Name: Analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con Shigella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Scopri gli saggi di infezione con Shigella per studiare adesione, invasione e replicazione intracellulare utilizzando linee cellulari epiteliali in vitro. Questo metodo aiuta a sviluppare terapie efficaci contro le infezioni da Shigella.

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Il supporto per gli autori include il Dipartimento di Pediatria del Massachusetts General Hospital, il premio 2022A009041 del Comitato esecutivo per il finanziamento del supporto provvisorio alla ricerca, il R21AI146405 di sovvenzione del National Institute of Allergy and Infectious Diseases e il National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases grant Nutrition Obesity Research Center di Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Protocolli per l'analisi dell'infezione da Shigella nelle cellule epiteliali del colon

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Questo protocollo descrive una serie di tre saggi standardizzati per studiare l'aderenza, l'invasione e la replicazione intracellulare delle cellule epiteliali intestinali della Shigella. Sebbene questi metodi siano semplicemente versioni modificate dei classici saggi di gentamicina utilizzati per studiare l'invasione e la replicazione intracellulare di vari patogeni batterici all'interno delle cellule ospiti 49,50,51, è necessario applicare considerazioni speciali quando si studia Shigella.
Le Shigella sono anaerobi facoltativi, che crescono in modo ottimale a 37 °C in un terreno ricco con aerazione43. Quando si eseguono questi saggi per interrogare gli effetti di diversi segnali ambientali o metaboliti sulle infezioni da Shigella, si raccomanda di far crescere la Shigella in terreni ricchi durante la notte, quindi di sottocolturarli in terreni definiti o integrati fino alla fase intermedia prima dell'infezione. La massima virulenza dell'espressione genica si verifica durante la fase logaritmica della crescita52,53. Pertanto, la subcoltura notturna delle colture di Shigella e la possibilità di far crescere i batteri in fase esponenziale (OD600 ~ 0,7) sono passaggi necessari per valutare correttamente la virulenza della Shigella. Inoltre, l'espressione genica della virulenza è dipendente dalla temperatura. Per garantire la specificità dell'espressione solo durante l'infezione dell'ospite, i geni di virulenza sono indotti a temperature fisiologiche dell'ospite (37 °C) e rigorosamente repressi a temperature più basse (ad esempio, 30 °C)54. Per garantire l'espressione dei geni di virulenza, la subcoltura batterica e le infezioni devono essere effettuate a 37 °C, con la dovuta attenzione per garantire che la temperatura non scenda al di sotto dei 37 °C. Un grande plasmide di virulenza di 220 kilobasi, che codifica il macchinario molecolare necessario per l'invasione e l'infezione delle cellule epiteliali, è un determinante di virulenza essenziale per tutta la Shigella spp5. Il passaggio ripetuto e la crescita prolungata a 37 °C favoriscono l'instabilità del plasmide di virulenza, con conseguente perdita di plasmidi e rendendo le cellule di Shigella avirulente55. Per garantire il mantenimento del plasmide di virulenza e l'espressione di geni di virulenza cruciali, si raccomanda di rifilare i batteri direttamente dalle scorte di congelamento ogni due settimane su piastre indicatrici rosse TSB + Congo fresche. L'agar rosso del Congo può essere utilizzato per differenziare tra colonie virulente di tipo selvatico (rosso, CR+) e colonie avirulente (bianche, CR-) che hanno perso il plasmide di virulenza45. Se si osserva ripetutamente l'instabilità del plasmide di virulenza, le colture notturne di Shigella possono essere incubate a 30 °C per prevenire la perdita di plasmidi di virulenza, seguite da subcoltura a 37 °C per promuovere l'espressione genica di virulenza43. Infine, se vengono eseguite analisi con mutanti e/o ceppi complementari, in cui sono presenti marcatori antibiotici in questi ceppi batterici, si raccomanda di utilizzare l'appropriata selezione antibiotica durante le fasi di notte e subcoltura batterica.
