Keller (Hardware Client Executive, Javelin Technologies - A TriMech Group Company) hanno stampato in 3D le camere delle finestre. James Jonkman (Advanced Optical Microscopy Facility, University Health Network) ha fornito una guida preziosa per l'acquisizione di immagini al microscopio in campo chiaro e a fluorescenza.

Inoculazione guidata del tumore e imaging multimodale nei topi

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

In questo lavoro, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro per eseguire sia la microscopia intravitale che l'imaging clinicamente applicabile (TC, MRI e PET) nello stesso animale. Ciò è stato fatto con l'obiettivo di tradurre i risultati della microscopia preclinica alla clinica mediante la correlazione diretta della microscopia intravitale con le modalità di imaging clinico come la risonanza magnetica. Sebbene i design DSFC convenzionali siano realizzati in metallo 2,3, abbiamo adattato il DSFC per essere compatibile con la risonanza magnetica utilizzando camere a finestra stampate in 3D realizzate con una resina plastica biocompatibile. La registrazione delle modalità è stata realizzata mediante l'uso di marcatori fiduciali per le modalità di imaging clinico e l'ottenimento di un'immagine al microscopio a campo largo per abbinare le posizioni dei marcatori fiduciali sul DSFC con i punti di riferimento vascolari che possono essere visti sull'immagine in microcopia a campo largo e nelle immagini microvascolari al microscopio intravitale ad alta risoluzione. È stato sviluppato un codice MATLAB per la co-registrazione delle modalità, incluso nel File Supplementare 2.
I DSFC non sono nuovi nella ricerca preclinica 2,3,27,29,30,31,32 con alcuni studi che sviluppano DSFC compatibili con la risonanza magnetica in plastiche biocompatibili per la microscopia intravitale e l'imaging clinicamente applicabile 27,29,30,31,32. Tuttavia, questi studi eseguono correlazioni a livello di intero tumore con i risultati della risonanza magnetica e della microscopia intravitale. La novità di questo lavoro è la nostra capacità di co-registrare direttamente le immagini in microcopia intravitale in modalità di imaging clinicamente applicabili utilizzando un attacco di marcatori fiduciali al DSFC che consente l'analisi diretta della correlazione spaziale. Gaustad et al. hanno anche eseguito analisi di correlazione spaziale tra risonanza magnetica e microscopia intravitale; Tuttavia, non sono incluse fasi specifiche e dettagliate del processo di coregistrazione tra le modalità29. Questo lavoro fornisce un protocollo per la correlazione spaziale di più modalità tra loro utilizzando l'attacco dell'anello di marcatura fiduciale e include una pipeline MATLAB.
Ci sono diversi dettagli del design e della procedura DSFC che offrono migliori caratteristiche di imaging e crescita del tumore rispetto ad altri studi simili. Innanzitutto, la maggior parte dei metodi della camera a finestra prevede l'inoculazione del tumore dopo l'intervento chirurgico a camera finestra. Questo viene in genere fatto poiché è più facile centrare il tumore nel FOV della camera finestra; Tuttavia, lavori precedenti hanno dimostrato che questo non è ottimale, portando a una crescita tumorale monostrato "irrealistica" con regressione spontanea in molti casi33. Invece, permettiamo al tumore di crescere senza restrizioni nella pelle per diverse settimane prima dell'impianto di DSFC, il che consente un tumore 3D più realistico con caratteristiche di crescita migliorate33.
Questo design DSFC è anche estremamente leggero, con un peso di 0,83 g, con un ampio FOV (vetrino coprioggetto da 1,2 cm di diametro). Una caratteristica unica del nostro design DSFC è che non include un anello elastico per fissare il vetrino coprioggetti al telaio anteriore. Invece, il vetrino coprioggetti è fissato in modo permanente utilizzando colla polimerizzata UV che consente alla parte inferiore del telaio anteriore di essere completamente piatta. Inoltre, il telaio frontale è fissato sotto la pelle del mouse. Questo è stato fatto per ridurre al minimo la possibilità di qualsiasi intercapedine d'aria tra l'interfaccia tumore-vetro. È stato notato in progetti precedenti che se c'è una lacuna all'interfaccia tumore-vetro, c'è un'alta probabilità di accumulo di liquidi in