Name: Colorazione rossa di Picrosirius per la valutazione istopatologica semiquantitativa della deposizione di collagene in modelli murini di rigetto cronico dellallotrapianto polmonare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T12:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: Scopri la colorazione rossa di Picrosirius per valutare semiquantitativamente la deposizione di collagene in modelli murini di rigetto cronico dell'allotrapianto polmonare. Questo metodo distingue fibre spesse e sottili.

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Tutti i protocolli per gli animali sono conformi ai principi etici delle 3R per la ricerca umana sugli animali e sono stati approvati dal comitato etico veterinario locale (Veterinäramt Kanton Zürich, Svizzera, studio numero 45/2014). Allo stesso modo, i lettori devono ottenere l'autorizzazione dalle istituzioni competenti prima di eseguire qualsiasi procedura sugli animali da laboratorio.
1. Acquisizione del campione
<ol>
	<li>Condurre esperimenti sugli animali in base alle esigenze individuali e alla rispettiva approvazione etica. Un singolo microchirurgo esegue tutti gli interventi chirurgici senza ulteriori tempi di ischemia prolungati. NOTA: Per una riproduzione dei nostri risultati rappresentativi, procurarsi topi maschi adulti C57BL/6J, C57BL/10J e BALB/c specifici privi di agenti patogeni del peso di 27-30 g dai Charles River Laboratories. Per gli isotrapianti, utilizzare animali C57BL/6J sia come donatori che come riceventi. Nel modello minore non corrispondente, trapiantare i polmoni del donatore C57BL/10J a riceventi C57BL/6J. Nel modello principale non corrispondente, trapiantare i polmoni del donatore BALB/c a riceventi di C57BL/6J e iniettare dopo l'intervento ciclosporina (10 mg/kg/die) e metilprednisolone (1,6 mg/kg/die) per via sottocutaneaal giorno 5. Utilizzare una soluzione salina per la perfusione e recuperare i polmoni dopo 8 settimane (56 giorni).</li>
	<li>Per l'eutanasia, intubare l'animale con un catetere da 20 G e ventilarlo con O2 integrato con isoflurano al 2%-3%. Confermare una profondità sufficiente dell'anestesia in base all'assenza di una risposta a un pizzico della zampa.</li>
	<li>Eseguire una laparosternotomia mediana incidendo la parete addominale con le forbici chirurgiche e tagliando la lunghezza dello sterno per esporre il cuore. Identificare la vena cava inferiore e l'appendice atriale sinistra in base alla loro posizione anatomica.</li>
	<li>In rapida successione, tagliare la vena cava inferiore e l'appendice atriale sinistra con forbici chirurgiche e perfondere l'animale con 3-5 ml di NaCl allo 0,9% attraverso la radice dell'arteria polmonare con una siringa per rimuovere tutto il sangue dalla circolazione polmonare. NOTA: L'eutanasia deve essere eseguita secondo la rispettiva approvazione etica. Altri metodi possono essere applicati allo stesso modo. Si raccomanda di rimuovere completamente il sangue dalla circolazione polmonare, cosa che può essere eseguita anche per perfusione dopo l'arresto circolatorio.</li>
	<li>Rimuovere i polmoni perfusi usando le forbici.</li>
	<li>Per la conservazione, incubare i campioni in formalina al 4%. Iniettare la soluzione di formalina direttamente nel bronco e nel sistema vascolare polmonare. Immergere i campioni in formalina e lasciarli incubare per almeno 6 ore. NOTA: Per il gonfiaggio del polmone con formalina, è necessario applicare una procedura standardizzata per ottenere risultati comparabili. Esempi di protocolli per tali procedure sono pubblicati altrove10,11.</li>
	<li>Trimmare l'organo in base alle esigenze sperimentali. Tagliare trasversalmente i polmoni a metà per catturare tutte le parti dell'albero bronchiale in una sezione.</li>
	<li>Trasferire i campioni a un processatore automatico di tessuti per la disidratazione nella sequenza alcolica, la chiarificazione in xilolo e rivestimento di paraffina come segue: 70% etanolo, 70% etanolo, 80% etanolo, 96% etanolo, 100% etanolo (1 ora ciascuno), 100% etanolo, 100% etanolo, xilolo (2 ore ciascuno), xilolo (1 ora) e paraffina 3 volte per 2 ore.</li>
	<li>Fondere la paraffina e incorporare i campioni con l'orientamento corretto nelle cassette di inclusione in poliossimetile. Fare attenzione a incorporare i campioni con la superficie tagliata rivolta verso il basso. Utilizzare un microtomo rotante per tagliare sezioni da 5 μm consecutivamente. Lasciare asciugare i vetrini per 24 ore a 37 °C prima di procedere con la lavorazione.</li>
</ol>
2. Deparaffinazione e idratazione dei vetrini di paraffina
<ol>
	<li>Rimuovere la paraffina incubando i campioni 2 volte in xilolo al 100% per 5 minuti ciascuno. ATTENZIONE: Xylol è infiammabile e pericoloso per la salute. Utilizzare solo sotto la cappa aspirante.</li>
	<li>Idratare i campioni in etanolo al 100%, etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 70% ed etanolo al 50% per 2 minuti ciascuno. Quindi, lavare per 2 minuti in acqua distillata.</li>