L'uso di monostrati epiteliali HT-29 presenta molti vantaggi per lo studio dei meccanismi molecolari della patogenesi della Shigella in vitro. Poiché la Shigella è un patogeno adattato all'uomo, i modelli animali di piccole dimensioni non riflettono accuratamente la patogenesi caratteristica della shigellosi osservata nell'uomo36. Pertanto, l'uso di protocolli standardizzati per l'infezione di linee cellulari di derivazione umana consente l'interrogazione quantitativa delle singole fasi della patogenesi batterica per caratterizzare l'interazione molecolare tra questo patogeno e il suo ospite nativo. Storicamente, le cellule HeLa sono state utilizzate prevalentemente per studiare le interazioni ospite-patogeno in vitro 25,56,57. Tuttavia, le cellule HeLa sono una linea cellulare immortalizzata di cancro cervicale, che sono cellule ospiti non native per patogeni batterici enterici. Pertanto, gli studi in vitro sulla patogenesi enterica si sono spostati verso l'uso di linee cellulari di adenocarcinoma del colon (ad esempio, HT-29, Caco-2 e T84), che ricapitolano più fedelmente la morfologia epiteliale intestinale e possono essere coltivate su transwell come monostrati epiteliali con superfici apicali e basolaterali differenziate 58,59,60. Sebbene ogni linea cellulare abbia i suoi punti di forza e di debolezza individuali, le cellule HT-29 sono utilizzate nei saggi qui descritti a causa delle somiglianze fenotipiche con gli enterociti intestinali e della robusta espressione dei recettori di superficie cellulare e delle citochine pro-infiammatorie 58,59,61. Tuttavia, ciascuno di questi modelli discussi è costituito da linee cellulari derivate dal cancro con fenotipi metabolici e di crescita aberranti che non rappresentano accuratamente lo stato fisiologico naturale dell'epitelio del colon in vivo58. I recenti progressi nelle tecniche di coltura dei tessuti umani hanno permesso la coltivazione di cellule staminali intestinali umane, ottenute da biopsie tissutali, in organoidi o singoli monostrati cellulari bidimensionali che ricapitolano i vari tipi di cellule presenti nel tratto gastrointestinale umano (GI) 62,63,64. Gli organoidi intestinali possono essere differenziati per includere enterociti, cellule caliciformi produttrici di muco, cellule M e altri tipi di cellule tessuto-specifiche. Studi recenti hanno convalidato l'uso di questi modelli organoidi per lo studio di patogeni enterici, tra cui vari pathovar62,63,64 di Shigella spp., Salmonella enterica ed Escherichia coli. Sebbene gli organoidi siano modelli più accurati dell'epitelio gastrointestinale umano e possano anche essere coltivati in varie condizioni nutrizionali per rappresentare la popolazione globale65, la loro relativa complessità richiede una formazione e competenze tecniche significative, con conseguenti costi più elevati e tempi di coltura più lunghi rispetto alle linee cellulari tumorali tradizionali58.
Questo protocollo descrive i metodi a medio rendimento, in cui vengono utilizzate due piastre a 6 pozzetti per un totale di 12 monostrati disponibili per il test. Tuttavia, gli esperimenti possono essere facilmente scalati per aumentare il numero di monostrati seminati al fine di ospitare ulteriori repliche tecniche o testare ulteriori mutanti di Shigella e segnali ambientali. Le piastre di coltura tissutale con più pozzetti (ad es. piastre a 12 o 24 pozzetti) possono essere utilizzate anche con le opportune regolazioni per tenere conto dei pozzetti con diametri più piccoli. Nelle condizioni di crescita di HT-29 descritte nella fase 3.2, i titoli di HT-29 sono sufficienti per seminare circa sei piastre da 6 pozzetti dopo la coltivazione da un pallone T75, con un numero sufficiente di cellule rimanenti per mantenere la coltura cellulare di HT-29. Inoltre, la semina dei monostrati HT-29 e la preparazione delle fasi di inoculazione dei batteri sono identiche tra i saggi di aderenza batterica, invasione e replicazione intracellulare. Pertanto, i test che testano gli stessi ceppi di Shigella o le stesse condizioni di subcoltura possono essere facilmente eseguiti in parallelo per esaminare simultaneamente il ruolo di ciascuna condizione sperimentale nelle varie fasi dell'infezione da Shigella .