questa regione. Ciò influisce in modo significativo sui risultati attenuando il segnale della microscopia intravitale, riducendo così la qualità dell'immagine. Inoltre, rende più difficile indirizzare le fette di risonanza magnetica al tumore poiché questo accumulo di liquidi apparirà luminoso nelle scansioni di localizzazione T2w. Ciò rende difficile identificare quali fette stanno visualizzando il tessuto e quali sezioni stanno visualizzando l'accumulo di liquidi nel DSFC. Uno svantaggio di questo design è che se il vetrino coprioggetto si rompe, non può essere facilmente sostituito. Abbiamo anche progettato un telaio frontale realizzato interamente in plastica otticamente trasparente, eliminando così il problema della rottura del vetro34.
Durante questa procedura, diversi passaggi cruciali sono tecnicamente più impegnativi di altri. Un passaggio che può causare difficoltà è durante l'intervento chirurgico DSFC quando si sutura il telaio anteriore alla pelle (passaggi del protocollo 3.18-3.24). È importante mantenere un po' di pelle in più lungo la parte superiore del telaio anteriore del DSFC. Se ciò non viene fatto, la pelle in questa regione perderà l'afflusso di sangue e diventerà necrotica, rovinando così la preparazione. Un altro compito tecnicamente impegnativo è il targeting del pacchetto di fette di risonanza magnetica per includere la parte più superficiale del tessuto sotto il vetro. Se questa fetta non è mirata con precisione alla regione, possono verificarsi effetti di volume parziale con il vetro, portando così a risultati errati della risonanza magnetica. Le superfici irregolari del tessuto sotto il vetro del DSFC possono rendere questa operazione ancora più impegnativa. È importante assicurarsi che la pelle sia tesa all'interno del DSFC per mantenere la superficie del tessuto il più piatta e uniforme possibile per ridurre questa fonte di errore.
Qui abbiamo dimostrato l'uso di questo flusso di lavoro DSFC utilizzando svOCT, che ha un ampio FOV di imaging di 6 x 6 mm2. Questo ampio FOV non è comune in altri tipi di microscopia intravitale, con molti metodi di imaging con FOV di 1 mm2 o inferiore13. Ciò può causare alcune difficoltà durante la co-registrazione dell'immagine di microscopia a campo largo con le immagini di microscopia intravitale ad alta risoluzione, poiché i punti di riferimento microvascolari possono essere difficili da identificare. Per ovviare a ciò, potrebbe essere necessaria un'altra immagine di microscopia a campo largo con un FOV più piccolo (~6 x 6 mm2) che funga da ulteriore passaggio intermedio di co-registrazione tra le modalità di imaging per affinare ulteriormente la regione di interesse rispetto a quella ripresa dalla microscopia intravitale.
In questo lavoro, ci siamo concentrati sull'imaging della microvascolarizzazione tumorale, ma anche altri componenti microambientali del tumore possono essere visualizzati utilizzando questo modello. Ad esempio, è stato dimostrato che la microscopia intravitale è in grado di visualizzare con successo lo stroma tumorale35 e i metodi di risonanza magnetica pesata in diffusione come l'imaging del tensore di diffusione o l'imaging della curtosi di diffusione possono avere la capacità di fornire informazioni sulla struttura dello stroma tumorale 36,37. Questo flusso di lavoro può fornire interessanti opportunità per tradurre le informazioni sui tumori stromali in clinica, co-registrando direttamente le immagini di microscopia intravitale ad alta risoluzione dello stroma tumorale con le misurazioni dello stroma basate sulla risonanza magnetica. Tuttavia, va notato che, poiché questo metodo utilizza punti di riferimento vascolari per la co-registrazione, questi dovrebbero essere presenti anche nelle immagini stromali al microscopio intravitale.
Il flusso di lavoro presentato può rivelarsi un passo importante per colmare il divario tra la microscopia intravitale preclinica e le modalità di imaging clinicamente applicabili. Questo modello può essere utilizzato per convalidare i metodi di imaging clinico con immagini di microscopia intravitale di base, sviluppare nuovi metodi di imaging clinicamente applicabili attraverso il confronto con la microscopia intravitale e monitorare longitudinalmente la risposta dei trattamenti utilizzando più modalità di imaging.

