Name: Modello murino di ileo postoperatorio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 26 s
Description: Scopri il modello murino di ileo postoperatorio per studiare la fisiopatologia intestinale e l'immunità. Questo metodo consente di valutare nuove strategie terapeutiche anti-infiammatorie in vivo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Modello murino per lo studio dell'ileo postoperatorio attraverso la manipolazione intestinale

<ol><li>Chapman, S. J., Pericleous, A., Downey, C., Jayne, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+ileus+following+major+colorectal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Postoperative ileus following major colorectal surgery.</a> Br J Surg. 105 (7), 797-810 (2018).</li>
<li>Farro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR2-dependent+monocyte-derived+macrophages+resolve+inflammation+and+restore+gut+motility+in+postoperative+ileus%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">CCR2-dependent monocyte-derived macrophages resolve inflammation and restore gut motility in postoperative ileus.</a> Gut. 66 (12), 2098-2109 (2017).</li>
<li>Wouters, M. M., Vicario, M., Santos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mast+cells+in+functional+GI+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The role of mast cells in functional GI disorders.</a> Gut. 65 (1), 155-168 (2016).</li>
<li>Engel, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+helper+type+1+memory+cells+disseminate+postoperative+ileus+over+the+entire+intestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">T helper type 1 memory cells disseminate postoperative ileus over the entire intestinal tract.</a> Nat Med. 16 (12), 1407-1413 (2010).</li>
<li>Schwartz, C., Voehringer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+murine+basophils+by+flow+cytometry+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of murine basophils by flow cytometry and histology.</a> Methods Mol Biol. 2163, 367-375 (2020).</li>
<li>Funk, E. K., Weissbrod, P., Horgan, S., Orosco, R. K., Califano, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+experience+with+a+novel+single-port+platform+for+transoral+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Endosc%22%5BJournal%5D)">Preclinical experience with a novel single-port platform for transoral surgery.</a> Surg Endosc. 35 (8), 4857-4864 (2021).</li>
<li>Nemoto, S., Mailloux, A. W., Kroeger, J., Mulé, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-031%3A+Immunologic+checkpoint+expression+on+murine+effector+and+memory+T-cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-031: Immunologic checkpoint expression on murine effector and memory T-cell subsets.</a> Cytometry A. 89 (5), 427-429 (2016).</li>
<li>Brandi, J., Wiethe, C., Riehn, M., Jacobs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-93%3A+A+41-color+high+parameter+panel+to+characterize+various+co-inhibitory+molecules+and+their+ligands+in+the+lymphoid+and+myeloid+compartment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-93: A 41-color high parameter panel to characterize various co-inhibitory molecules and their ligands in the lymphoid and myeloid compartment in mice.</a> Cytometry A. 103 (8), 624-630 (2023).</li>
<li>Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+and+composition+of+the+mucosal+flora+in+patients+with+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease.</a> J Clin Microbiol. 43 (7), 3380-3389 (2005).</li>
<li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Swiss-rolling+technique+for+intestinal+tissue+preparation+for+immunohistochemical+and+immunofluorescent+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses.</a> J Vis Exp. (113), e54161(2016).</li>
<li>van Bree, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+studying+postoperative+ileus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Physiol+Pathophysiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Novel method for studying postoperative ileus in mice.</a> Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 4 (4), 219-227 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo I-A/I-E (MHC-II)</td><td>Biolegend</td><td>107614</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo TCRb</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-topo CD4</td><td>Biolegend</td><td>100414</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-topo Ly6G</td><td>Biolegend</td><td>127624</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-topo CD69</td><td>Biolegend</td><td>104545</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-topo F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123132</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 785 anti-topo/umano CD44</td><td>Biolegend</td><td>103041</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 anti-topo CD8a</td><td>BD</td><td>563786</td><td></td></tr><tr><td>BUV737 anti-topo CD3e</td><td>BD</td><td>612771</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per colture</td><td>CKX53</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Deossiribonucleasi I da pancreas bovino (DNase I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-5G</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo soluzione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816-10ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-topo CD45</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>147709</tr><tr><td>FITC-destrano (70 kWM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70-100MG</td><td>Saggio del transito gastrointestinale</td></tr><tr><td>Kit di colorazione HE</td><td>solarbio</td><td>G1120</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-topo CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-topo PD-1</td><td>Biolegend</td><td>114118</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-topo CD11c</td><td></td><td>Biolegend 117318</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE (Pharmacia)</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso Symphony A5</td><td>BD-Rilevamento</td><td></td> <td>e smistamento delle cellule immunitarie</td></tr><tr><td>Tribromoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Varioskan LUX</td><td>Thermo</td><td>N16699</td><td>Lettore di micropiastre multimodale</td></tr><tr><td>Zombie Aqua Kit di vitalità fissabile</td><td>Biolegend</td><td>423102</td><td>Fluorescente colorante vitalità&nbsp;</td></tr></tbody></table>