I titoli di recupero per i batteri aderenti (fase 4), invasi (fase 5) e intracellulari (fase 6) sono determinati mediante diluizioni seriali di cellule HT-29 infette dopo la lisi, che consente una valutazione quantitativa dell'efficienza di ciascuna fase dell'infezione da Shigella. Le fasi di centrifugazione nei saggi di invasione e replicazione intracellulare, basate sui saggi classici 49,50,51, promuovono il contatto batterico con le cellule ospiti per l'invasione immediata e aumentano i tassi di invasione. Pertanto, la centrifugazione "salta" la fase di aderenza, che in seguito si è scoperto essere un aspetto importante dell'infezione da Shigella 17,18,19,66. È essenziale notare che la fase di centrifugazione non può essere eseguita con cellule epiteliali polarizzate seminate su transwell. Per il test di aderenza, tuttavia, l'aderenza non è forzata dalla centrifugazione e non viene aggiunta gentamicina alle cellule HT-29 infette prima della lisi, consentendo così l'enumerazione delle cellule batteriche aderenti. Il volume dei terreni di coltura tissutale è ridotto a 1 mL (rispetto ai 2 mL per i saggi di invasione e replicazione intracellulare) per consentire un contatto più efficiente dei batteri con le cellule HT-29. Inoltre, a seconda del tasso di aderenza, durante le 3 ore di incubazione possono verificarsi alcune invasioni e replicazioni intracellulari, ma la quantità è in genere trascurabile (ad esempio, solo lo 0,05% della popolazione batterica recuperata dopo la lisi delle cellule ospiti). Tuttavia, per tenere correttamente conto dei batteri aderenti rispetto a quelli intracellulari durante le 3 ore di incubazione, si raccomanda di eseguire saggi paralleli, dove, oltre al protocollo indicato, viene incubata una seconda piastra con 50 μg/mL di gentamicina in 2 mL di DMEM per pozzetto per 45 minuti totali (15 minuti di incubazione, lavaggio, DMEM fresco + gentamicina per 30 minuti) per lisare a fondo i batteri extracellulari. A seguito della lisi cellulare HT-29 come indicato nel protocollo, i batteri intracellulari possono essere enumerati come indicato sopra e rappresenteranno il numero di batteri che hanno invaso. Questo valore può quindi essere sottratto dai batteri enumerati dalla piastra senza trattamento con gentamicina per determinare in modo appropriato i batteri aderenti e quelli invasi. Possono anche essere eseguite analisi parallele per fornire maggiori informazioni sulla replicazione intracellulare di Shigella all'interno delle cellule HT-29 dopo l'invasione, ad esempio, utilizzando più punti temporali per eseguire curve di crescita intracellulare. Infine, oltre a enumerare i batteri intracellulari dopo un'incubazione di 18 ore con gentamicina, i surnatanti della coltura possono essere raccolti e analizzati per la secrezione di citochine delle cellule HT-29 infette. Ad esempio, l'IL-8 è una chemochina secreta dalle cellule epiteliali che funziona in gran parte per reclutare PMN nel sito di infezione. La quantità di IL-8 secreta nei terreni di coltura delle cellule HT-29 infette può essere analizzata con un test ELISAIL-8 67.
I sali biliari hanno dimostrato di essere un importante segnale di virulenza per la Shigella durante il transito attraverso il sistema gastrointestinale umano e possono essere utilizzati per integrare i mezzi di crescita batterica in questi protocolli per replicare le condizioni tipiche del tratto gastrointestinale. Naturalmente, i sali biliari vengono introdotti nel duodeno o nella parte superiore dell'intestino tenue per favorire la digestione; E nell'ileo terminale o alla fine dell'intestino tenue, il 95% dei sali biliari viene rimosso e riciclato in circolo per il deposito finale nella cistifellea68. I sali biliari di solito hanno una concentrazione compresa tra lo 0,2% e il 2,0% (p/v) nell'intestino tenue e sono naturalmente battericidi. Tuttavia, la Shigella, insieme alla maggior parte dei batteri enterici, resiste ai sali biliari e utilizza i segnali per migliorare l'infezione47. Diversi studi hanno documentato come l'esposizione ai sali biliari, a volte in combinazione con altri segnali dell'intestino tenue come il glucosio, influenzi la sopravvivenza della Shigella e la regolazione della virulenza prima dell'infezione. È stato dimostrato che la Shigella resiste ai sali biliari, altera l'espressione genica e forma e disperde un biofilm in condizioni che riproducono il transito dell'intestino tenue17,69. Gli studi hanno dimostrato che questi cambiamenti si traducono in un fenotipo ipervirulento, in cui l'aderenza e l'invasione sono indotte dalla successiva infezione del colon da parte di Shigella 17,18,19,48,66. Pertanto, le condizioni sopra descritte documentano come subcoltivare la Shigella in sali biliari per imitare il transito intestinale tenue prima di eseguire i saggi di aderenza, invasione o replicazione intracellulare. La formulazione TSB specificata contiene glucosio aggiunto rispetto al tipico brodo Luria (LB)17. Pertanto, se si utilizza LB, è importante integrare anche il terreno con glucosio (0,5%-2,0% [p/v]) per considerare in modo appropriato i segnali glicemici nell'intestino tenue17. Inoltre, come accennato in precedenza, tutte le sottocolture di Shigella vengono lavate per rimuovere i sali biliari e mimare il passaggio al colon per le analisi delle infezioni.