La microvascolarizzazione tumorale è una componente importante del microambiente tumorale che può essere un bersaglio per la terapia e un determinante della risposta al trattamento. In ambito preclinico, la microvascolarizzazione viene tipicamente studiata utilizzando la microscopia intravitale in modelli animali ortotopici o eterotopici con camera a finestra 1,2. Ciò ha diversi vantaggi rispetto agli studi istologici poiché l'imaging viene eseguito su tessuti vivi e il tumore può essere monitorato longitudinalmente per diverse settimane o addirittura mesi 2,3. Questi studi possono sfruttare le capacità di imaging ad alta risoluzione della microscopia intravitale per studiare la somministrazione di terapie al tumore 4,5, le cause della resistenza al trattamento6 e la risposta dei micro vasi a terapie come il trattamento antiangiogenico 7,8 e la radioterapia 2,9.
La microscopia intravitale svolge chiaramente un ruolo importante nella ricerca preclinica sul cancro; Tuttavia, come si possono misurare le caratteristiche microambientali del tumore in clinica? Le informazioni microvascolari sarebbero utili in clinica per misurare l'afflusso di sangue e l'ipossia delle cellule tumorali, che è importante per determinare la resistenza al trattamento in radioterapia10, nonché la capacità della microvascolarizzazione di fornire agenti chemioterapici alle cellule tumorali circostanti11. Ad esempio, in radioterapia, le informazioni spaziali sulla struttura e la funzione della microvascolarizzazione tumorale possono aiutare a personalizzare il piano di trattamento di un paziente regolando il programma di frazionamento o aumentando preferenzialmente la dose alle regioni avascolari e probabilmente ipossiche12.
La microscopia intravitale è in grado di misurare queste importanti caratteristiche microvascolari poiché ha una risoluzione molto elevata (scala di μm); Tuttavia, la sua penetrazione in profondità nel tessuto è limitata a diverse centinaia di micron o pochi millimetri, rendendo al massimo difficile l'implementazione clinica. In effetti, ci sono alcune nuove applicazioni della microscopia intravitale in clinica13; Tuttavia, questi sono ancora limitati agli esami di tessuti vicini alla superficie come la pelle14 o i rivestimenti mucosi/endoteliali di varie cavità corporee tramite cateteri/endoscopi flessibili15,16.
Più comunemente, la microvascolarizzazione viene studiata utilizzando modalità di imaging come la TC17 o la risonanza magnetica18. Queste modalità di imaging clinico possono visualizzare a qualsiasi profondità all'interno del corpo, ma hanno una risoluzione spaziale molto più bassa (scala in mm). Pertanto, è necessario colmare questo divario di risoluzione tra la microscopia intravitale preclinica e le modalità di imaging clinico per portare in clinica informazioni microvascolari dettagliate e ad alta risoluzione19. Sono stati sviluppati diversi metodi di imaging funzionale per migliorare le capacità di imaging microvascolare delle modalità di imaging clinico, come la risonanza magnetica con mezzo di contrasto dinamico (DCE) e la risonanza magnetica con movimento incoerente intravoxel (IVIM)21. Tuttavia, si tratta di metodi basati su modelli che forniscono misurazioni indirette della microvascolarizzazione e quindi devono essere convalidati con appropriate misurazioni "ground truth" della microvascolarizzazione 19,22.
Abbiamo sviluppato un modello murino di tumore con camera a finestra dorsale della plica cutanea (DSFC) per colmare questo divario tra la microscopia intravitale preclinica e le modalità di imaging clinicamente applicabili come la TC e la risonanza magnetica. Il DSFC fornisce l'accesso diretto al tumore per l'imaging di microscopia intravitale ad alta risoluzione attraverso una finestra di vetro, ma anche per l'imaging clinicamente applicabile come la risonanza magnetica, poiché è realizzato con materiali compatibili con la risonanza magnetica (plastica e vetro). Inoltre, un codice MATLAB incluso esegue la co-registrazione 3D multimodale per correlazioni spaziali dirette tra la microscopia intravitale preclinica e le modalità di imaging clinicamente applicabili. Qui descriveremo la progettazione e l'intervento chirurgico per installare il DSFC, nonché la procedura per la co-registrazione della microscopia intravitale e le modalità di imaging clinicamente applicabili.