</ol>
3. Colorazione con rosso Picrosirius
<ol>
	<li>La colorazione scivola per 8 minuti nella soluzione di emalum di Meyer. Lavare gli scivoli per 10 minuti sotto l'acqua corrente del rubinetto.</li>
	<li>Incubare i vetrini per 1 ora in soluzione di Picrosirius Red. Per la soluzione di rosso Picrosirius, utilizzare una soluzione colorante premiscelata o utilizzare lo 0,1% di rosso diretto 80 o rosso Sirius F 3B (CI 35780) diluito in acido picrico saturo. ATTENZIONE: L'acido picrico è infiammabile e altamente esplosivo e deve essere trattato con cura. NOTA: Sono disponibili molti fornitori diversi per i kit di colorazione Picrosirius Red, come elencato nella tabella dei materiali. Sii consapevole delle differenze di prezzo e dei metodi di colorazione e rispetta sempre le istruzioni dei fornitori. Si consiglia di utilizzare solo kit di colorazione con l'indice di colore specifico per Sirius Red F 3B (CI 35780).</li>
	<li>Immergere i vetrini 5x-10x in una soluzione di acido acetico (0,5%). Agitare delicatamente i vetrini per rimuovere fisicamente la soluzione.</li>
	<li>Disidratare i vetrini in etanolo al 95%, etanolo al 100%, etanolo al 100%, xilolo al 100% e xilolo al 100% per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Incorporare aggiungendo una goccia di terreno di montaggio su ciascun campione e coprire con un vetrino coprioggetti. Lasciare asciugare i vetrini sotto una cappa aspirante.</li>
</ol>
4. Digitalizzazione ed elaborazione delle immagini
<ol>
	<li>Focalizzare i campioni al microscopio ottico con un software di imaging appropriato fino a quando l'immagine diventa chiara e nitida. Aggiungi un filtro polarizzatore e regola il grado di polarizzazione fino a quando lo sfondo non è completamente scuro o nero. Quando lo sfondo è il più scuro possibile, si ottiene la corretta polarizzazione. NOTA: È anche possibile visualizzare la colorazione di Picrosirius Red con luce trasmessa convenzionale e senza filtro polarizzatore. A tale scopo, si consiglia di utilizzare Sirius Red con Fast Green, poiché è stato dimostrato che è più sensibile del solo Sirius Red12,13. Tuttavia, la microscopia polarizzante è necessaria per distinguere tra fibre di collagene spesse e sottili.</li>
	<li>Scansiona tutti i campioni completamente con un ingrandimento di 20x ed esporta come .tiff. Trasferimento al software Fiji14. Assicurati di pulire correttamente i vetrini in anticipo e di utilizzare impostazioni standardizzate per quanto riguarda il tempo di esposizione e l'intensità della sorgente luminosa.</li>
	<li>Circondare manualmente il campione e ritagliarlo nel software utilizzando Modifica &gt; Cancella esterno. Misurare la superficie totale facendo clic su Analizza &gt; Misura. NOTA: La selezione dello scomparto da misurare è un passaggio fondamentale per creare risultati affidabili e comparabili. Digitalizzando e selezionando l'intero campione, viene visualizzata una buona sezione trasversale e i tessuti eterogenei vengono considerati nel loro insieme. Tuttavia, è anche possibile limitarsi a zone specifiche all'interno dei campioni, come la pleura o i singoli bronchi. Tieni presente di selezionare sempre gli scomparti da confrontare in modo standardizzato. Nel caso in cui i campioni mostrino una grande variabilità nella ventilazione, è consigliabile escludere l'area dello spazio aereo dal compartimentoanalizzato 15.</li>
	<li>Misurare il contenuto totale di collagene per campione utilizzando la soglia del colore facendo clic su Immagine &gt; Regola &gt; soglia colore e regolare le impostazioni facendo clic su Analizza &gt; Analizza particelle. Imposta dimensione = 1 - Infinito, Cancella, Riepiloga. Luminosità = 35 - 255. Tonalità = 2 - 130 NOTA: Un'impostazione ragionevole delle soglie di colore è fondamentale per ottenere risultati affidabili.</li>
	<li>Ripetere per le fibre di collagene spesse e sottili regolando la tonalità come fibre di collagene spesse rosse <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66395/66395eq01.jpg" style="margin: auto;"> (tonalità 2-30) e fibre di collagene sottili giallo-verdi <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66395/66395eq01.jpg" style="margin: auto;"> (tonalità 31-130). Il risultato sarà l'area dei pixel macchiati.</li>
	<li>Configura la macro per l'elaborazione automatizzata facendo clic su Plug-in &gt; Macro &gt; Registra e ripeti con tutti i campioni.</li>
	<li>Per ricevere i valori finali standardizzati in base all'area superficiale della sezione trasversale, dividere l'area dei pixel colorati per tutti i parametri per l'area superficiale totale misurata rispettivamente nei passaggi 4.3 e 4.5 per ciascun campione.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione del collagene nella fibrosi polmonare murina mediante colorazione rossa Picrosirius