Tradizionalmente, e come evidenziato nei risultati sopra riportati (Figura 1 e Figura 2), i test di infezione sono utili per determinare il ruolo di un particolare gene nell'infezione da Shigella . Il fenotipo dei vari mutanti, tuttavia, potrebbe non essere veramente apprezzato senza un'adeguata integrazione dei terreni di coltura batterica. Come hanno dimostrato ricerche precedenti, i sali biliari alterano significativamente l'espressione genica di S. flexneri , compresi i geni per il metabolismo centrale, i fattori di trascrizione, i trasportatori di zucchero, la resistenza ai farmaci e i geni di virulenza codificati sul cromosoma o sul plasmide di virulenza17. Questi geni forniscono informazioni su come Shigella utilizza i sali biliari come segnale per alterare l'espressione genica e prepararsi per un'eventuale infezione del colon, e le successive analisi mutazionali devono quindi essere eseguite nei terreni di crescita batterica integrati appropriati prima di esaminare gli effetti sulla virulenza nei saggi di aderenza, invasione e replicazione intracellulare. Come si vede sopra nella Figura 1 e nella Figura 2, la mutazione ΔVF non ha influenzato l'aderenza, ma ha influenzato l'invasione e la replicazione intracellulare. Poiché la mutazione ha potenziato l'invasione e la replicazione intracellulare, sono attualmente in corso esperimenti per determinare come il prodotto genico regola l'infezione. Le analisi dei mutanti servono come esempio di come possano essere studiate nuove conoscenze sulla patogenesi della Shigella , specialmente in condizioni che replicano meglio il tratto gastrointestinale umano. Adeguate analisi di complementazione sono raccomandate per convalidare i fenotipi di vari mutanti.
In combinazione, queste procedure descrivono esperimenti quantitativi che forniranno importanti informazioni sui meccanismi molecolari dell'aderenza, dell'invasione e della replicazione della Shigella all'interno delle cellule epiteliali del colon HT-29, imitando al meglio l'ambiente naturale del tratto gastrointestinale umano durante l'infezione. Studi futuri possono espandere i mutanti e le condizioni sperimentali per ottenere una migliore comprensione di come Shigella si prepara e infetta efficacemente gli ospiti umani. Nonostante decenni di ricerca, c'è ancora molto da scoprire sull'infezione da Shigella.

Le malattie diarroiche causate da patogeni batterici enterici rappresentano un onere significativo per la salute globale. Nel 2016, le malattie diarroiche sono state responsabili di 1,3 milioni di decessi in tutto il mondo e sono state la quarta causa di morte nei bambini di età inferiore ai cinque anni(1,2). Il patogeno batterico enterico Gram-negativo Shigella è l'agente eziologico della shigellosi, una delle principali cause di decessi per diarrea in tutto il mondo3. La shigellosi causa ogni anno una significativa morbilità e mortalità nei bambini dei paesi a basso e medio reddito 4,5, mentre le infezioni nei paesi ad alto reddito sono collegate a focolai di asili nido, di origine alimentare e idrica 6,7,8,9. Lo sviluppo inefficace di vaccini10 e l'aumento dei tassi di resistenza antimicrobica (AMR)11,12 hanno complicato la gestione delle epidemie di Shigella su larga scala. I recenti dati dei Centers for Disease Control and Prevention mostrano che quasi il 46% delle infezioni da Shigella negli Stati Uniti ha mostrato resistenza ai farmaci nel 202013,14, mentre l'Organizzazione Mondiale della Sanità ha dichiarato la Shigella come patogeno prioritario della resistenza antimicrobica per la quale sono urgentemente necessarie nuove terapie15.