<table><tbody><tr><td>Materiali per colture cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BxPC-3 Cellule di cancro al pancreas umano</td><td>ATCC (American Type Culture Collection)</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrice di membrana basale, senza LDEV, 10 mL</td><td></td><td>Corning</td> 354234 <td></td></tr><tr><td>Corning Stripettor Ultra Pipet Controller</td><td>Corning</td><td>07-202-350</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato Dulbecco senza calcio, magnesio o rosso fenolo, 500 mL</td><td>di Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (Canada), 500 mL</td><td></td><td>di Penicillina-Streptomicina</td><td></td></tr><tr><td>100x (liquido, stabilizzato, filtrato sterile, testato in coltura cellulare)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x), liquido; con L-Glutammina, 500 mL</td><td>di Gibco</td><td></td><td></td>11875093</tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme, 500 mL</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>Window Chamber Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 mm Glass Coverslip</td><td>Harvard Apparatus&nbsp; &nbsp;</td><td>CS-12R n. 1.5</td><td></td></tr><tr><td>Stampante 3D Connex 500</td><td>Stratasys</td><td>N/A Resina</td><td></td></tr><tr><td>MED610 trasparente biocompatibile</td><td>Stratasys</td><td>&nbsp; RGD810</td><td></td></tr><tr><td>Loctite AA 3105 Colla polimerizzabile UV</td><td>Loctite</td><td>LCT1214249</td><td></td></tr><tr><td>Telaio posteriore della camera della finestra</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore fiduciale della camera della finestra</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cornice frontale della camera della finestra</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Clip di supporto della camera della finestra</td><td>Trimech Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Materiali per inoculazione e chirurgia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Siringhe per insulina SafetyGlide con aghi fissati in modo permanente, 0,5 mL, 29 G x 1/2"</td><td>BD</td><td>CABD305932</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Betadine</td><td></td><td>AP-B002C2R98U</td><td></td></tr><tr><td>Cidex OPA 14 giorni 3,8 L</td><td>ASP</td><td>JOH20394</td><td></td></tr><tr><td>Sottocuscinetti chirurgici monouso 23 pollici x 24 pollici</td><td>Kendall</td><td>7134</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante per gli occhi&nbsp; &nbsp;</td><td>Optixcare</td><td>50-218-8442</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Nair</td><td>&lrm; </td><td></td>061700222611</tr><tr><td>Pinza emostatica Halstead</td><td>Almedic</td><td>7742-A12-150</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Sunbeam&nbsp;</td><td></td><td></td>B086MCN59R</tr><tr><td>Forbici per iride</td><td>Almedic</td><td>7601-A8-690</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>&nbsp; Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc</td><td>NDC 0010-6015-03</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Rag1tm1Mamma&nbsp; Il2rgtm1Wjl/SzJ mouse</td><td>il laboratorio Jackson</td><td>7799</td><td></td></tr><tr><td>Peanut Clipper & Trimmer</td><td>Wahl</td><td>8655-200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sutura chirurgica non assorbibile SOFSILK #5-0 con ago a punta conica da 3/8" (17 mm) (rivestito di cera, seta nera intrecciata, sterile).</td><td>&nbsp; Sintura&nbsp;</td><td>&nbsp; Pinza per schegge VS880</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Almedic</td><td>7725-A10-634</td><td></td></tr><tr><td>MR Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di immobilizzazione della camera della finestra stampato in 3D.</td><td></td><td></td><td>stampato in 3D personalizzato, fare riferimento alla figura 3 per i dettagli.</td></tr><tr><td>Dispositivo di riscaldamento a convezione</td><td>3M Bair Hugger</td><td>70200791401</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di iniezione di farmaci</td><td>Harvard Apparatus&nbsp; &nbsp;</td><td>PY2 70-2131</td><td>PHD 22/2200 Pompa a siringa compatibile con la risonanza magnetica</td></tr><tr><td>Gadovist 1.0</td><td>Bayer</td><td>2241089</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di monitoraggio respiratorio</td><td>SAII</td><td>Modello 1030</td><td>Sistema di monitoraggio e gating compatibile con la risonanza magnetica per piccoli animali.</td></tr><tr><td>Catetere per vena caudale (27 G 0,5")</td> <td>Terumo Medical Corp</td><td>15253<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Optical Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stadio di imaging stampato in 3D Stampato</td><td></td><td></td><td>in 3D personalizzato, fare riferimento alla figura 3 supplementare per i dettagli.</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante flessibile in poliimmide da 12 V 7 W Pellicola riscaldante PI adesiva sottile 25 mm x 50 mm</td><td>BANRIA&nbsp;</td><td>B09X16XCVS</td><td>Elemento riscaldante utilizzato per la regolazione della temperatura del corpo del mouse.</td></tr><tr><td>Alimentatore CC</td><td>BK Precisione</td><td>1761</td><td>Utilizzato per alimentare l'elemento riscaldante.</td></tr><tr><td>Leica MZ FLIII</td> Leica <td>Microsystems</td><td>15209</td><td></td></tr><tr><td>svOCT sistema</td><td></td><td></td> di <td>imaging realizzato internamente. I dettagli sono disponibili nella referenza 23.</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Software</td><td>MathWorks</td><td>R2020A</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello murino tumorale della camera della finestra delle pliche cutanee dorsali per la microscopia intravitale combinata e la risonanza magnetica nella ricerca traslazionale sul cancro