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<li>vander Ploeg, E. A., Melgert, B. N., Burgess, J. K., Gan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+biomarkers+of+fibrosis+in+chronic+lung+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Rev+%28Orlando%29%22%5BJournal%5D)">The potential of biomarkers of fibrosis in chronic lung allograft dysfunction.</a> Transplant Rev (Orlando). 35 (3), 100626(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Acido acetico</td><td>Honeywell, Charlotte, USA</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germania</td><td>4633000956 (numero di serie)</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti 1.5</td><td>Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>KCY5.1</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide 37%</td><td>Fisher Scientific, Leicestershire, Regno Unito</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di emalum di Meyer</td><td>Merck, Darmstadt, Germania</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Solution</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Germania</td><td>13422</td><td>alternative utilizzabili: ab150681, abcam, Cambridge, Regno Unito; SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City US</td></tr><tr><td>Filtro polarizzatore</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germania</td><td>000000-1121-813</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotante, HistoCore AUTOCUT</td><td>Leica, Wetzlar, Germania</td><td>149AUTO00C1, 14051956472</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Histokitt mezzo di montaggio</td><td>Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Plast Paraffina</td><td>Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>6642.5</td><td></td></tr><tr><td>Cassette per inclusione di rotilabo, POM</td><td>Roth, Karlsruhe, Germania</td><td>K113.1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Adhesion Microscope</td><td>epredia, Portsmouth, Regno Unito</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Processor&nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Germania</td><td>TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji versione software 2.14.0/1.54f</td><td>Software di imaging open source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN 3.4.91</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

colorazione rossa di picrosirius per la valutazione istopatologica semiquantitativa della deposizione di collagene in modelli murini di rigetto cronico dell'allotrapianto polmonare

Picrosirius Red Staining for Semiquantitative Histopathologic Evaluation of Collagen Deposition in Murine Models of Chronic Lung Allograft Rejection

Il protocollo sopra descritto consente una valutazione semiquantitativa oggettiva della deposizione di collagene nel tessuto polmonare murino. Il rimodellamento fibrotico è il segno fisiopatologico del rigetto cronico dopo trapianto di polmone. Pertanto, la colorazione Picrosirius Red è stata applicata in modelli di rigetto cronico dell'allotrapianto polmonare utilizzando il trapianto di polmone ortotopico murino sinistro. Il trapianto di polmone maggiore MHC-mismatched da un donatore di BALB/c a un ricevente di C57BL/6 ...

Colorazione rossa di Picrosirius per la valutazione istopatologica semiquantitativa della deposizione di collagene in modelli murini di rigetto cronico dell'allotrapianto polmonare

Fibrosis is the pathophysiologic hallmark of chronic rejection after lung transplantation and the foremost hurdle to long-term recipient survival. Several ...