Le infezioni da Shigella si trasmettono facilmente per via oro-fecale dopo l'ingestione di cibo o acqua contaminati o attraverso il contatto umano diretto. La Shigella si è evoluta per essere un agente patogeno efficiente e adattato all'uomo, con una dose infettiva di 10-100 batteri sufficiente a causare la malattia16. Durante il transito dell'intestino tenue, la Shigella è esposta a segnali ambientali, come la temperatura elevata e la bile17. Il rilevamento di questi segnali induce cambiamenti trascrizionali per esprimere fattori di virulenza che aumentano la capacità dei batteri di infettare il colon umano 17,18,19. La Shigella non invade l'epitelio del colon dalla superficie apicale, ma piuttosto transita attraverso lo strato epiteliale dopo l'assorbimento in cellule microfold specializzate presentanti l'antigene (cellule M) all'interno dell'epitelio associato al follicolo 20,21,22. Dopo la transcitosi, le cellule Shigella vengono fagocitate dai macrofagi residenti. La Shigella sfugge rapidamente al fagosoma e innesca la morte delle cellule macrofagiche, con conseguente rilascio di citochine pro-infiammatorie 5,23,24. La Shigella invade quindi le cellule epiteliali del colon dal lato basolaterale, lisa il vacuolo macropinocitico e stabilisce una nicchia replicativa nel citoplasma 5,25. Le citochine pro-infiammatorie, in particolare l'interleuchina-8 (IL-8), reclutano leucociti neutrofili polimorfonucleati (PMN) nel sito di infezione, che indebolisce le giunzioni strette epiteliali e consente l'infiltrazione batterica del rivestimento epiteliale per esacerbare l'infezione basolaterale5. I PMN distruggono il rivestimento epiteliale infetto per contenere l'infezione, che si traduce nei sintomi caratteristici della dissenteria bacillare (sanguinolenta)5. Sebbene i meccanismi di invasione e replicazione intracellulare siano stati accuratamente caratterizzati, una nuova ricerca sta dimostrando nuovi importanti concetti nell'infezione da Shigella, tra cui la regolazione della virulenza durante il transito gastrointestinale (GI)17, l'aderenza19, il miglioramento dell'accesso basolaterale attraverso la permeabilità della barriera26 e il trasporto asintomatico nei bambini malnutriti27.
La capacità di Shigella spp. di causare malattie diarroiche è limitata agli esseri umani e ai primati non umani (NHP)28. Sono stati sviluppati modelli di infezione intestinale della Shigella per il pesce zebra29, i topi30, i porcellini d'India31, i conigli 21,32,33 e i maiali34,35. Tuttavia, nessuno di questi sistemi modello è in grado di replicare accuratamente le caratteristiche della malattia osservate durante l'infezione umana36. Sebbene siano stati stabiliti modelli NHP di shigellosi per studiare la patogenesi della Shigella, questi sistemi modello sono costosi da implementare e richiedono dosi infettive artificialmente elevate, fino a nove ordini di grandezza superiori alla dose infettiva degli esseri umani 37,38,39,40,41,42. Pertanto, il notevole adattamento della Shigella per l'infezione di ospiti umani richiede l'uso di colture cellulari di derivazione umana per ricreare modelli fisiologicamente rilevanti per un'accurata interrogazione della patogenesi della Shigella.
Qui, vengono descritte procedure dettagliate per misurare i tassi di aderenza, invasione e replicazione di Shigella all'interno delle cellule epiteliali del colon HT-29. Utilizzando questi protocolli standardizzati, i meccanismi molecolari con cui i geni di virulenza batterica e i segnali ambientali influenzano ogni fase dell'infezione da Shigella possono essere interrogati per comprendere meglio la relazione dinamica di interazione ospite-patogeno.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mu; m Filtro PES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCGP00525</td><td>Filtro sterile in polietersulfone per la sterilizzazione di terreni fino a 50 mL</td></tr><tr><td>Provette per coltura da 14 mL Provette</td><td>per coltura Corning</td><td>352059</td><td>17 mm x 100 mm Provette in polipropilene con tappo</td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>Provette da centrifuga a fondo conico in polipropilene trasparente da 50 mL con tappo a tenuta stagna</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Le piastre sono trattate per un fissaggio ottimale delle cellule</td></tr><tr><td>Sali biliari</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8756</td><td>Rapporto 1:1 tra colato e desossicolato</td></tr><tr><td>Colorante rosso Congo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>Un colorante diazo anionico a base di benzidina, purezza >85%</td></tr><tr><td>Vetrino della camera di conteggio delle cellule Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Da utilizzare con il Countess Automated Cell Counter</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Un reagente organico altamente polare</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medium Eagle modificato (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>DMEM è integrato con glucosio elevato, piruvato di sodio, GlutaMAX e</td></tr><tr><td>siero fetale bovino rosso fenolo (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Gentamicina sterile inattivata termicamente</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632</td> La <td>concentrazione stock è di 50 mg/mL</td></tr><tr><td>HT-29 linea