A Dorsal Skinfold Window Chamber Tumor Mouse Model for Combined Intravital Microscopy and Magnetic Resonance Imaging in Translational Cancer Research

L'imaging intravitale preclinico come la microscopia e la tomografia a coerenza ottica si sono dimostrati strumenti preziosi nella ricerca sul cancro per visualizzare il microambiente tumorale e la sua risposta alla terapia. Queste modalità di imaging hanno una risoluzione su scala micron, ma hanno un uso limitato in clinica a causa della loro ridotta profondità di penetrazione nei tessuti. Le modalità di imaging più clinicamente applicabili come TC, risonanza magnetica e PET hanno una profondità di penetrazione molto maggiore, ma hanno una risoluzione spaziale relativamente inferiore (scala mm). 
Per tradurre i risultati dell'imaging intravitale preclinico nella clinica, è necessario sviluppare nuovi metodi per colmare questo divario di risoluzione da micro a macro . Qui descriviamo un modello murino di tumore con camera a finestra dorsale della plica cutanea progettato per consentire l'imaging preclinico intravitale e clinicamente applicabile (TC e RM) nello stesso animale e la piattaforma di analisi delle immagini che collega questi due diversi metodi di visualizzazione. È importante sottolineare che l'approccio della camera a finestra descritto consente di co-registrare le diverse modalità di imaging in 3D utilizzando marcatori fiduciali sulla camera a finestra per una concordanza spaziale diretta. Questo modello può essere utilizzato per la convalida dei metodi di imaging clinico esistenti, nonché per lo sviluppo di nuovi metodi attraverso la correlazione diretta con i risultati intravitali ad alta risoluzione "ground truth". 
Infine, la risposta tumorale a vari trattamenti - chemioterapia, radioterapia, terapia fotodinamica - può essere monitorata longitudinalmente con questa metodologia utilizzando modalità di imaging precliniche e clinicamente applicabili. Il modello murino tumorale della camera della finestra della plica dorsale e le piattaforme di imaging qui descritte possono quindi essere utilizzati in una varietà di studi di ricerca sul cancro, ad esempio nella traduzione dei risultati della microscopia intravitale preclinica in modalità di imaging più clinicamente applicabili come la TC o la risonanza magnetica.