modello murino di ileo postoperatorio

Postoperative Ileus Murine Model

In questo protocollo, la POI è stata indotta chirurgicamente dalla manipolazione intestinale (IM), che è simile all'effetto della chirurgia clinica. Nel gruppo fittizio, è stata praticata un'incisione senza l'IM. I topi POI sono stati sacrificati 24 ore dopo l'intervento chirurgico insieme ai topi di controllo fittizi. La funzione critica del tratto digestivo, la funzione di transito del contenuto, è stata rilevata mediante sonda gastrica di FITC-destrano. Il modello POI è stato considerato di successo perché l'intensità FITC è aumentata nella parte prossimale dell'intestino tenue (Figura 2B). I GC medi sono stati calcolati per quantificare la disfunzione del transito dell'IM e indicare la coerenza dell'operazione (Figura 2C).
La colorazione HE indicava la morfologia di diversi segmenti del tratto digestivo (Figura 3). La sottomucosa e lo strato muscolare liscio del duodeno e dell'ileo si sono gonfiati 24 ore dopo l'induzione del POI (Figura 3A, B). Rispetto a quelli nei topi fittizi, la colorazione HE del duodeno ha rivelato un aumento dell'infiltrazione di cellule immunitarie nei topi POI (Figura 3A).
L'analisi citofluorimetrica multicolore è il metodo centrale per analizzare la proporzione, lo stato e la funzione delle cellule immunitarie. Il tessuto intestinale è stato digerito con collagenasi e desossiribonucleasi e separato in una sospensione unicellulare per la citometria a flusso. La strategia di gating è stata utilizzata per determinare le proporzioni delle cellule T CD3 e delle sottopopolazioni correlate tra le LPL (Figura 4A). Il marcatore di attivazione e adesione CD69 e l'espressione delle cellule T CD4, delle cellule T CD8 e delle cellule T gd sono sovraregolati nei topi POI (Figura 4B)7. Allo stesso modo, la proporzione della sottopopolazione CD44+ PD-1+ (attivazione, differenziazione terminale e marcatore di esaurimento) ha mostrato una tendenza all'aumento (Figura 4C)7. Oltre ai linfociti, anche le proporzioni di sottogruppi di cellule mieloidi (neutrofili, cellule dendritiche e macrofagi) sono aumentate dopo l'intervento chirurgico IM (Figura 4D)8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Modello murino dell'ileo postoperatorio. (A) Schema del modello murino dell'ileo postoperatorio. (B) Fissazione del topo dopo l'anestesia e la rasatura. (C) L'incisione è stata esposta e coperta con una garza medica sterile. (D) I tubi intestinali sono stati spremuti fuori dalla cavità addominale attraverso l'incisione addominale ed esposti posizionandoli su una garza sterile. (E) L'intero intestino tenue è stato esposto a un batuffolo di cotone sterile inumidito. (F) Lo strato muscolare è stato chiuso con sutura chirurgica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Saggio del transito gastrointestinale per la valutazione della funzione del tratto digestivo. A 22,5 ore dopo l'intervento chirurgico, i topi fittizi o POI sono stati sottoposti a gasging con soluzione di FITC-destrano e sacrificati 90 minuti dopo. (A) Il tubo digerente è stato diviso in 15 segmenti e numerato in base alla posizione fisiologica. (B) Intensità FITC di ogni segmento dal tratto digestivo di topi sham e POI. (C) I centri geometrici del destrano FITC-somministrato sono stati calcolati e sono mostrati come grafici a violino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig03.jpg"> 
Figura 3: Colorazione rappresentativa dell'HE dell'intestino tenue di topi POI. Colorazione HE di sezioni trasversali del duodeno (A) e dell'ileo (B) da topi sham e POI. Barre della scala: 100 μm o 25 μm (immagine ingrandita dell'inserto). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66465/66465fig04.jpg"> 
Figura 4: Analisi citofluorimetrica rappresentativa di cellule immunitarie dell'intestino tenue da topi POI. (A) Strategia di gating della citometria a flusso per popolazioni di cellule T da tessuti intestinali tenue di topi POI 24 ore dopo l'intervento chirurgico. (B) Le proporzioni del marcatore attivo delle cellule T CD69+ nelle cellule T CD4, nelle cellule T CD8 e nelle cellule T gd dell'intestino tenue di topi fittizi e POI. (C) Le proporzioni dei marcatori attivi CD44+ PD-1+ tra le cellule T CD4, le cellule T CD8 e le cellule T gd nell'intestino tenue di topi sham e POI. (D) Le proporzioni di neutrofili (Ly6G+ , CD11b+), cellule dendritiche (CD11c+ , MHC-II+) e macrofagi (CD11b+ , F4/80+) tra le cellule immunitarie CD45+ Aqua- vive dell'intestino tenue di topi fittizi e POI. Il numero in ogni pannello rappresenta la percentuale dei rispettivi tipi di cella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66465/66465fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Modello murino di ileo postoperatorio

Most patients experience postoperative ileus (POI) after surgery, which is associated with increased morbidity, mortality, and hospitalization time. POI ...

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