cellulare</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Adenocarcinoma; colon-retto in origine</td></tr><tr><td>Pellicola di paraffina</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td>Pellicola sigillante da laboratorio</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>100 mm x 15 mm Piastre di Petri per terreni solidi</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific 10010049</td><td></td><td>concentrazione 1x; pH 7,4</td></tr><tr><td>Select agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td>Una miscela di polisaccaridi estratti dalle pareti cellulari delle alghe rosse per produrre terreni di placcatura batterica</td></tr><tr><td>Palloni T75</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Fiasche per coltura tissutale</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Un tensioattivo ed emulsionante non ionico comune</td></tr><tr><td>Colorante blu di tripano</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Un colorante per rilevare le cellule morte in coltura tissutale; solo le cellule vive possono escludere il colorante</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Reagente per la dissociazione cellulare per il mantenimento della linea cellulare e il passaggio</td></tr><tr><td>Brodo di soia triptico (TSB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907</td><td>Terreni di crescita batterica</td></tr></tbody></table>

analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con shigella

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

Il patogeno batterico enterico adattato all'uomo Shigella causa milioni di infezioni ogni anno, crea effetti di crescita a lungo termine tra i pazienti pediatrici ed è una delle principali cause di decessi per diarrea in tutto il mondo. L'infezione induce diarrea acquosa o sanguinolenta a causa dell'agente patogeno che transita nel tratto gastrointestinale e infetta le cellule epiteliali che rivestono il colon. Con l'aumento sbalorditivo della resistenza agli antibiotici e l'attuale mancanza di vaccini approvati, i protocolli di ricerca standardizzati sono fondamentali per studiare questo formidabile agente patogeno. In questo articolo, vengono presentate metodologie per esaminare la patogenesi molecolare della Shigella utilizzando analisi in vitro dell'aderenza batterica, dell'invasione e della replicazione intracellulare nelle cellule epiteliali del colon. Prima delle analisi dell'infezione, il fenotipo di virulenza delle colonie di Shigella è stato verificato mediante l'assorbimento del colorante rosso Congo su piastre di agar. Durante la coltura batterica possono essere presi in considerazione anche terreni di laboratorio integrati per simulare le condizioni in vivo . Le cellule batteriche vengono quindi utilizzate in un protocollo standardizzato per infettare le cellule epiteliali del colon nelle piastre di coltura tissutale a una molteplicità stabilita di infezione con adattamenti per analizzare ogni fase dell'infezione. Per i saggi di aderenza, le cellule di Shigella vengono incubate con livelli di terreno ridotti per promuovere il contatto batterico con le cellule epiteliali. Sia per i saggi di invasione che per quelli di replicazione intracellulare, la gentamicina viene applicata per vari intervalli di tempo per eliminare i batteri extracellulari e consentire la valutazione dell'invasione e/o la quantificazione dei tassi di replicazione intracellulare. Tutti i protocolli di infezione enumerano i batteri aderenti, invasi e/o intracellulari diluendo in serie i lisati di cellule epiteliali infette e placcando le unità formanti colonie batteriche rispetto ai titoli infettivi sulle piastre di agar rosso del Congo. Insieme, questi protocolli consentono una caratterizzazione e un confronto indipendenti per ogni fase dell'infezione da Shigella delle cellule epiteliali per studiare con successo questo patogeno.

Sono stati eseguiti saggi di aderenza, invasione e replicazione intracellulare confrontando S. flexneri 2457T wild type (WT) con S. flexneri ΔVF (ΔVF), un mutante che si ipotizza regoli negativamente la virulenza della Shigella. Poiché la Shigella utilizza i sali biliari come segnale per regolare la virulenza 17,18,47, sono stati eseguiti esperimenti dopo la subcoltura batterica in terreni TSB e TSB integrato con lo 0,4% (p/v) di sali biliari18. L'esposizione ai sali biliari durante la fase di sottocoltura funge da pre-trattamento per replicare il transito dell'intestino tenue prima dell'infezione del colon 17,18,47. La Figura 1 analizza l'effetto della mutazione ΔVF sulla capacità di S. flexneri di aderire alle cellule epiteliali del colon HT-29. L'aderenza percentuale è tracciata sull'asse y e rappresenta il rapporto tra i batteri recuperati dopo la lisi HT-29 standardizzati e il numero di batteri in ingresso. Come previsto, entrambi i ceppi di S. flexneri WT e ΔVF hanno avuto un aumento significativo dell'aderenza quando sono stati sottoposti a subcoltura con integrazione di sali biliari rispetto a TSB senza integrazione di sali biliari18. Tuttavia, non c'era alcuna differenza nell'aderenza alle cellule HT-29 tra i ceppi mutanti WT e ΔVF all'interno di ciascuna condizione di sottocoltura. Questi dati indicano che la mutazione ΔVF non ha alcun effetto sulla capacità di S. flexneri di aderire alle cellule epiteliali HT-29 con o senza il pretrattamento dei sali biliari.