La tomografia a coerenza ottica con varianza speckle (svOCT) è stata eseguita per ottenere immagini microvascolari 3D ad ampio campo visivo (FOV) (6 x 6 mm,2 laterali x 1 mm di profondità). Per ottenere queste immagini, è stato utilizzato un sistema OCT a sorgente spazzata precedentemente descritto basato su un interferometro in quadratura23. Le immagini OCT sono state acquisite unendo due scansioni 3 x 6 mm2 FOV adiacenti lateralmente. Ogni B-scan consisteva in 400 A-scan ed è stato eseguito 24 volte per posizione (a 25 ms di distanza) per consentire un'accurata elaborazione della varianza dello speckle come descritto nel nostro precedente lavoro24.
Per co-registrare il set di dati MRI con il set di dati svOCT microvascolare, sono stati eseguiti diversi passaggi. Il primo passaggio è stato eseguito nel passaggio 5.12 ed è illustrato nella Figura 4. Questo passaggio co-registra i due set di dati lungo la direzione della profondità (asse z nella Figura 4). Per co-registrare i set di dati lungo le dimensioni laterali (xy-plane nella Figura 4), vengono utilizzati l'anello del marcatore fiduciale insieme a una serie di due registrazioni affini basate su punti. In primo luogo, il set di dati della risonanza magnetica viene co-registrato nell'immagine di microscopia in campo chiaro confrontando le posizioni dei marcatori fiduciali nell'anello, con i corrispondenti divot attorno al perimetro della finestra di vetro sul telaio frontale (punti verdi nella Figura 5B, C). Successivamente, i punti di riferimento vascolari identificabili sia nel set di dati microvascolari svOCT che nell'immagine di microscopia in campo chiaro vengono utilizzati per co-registrare l'immagine in campo chiaro (e il corrispondente set di dati MRI) nel set di dati svOCT (punti blu nella Figura 5A, B). Pertanto, l'immagine al microscopio in campo chiaro funge da immagine a risoluzione intermedia che contiene caratteristiche sia della risonanza magnetica (posizioni dei divot per i marcatori fiduciali) che dell'immagine microvascolare svOCT (punti di riferimento microvascolari) per consentire la co-registrazione multimodale su risoluzioni di imaging molto diverse.
Le immagini del successo della co-registrazione tra tutte e tre le modalità (imaging microvascolare, microscopia a campo largo e risonanza magnetica) per un topo di preparazione della camera finestra senza tumore (pelle nuda sana) e tumore sono mostrate rispettivamente nella Figura 6A-C e nella Figura 6D-F. Una volta che tutte e tre le modalità sono state co-registrate, è possibile eseguire l'analisi di correlazione. Per sfruttare i set di dati co-registrati, le correlazioni spaziali devono essere eseguite su base voxel per voxel o utilizzando tecniche di media appropriate su volumi di interesse selezionati. La Figura 7 mostra alcuni risultati rappresentativi della correlazione tra le metriche microvascolari derivate da svOCT e le metriche macrovascolari funzionali derivate dalla risonanza magnetica. Questi grafici includono i dati di due topi portatori di tumore e di un topo "sano" a pelle nuda. Questi grafici sono stati generati utilizzando una tecnica VOI (sliding window volume of interest) di 1 mm, 2 laterale x 500 m di profondità μcon una dimensione del gradino laterale di 500 μm, con ogni punto che rappresenta una posizione del VOI. Per il topo sano, l'analisi vascolare è stata limitata a una regione di interesse di 3 x 3 mm2 al centro del FOV per corrispondere all'estensione spaziale 3D dei tumori esaminati. Uno studio più dettagliato che coinvolge le correlazioni tra svOCT e risonanza magnetica utilizzando questo metodo di analisi può essere trovato nel nostro recente lavoro22.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66383/66383fig06.jpg"> Figura 6: Set di dati di imaging sano e tumorale co-registrati. La riga superiore mostra lo svOCT codificato in profondità di colore (A), (B) l'immagine di microscopia in campo chiaro co-registrata con la regione di analisi mostrata dalla linea tratteggiata blu e (C) la mappa dei parametri DCE-MRI co-registrata per un topo sano a pelle nuda. La riga inferiore mostra lo svOCT codificato in profondità di colore (D), l'immagine di microscopia in campo chiaro co-registrata (E) con il contorno del tumore mostrato dalla linea tratteggiata blu e (F) la mappa dei parametri DCE-MRI co-registrata per un topo portatore di tumore. I voxel neri in C e F sono rispettivamente al di fuori della regione di analisi e del tumore e, pertanto, non sono considerati. Barre della scala = 1 mm. Abbreviazioni: svOCT = tomografia a coerenza ottica con varianza speckle; DCE-MRI = risonanza magnetica dinamica con mezzo di contrasto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/66383fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La Figura 7A mostra il parametro k transdella risonanza magnetica rispetto alla frazione di volume vascolare (VVF) misurata da svOCT. VVF è la proporzione di tessuto occupata dai vasi e ktrans è la costante di velocità per il gadolinio che si sposta dallo spazio intravascolare allo spazio extravascolare. ktranssi ottiene adattando il modello di Toft alle curve di concentrazione del tempo di gadolinio su una base voxel per voxel25,26. Le misurazioni VVF da svOCT mostrano che i tumori hanno una VVF più piccola rispetto al tessuto sano, indicando potenzialmente la presenza di regioni scarsamente vascolarizzate all'interno del tumore. Poiché ktransdipende dal flusso sanguigno, dalla permeabilità vascolare e dalla superficie capillare25,26, ci si aspetta una correlazione positiva tra ktranse VVF poiché un VVF più grande implica una superficie vascolare e un flusso sanguigno più ampi. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi come gli esperimenti di stravaso del destrano per chiarire ulteriormente l'impatto della permeabilità dei vasi tumorali in questa relazione27.