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Questo video descrive la colorazione con rosso picrosirius dei tessuti fibrotici per rilevare l'eccessiva deposizione di collagene nelle sezioni di tessuto fibrotico. La tecnica di colorazione aiuta a valutare l'espressione del collagene nelle malattie del tessuto connettivo.

Colorazione con polarizzazione rossa Picrosirius: una tecnica per rilevare la fibrosi nelle sezioni di tessuto cardiaco utilizzando la microscopia a campo chiaro

Qui, presentiamo un protocollo per studiare l'immunologia del rigetto. Il modello chirurgico presentato riporta un breve tempo operatorio e una tecnica concisa. A seconda della combinazione di ceppo donatore-ricevente, il rene trapiantato può sviluppare rigetto cellulare acuto o danno cronico da allotrapianto, definito da fibrosi interstiziale e atrofia tubulare.

Mouse trapianto renale: Modelli di Allograft Rifiuto

Lo Streptococcus pneumoniae forma lesioni microscopiche discrete non purulente nel cuore. Viene delineato il protocollo per un modello murino di formazione di microlesioni cardiache. Vengono fornite istruzioni sulla visualizzazione delle microlesioni mediante microscopia, sulla discriminazione tra microlesioni precoci e tardive e sui metodi per rilevare il rimodellamento cardiaco nei cuori degli animali convalescenti.

Visualizzazione<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Entro cardiache microlesioni e successive rimodellamento cardiaco

Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un modello murino di guarigione delle ferite da ustione. Un'ustione termica è stata indotta sulla pelle dorsale dei topi utilizzando un modello di ottone preriscaldato. Il tessuto bruciato è stato disretto e sovrapposto con un innesto cutaneo raccolto dalla coda di un topo donatore geneticamente simile.

Un modello Murine di una ferita da ustione ricostruita con un innesto di pelle allogenica

Questo protocollo descrive un metodo per stabilire un modello murino di silicosi attraverso l'esposizione ripetuta a sospensioni di silice tramite una flebo nasale. Questo modello può imitare in modo efficiente, conveniente e flessibile il processo patologico della silicosi umana con elevata ripetibilità ed economia.

Un modello murino di silicosi stabilito dall'inalazione ripetuta di polvere di silice cristallina

Abbiamo stabilito un modello murino di fibrosi epatica cronica, che fornisce un modello animale adatto per lo studio meccanicistico della fibrosi epatica indotta da virus dell'atresia biliare (BA) e una piattaforma per futuri trattamenti BA.

Un modello murino di fibrosi epatica cronica per lo studio dell'atresia biliare

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale del polmone sinistro del topo trapiantato utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo rappresenta uno strumento prezioso per studiare le dinamiche e le interazioni cellulari in tempo reale dopo il trapianto di polmone murino.

Microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato

Modello murino di malattia steatosica epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) con disfunzione metabolica, alterazioni dell'espressione genica epatica e alterazioni istopatologiche epatiche che assomigliano alla MASLD umana, inclusa la fibrosi che progredisce allo stadio 3 di fibrosi avanzata. Questo modello può essere utilizzato negli studi di fisiopatologia della MASLD e negli studi preclinici di nuove terapie.

Modello murino di malattia epatica steatosica associata a disfunzione metabolica con fibrosi

Questo protocollo delinea un metodo per indurre la fibrosi polmonare nei topi attraverso la somministrazione ripetuta di bleomicina per via orofaringea, producendo caratteristiche patologiche molto simili a quelle della fibrosi polmonare idiopatica.

Modello murino raffinato di fibrosi polmonare idiopatica

Prima di tentare l'intervento chirurgico, un chirurgo nuovo dovrebbe avere una formazione in tecniche chirurgiche di base e concetti. Questo articolo presenta le considerazioni chirurgiche di base con particolare attenzione alla roditori.

Principi di Chirurgia roditori per il chirurgo nuovo

Scopri la colorazione rossa di Picrosirius per valutare semiquantitativamente la deposizione di collagene in modelli murini di rigetto cronico dell'allotrapianto polmonare. Questo metodo distingue fibre spesse e sottili.

Colorazione rossa di Picrosirius per la valutazione istopatologica semiquantitativa della deposizione di collagene in modelli murini di rigetto cronico dellallotrapianto polmonare (Video) | JoVE Journal

Colorazione rossa di Picrosirius per la valutazione istopatologica semiquantitativa della deposizione di collagene in modelli murini di rigetto cronico dell'allotrapianto polmonare

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