Nella Figura 2 è stato analizzato l'effetto della mutazione ΔVF sulla capacità di S. flexneri di invadere (Figura 2A) e replicarsi (Figura 2B) all'interno delle cellule epiteliali del colon HT-29 con o senza pre-trattamento con sali biliari. La percentuale di recupero è tracciata sull'asse y e rappresenta il rapporto tra le cellule batteriche recuperate dopo la lisi cellulare HT-29 standardizzata e il numero di batteri in ingresso. Nella Figura 2A, ci si aspettava un aumento significativo della capacità di WT S. flexneri 2457T di invadere le cellule HT-29 dopo la pre-esposizione ai sali biliari48, mentre il mutante ΔVF di S. flexneri ha mostrato un aumento minore dell'invasione dopo la pre-esposizione ai sali biliari rispetto al ceppo WT. Il mutante ΔVF aveva un aumento dei tassi di invasione delle cellule HT-29 rispetto al WT sottocoltivato in TSB, ma aveva tassi di invasione simili a quelli del WT quando sottocoltivato in TSB integrato con sali biliari (Figura 2A). Questi risultati suggeriscono che la mutazione ΔVF aumenta la capacità di S. flexneri di invadere le cellule HT-29, il che riduce l'effetto dei sali biliari prima dell'esposizione, anche se la capacità di invasione del mutante ΔVF è aumentata ulteriormente dopo la sottocoltura dei sali biliari.
Nel complesso, sono stati recuperati 10 volte più batteri dopo l'incubazione notturna (Figura 2B) rispetto all'incubazione di 90 minuti (Figura 2A), il che dimostra le differenze nel monitoraggio della crescita intracellulare rispetto all'invasione, rispettivamente. Quando le cellule HT-29 infette sono state incubate per 18 ore per consentire la replicazione intracellulare dei batteri (Figura 2B), l'impatto del pre-trattamento con sali biliari è diminuito sia per i ceppi WT che ΔVF . Tuttavia, l'effetto ridotto dei sali biliari prima del trattamento durante la replicazione intracellulare è stato più drammatico per il mutante ΔVF . Poiché l'aumento della replicazione intracellulare di entrambi i ceppi quando pre-esposti ai sali biliari era inferiore all'aumento dei tassi di invasione nelle stesse condizioni, ipotizziamo che i sali biliari abbiano un impatto maggiore sulle prime fasi della patogenesi di S. flexneri . Il mutante ΔVF ha mostrato un aumento della percentuale di recupero dalla replicazione notturna all'interno delle cellule HT-29 rispetto a WT (Figura 2B) dopo entrambe le condizioni di sottocoltura. Tuttavia, le percentuali di recupero del mutante ΔVF erano simili indipendentemente dai sali biliari prima dell'esposizione. Queste tendenze dei dati suggeriscono che il mutante ΔVF si replica in modo più efficiente all'interno delle cellule HT-29 rispetto a WT e che la pre-esposizione ai sali biliari non influisce sulla capacità del mutante ΔVF di replicarsi intracellulare, come osservato per WT (Figura 2B). Poiché la differenza tra i ceppi mutanti e WT nella condizione di pre-esposizione ai sali biliari non è stata osservata durante il test di invasione di 90 minuti, ipotizziamo che il prodotto codificato dal gene VF cancellato possa anche regolare la replicazione di S. flexneri all'interno delle cellule HT-29. Combinate, entrambe le analisi dimostrano che il mutante ΔVF è più virulento rispetto a WT, il che suggerisce che il prodotto del gene VF è un regolatore negativo della virulenza di S. flexneri .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig01.jpg"> Figura 1: L'adesione indotta dai sali biliari di S. flexneri alle cellule HT-29 prima dell'esposizione. Le cellule mutanti di S. flexneri 2457T WT e ΔVF sono state sottocoltivate in TSB o TSB integrate con terreni allo 0,4% (p/v) di sali biliari (TSB+BS). I batteri sono stati quindi applicati alle cellule HT-29 a una molteplicità di infezione (MOI) di 100 e incubati per 3 ore per esaminare l'aderenza. Dopo l'incubazione, le cellule HT-29 infette sono state lavate e lisate e sono state piastrate diluizioni seriali dei batteri recuperati per enumerare le unità formanti colonie per mL (CFU/ML). Il numero di batteri