La Figura 7B mostra la correlazione tra il tempo di miglioramento del contrasto di picco (TTP) della risonanza magnetica e la distanza media di svOCT dal vaso più vicino (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;">). Il TTP è una metrica semiquantitativa che misura il tempo necessario affinché la curva di concentrazione del tempo di gadolinio raggiunga il suo valore massimo e questo è calcolato su base voxel per voxel26. È <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> una metrica microvascolare svOCT che misura la distanza media dal vaso più vicino all'interno del volume analizzato22. In generale, c'è un tessuto sano più piccolo <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> rispetto al tessuto tumorale, indicando che la microvascolarizzazione sana è più densamente impacchettata portando a un tessuto ossigenato più uniformemente e il tessuto tumorale è meno ben vascolarizzato28. I valori più elevati <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;"> nel tessuto tumorale possono indicare la presenza di regioni di tessuto avascolare. La Figura 7B mostra una correlazione positiva tra TTP e <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66383/66383eq02.jpg" style="margin: auto;">. Ciò dimostra che il tessuto sano è ben vascolarizzato con il gadolinio che entra ed esce dal tessuto in modo efficiente e rapido. Tuttavia, la microvascolarizzazione tumorale è più malformata con distanze intervascolari maggiori, il che aumenta il tempo necessario al gadolinio per raggiungere il tessuto, determinando così un aumento della TTP.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66383/66383fig07.jpg"> Figura 7: Macro da risonanza magnetica a svOCT e correlazioni spaziali microvascolari. Questi grafici contengono i risultati di due topi portatori di tumore e di un topo sano a pelle nuda utilizzando un VOI con finestra scorrevole x 1 x 1 mm2 laterale × 500 μm di profondità con una dimensione del passo di 500 μm, con ogni punto che rappresenta i valori medi della metrica data per una posizione del VOI della finestra scorrevole. Abbreviazioni: svOCT = tomografia a coerenza ottica con varianza speckle; DCE-MRI = risonanza magnetica dinamica con mezzo di contrasto; VOI = volume di interesse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/66383fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: file STL 3D dei componenti della camera della finestra. Un file zip contenente i 4 componenti della camera DSFC (telaio anteriore, telaio posteriore, clip di supporto e anello di marcatura fiduciale), che è stato utilizzato per stampare in 3D le parti. Abbreviazione: DSFC = camera della finestra dorsale della plica cutanea. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20file%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Script MATLAB per la co-registrazione di immagini multimodali. Questo script MATLAB (Multimodal_Image_Register.m) prende in considerazione la microscopia in campo chiaro, i dati delle immagini microvascolari e le immagini RM strutturali e funzionali (mappe dei parametri DCE e/o IVIM) e produce tutti i set di dati co-registrati nel set di dati microvascolare. Lo script MATLAB è scritto per supportare i seguenti formati di file: MRI - .dcm, svOCT - .mat e microscopia - .jpg, o . TIF. Il codice MATLAB è scritto per adattarsi alle dimensioni/risoluzioni dei file descritte nella sezione del protocollo: MRI - campo visivo di 32 x 32 mm con matrice 64 x 64 per una risoluzione in piano di 0,5 x 0,5 mm; 10 sezioni di imaging contigue, microscopia - Immagine 2D con campo visivo di &gt;1,5 cm2 (qualsiasi risoluzione accettabile) e svOCT - Campo visivo 6 x 6 mm Risoluzione 7,5 μm. Il codice MATLAB deve essere modificato se vengono utilizzati diversi formati di file, risoluzione dell'immagine o campi visivi di imaging. Abbreviazioni: DCE = contrasto dinamico; IVIM = movimento incoerente intravoxel; MRI = risonanza magnetica; svOCT = tomografia a coerenza ottica con varianza speckle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Multimodal_Image_Register.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S1: Suture temporanee per fissare la camera della finestra alla pelle del topo. La sutura inizia da (1) e passa attraverso la pelle del lato anteriore del topo e attraverso il telaio anteriore della camera della finestra. (2) La sutura passa quindi attraverso la pelle posteriore del topo e fuori dal telaio posteriore della camera della finestra. La sutura viene quindi infilata indietro attraverso il telaio posteriore, (3) nella pelle posteriore, attraverso il telaio anteriore e (4) di nuovo fuori dalla pelle anteriore. (5) La sutura viene quindi riportata indietro attraverso entrambi i telai DSFC e gli strati cutanei. (6) Infine, la sutura viene riportata indietro attraverso il foro superiore della camera della finestra e tutti gli strati della pelle. L'assemblaggio DSFC + pelle viene quindi unito stringendo e annodando le suture a (1). Abbreviazione: DSFC = camera della finestra dorsale della plica cutanea. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S2: Posizionamento ottimale delle suture permanenti. Le suture permanenti devono essere infilate attraverso la pelle/telaio anteriore fuori dalla pelle/telaio posteriore, indietro attraverso l'intero assemblaggio e annodate nella parte anteriore. Ogni numero rappresenta una sutura individuale. Le suture devono essere posizionate nell'ordine dei numeri per applicare uniformemente una pressione all'intero gruppo mentre è fissato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura S3 supplementare: Tavolino stampato in 3D per l'imaging al microscopio intravitale. (A) Per l'imaging al microscopio intravitale viene utilizzato un tavolino stampato in 3D con attacco per anestesia gassosa isoflurano. (B) La camera della finestra è fissata al tavolino da tre bulloni per immobilizzarla ed eliminare qualsiasi movimento respiratorio. (C) Due elementi riscaldanti collegati in serie a una fonte di alimentazione CC sono incollati sul lato inferiore del tavolino per mantenere la temperatura corporea del topo durante l'anestesia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66383/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