aderenti viene tracciato in relazione ai titoli dei batteri in ingresso per stabilire la percentuale di aderenza. I dati sono rappresentativi di una replica biologica con tre repliche tecniche (singoli punti). Le barre di errore indicano l'errore standard della media (SEM). La significatività statistica è stata determinata da un test t di Student (*p &lt; 0,05; ***p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig02.jpg"> Figura 2: La pre-esposizione dei sali biliari ha aumentato l'invasione di WT S. flexneri e la replicazione intracellulare. Le cellule mutanti di S. flexneri 2457T WT e ΔVF sono state sottocoltivate in TSB o TSB integrate con terreni di sali biliari (TSB+BS). I batteri sono stati quindi applicati alle cellule HT-29 a un MOI di 100, centrifugati sulle cellule e incubati a 37 °C con il 5% di CO2 per 45 minuti. Le cellule sono state lavate con PBS e i batteri extracellulari sono stati lisati mediante l'aggiunta di gentamicina al DMEM per recuperare esclusivamente i batteri intracellulari. Dopo 90 minuti (A, invasione batterica) o 18 ore (B, replicazione intracellulare) di incubazione, le cellule HT-29 infette sono state lavate e lisate e sono state piastrate diluizioni seriali dei batteri recuperati per enumerare le unità formanti colonie per mL (CFU/ML). Il numero di batteri intracellulari viene tracciato in relazione ai titoli batterici in ingresso per stabilire la percentuale di recupero. I dati sono rappresentativi di una replica biologica, ciascuna con tre repliche tecniche (singoli punti). Le barre di errore indicano il SEM. La significatività statistica è stata determinata da un test t di Student (*p &lt; 0,05). Si prega di notare le differenze nelle scale dell'asse y tra i pannelli (A) e (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Il presente protocollo descrive saggi di infezione per interrogare l'aderenza, l'invasione e la replicazione intracellulare di Shigella utilizzando linee cellulari epiteliali in vitro .

Analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

La Shigella è un importante agente patogeno globale che causa tassi di infezione devastanti ogni anno. La Shigella infetta il tratto gastrointestinale causando diarrea o dissenteria. La nostra ricerca mira a migliorare la nostra comprensione dell'infezione per aiutare a sviluppare terapie più efficaci come vaccini e altri prodotti antimicrobici.In primo luogo, i modelli animali e le tecniche emergenti di coltura tissutale ci consentono di comprendere meglio la fisiologia dell'infezione da Shigella e di riprodurre fedelmente la complessità del tratto gastrointestinale umano. In secondo luogo, la caratterizzazione degli isolati clinici di Shigella ha contribuito a catturare la diversità di questo genere, a identificare importanti geni di virulenza e a migliorare la nostra comprensione dell'infezione. Abbiamo utilizzato segnali gastrointestinali come i sali biliari e il glucosio per capire come la Shigella sopravvive al transito nell'intestino tenue e regola l'espressione genica di virulenza per l'infezione nell'intestino crasso.Abbiamo dimostrato come la Shigella resista ai sali biliari e abbiamo dimostrato che la Shigella produce proteine di aderenza per aiutare ad avviare il contatto con le cellule epiteliali per avviare l'infezione. Questi protocolli sono progettati per esaminare gli aspetti chiave dell'infezione epiteliale come l'aderenza, l'invasione e la sopravvivenza intracellulare di Shigella. Stiamo eseguendo questi protocolli utilizzando una linea cellulare epiteliale standard, ma abbiamo anche adattato i metodi per sofisticati modelli gastrointestinali umani che sono ora disponibili.Questi protocolli considerano ogni fase dell'infezione in modo indipendente, il che è fondamentale per comprendere i passaggi chiave dell'infezione da Shigella. Evidenziano inoltre che le analisi combinate possono facilitare una maggiore comprensione dell'infezione da Shigella a livello olistico.

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