La traduzione dei risultati della microscopia intravitale è messa a dura prova dalla sua penetrazione a bassa profondità nei tessuti. Qui descriviamo un modello murino a camera a finestra dorsale che consente la co-registrazione della microscopia intravitale e delle modalità di imaging clinicamente applicabili (ad es. TC, MRI) per la correlazione spaziale diretta, semplificando potenzialmente la traduzione clinica dei risultati della microscopia intravitale.

Un modello murino tumorale della camera della finestra delle pliche cutanee dorsali per la microscopia intravitale combinata e la risonanza magnetica nella ricerca traslazionale sul cancro

Preclinical intravital imaging such as microscopy and optical coherence tomography have proven to be valuable tools in cancer research for visualizing the ...

L'imaging intravitale preclinico ha una risoluzione molto elevata, ma una penetrazione in profondità limitata nel tessuto, il che lo rende molto buono per gli studi di imaging preclinico. D'altra parte, la risonanza magnetica è molto più applicabile clinicamente e ha una maggiore penetrazione in profondità, ma una risoluzione spaziale molto bassa. L'obiettivo di questo studio è correlare queste due modalità tra loro al fine di tradurre meglio i nostri risultati dalla microscopia intravitale preclinica alla clinica tramite risonanza magnetica.I metodi di imaging sensibili alla perfusione nella risonanza magnetica e nella biofotonica, tra cui la tomografia a coerenza ottica e il sistema geografico, stanno rivelando come la microvascolarizzazione influisce sulla risposta del tumore alla radioterapia ipofrazionata. La stampa 3D sta anche aiutando attraverso la produzione di strumenti personalizzati a costi contenuti, facilitando gli studi longitudinali. Infine, l'analisi delle immagini AI sta facilitando l'identificazione di nuovi biomarcatori predittivi della radioterapia.Abbiamo fatto diverse scoperte riguardanti la risposta del tumore alla radioterapia ipofrazionata, tra cui, più recentemente, la cinetica temporale delle metriche di risposta tissutale derivate dall'IA sia radiobiologicamente significative che astratte. Inoltre, abbiamo dimostrato la promessa di un'esecuzione più accurata dell'imaging multimodale, correlando sia la risonanza magnetica, la tomografia macroscopica che quella a coerenza ottica, le metriche microscopiche e derivate dall'angiografia. Estendendo la durata efficace degli studi longitudinali, possiamo identificare meglio i biomarcatori predittivi per la risposta al trattamento del tumore a lungo termine.Inoltre, migliorando la robustezza della co-registrazione tra le modalità di imaging macroscopico clinicamente disponibili e le modalità di imaging microscopico preclinico, possiamo migliorare la traducibilità dei nostri risultati dal laboratorio al letto del paziente. Durante una radioterapia stereotassica corporea, alte dosi di radiazioni erogano un numero ridotto di frazioni. Un potenziale bersaglio radiobiologico associato all'aumento della morte cellulare nella SVRT è la microvascolarizzazione tumorale.Combinando l'angiografia ottica ad alta risoluzione e la risonanza magnetica, vogliamo abilitare l'imaging microvascolare RM funzionale per la pianificazione del trattamento SVRT specifico per il paziente e per migliorare i risultati.

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Viene stabilito un nuovo modello di sferoide tridimensionale basato sull'interazione eterotipica delle cellule tumorali e dei fibroblasti stromali. Qui, presentiamo la cocoltura di cellule tumorali e fibroblasti stromali, imaging time-lapse, e microscopia confocale per visualizzare la formazione di sferoidi. Questo modello tridimensionale offre una piattaforma pertinente per studiare le interazioni tumora-stroma e testare le terapie antitumorali.

Un nuovo modello di spheroid del tumore strutturato in 3D modulato come fibromastro per studiare l'interazione tumora-stroma e la scoperta di farmaci

Scopri un modello murino con camera della finestra dorsale per microscopia intravitale combinata a risonanza magnetica nella ricerca traslazionale sul cancro. Questo metodo integra imaging ad alta risoluzione con tecniche clinicamente rilevanti per studiare la risposta tumorale.

Un modello murino tumorale della camera della finestra delle pliche cutanee dorsali per la microscopia intravitale combinata e la risonanza magnetica nella ricerca traslazionale sul cancro (Video) | JoVE Journal

Un modello murino tumorale della camera della finestra delle pliche cutanee dorsali per la microscopia intravitale combinata e la risonanza magnetica nella ricerca traslazionale sul cancro

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