Name: Tomografia tridimensionale tridimensionale ad alta risoluzione di infezioni microbiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Scopri la tomografia a due fotoni per rilevare singoli batteri Salmonella negli organi infetti. Questo metodo avanzato consente di studiare la persistenza batterica durante la terapia antibiotica e le interazioni ospite-patogeno.

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Il lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica 310030_156818, 310030_182315 e da NCCR_ 180541 AntiResist (to DB).

Tracciamento di patogeni di tutto l'organo tramite quantificazione con reporter fluorescente

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<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
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<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
<li>Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Salmonella+gene+expression+in+an+infected+mammalian+host+using+the+green+fluorescent+protein+and+two-colour+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry.</a> Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).</li>
<li>Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+Asd%2B+expression-cloning+vector%3A+stable+maintenance+and+high+level+expression+of+cloned+genes+in+a+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22vaccine+strain%22%5BJournal%5D)">Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella.</a> vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il contesto tissutale locale dei patogeni batterici è cruciale per determinare gli attacchi locali dell'ospite, gli adattamenti batterici, l'esito locale delle interazioni tra patogeni dell'ospite e la chemioterapia antimicrobica e i contributi individuali all'esito complessivo della malattia. L'imaging di batteri di dimensioni micrometriche in organi di dimensioni centimetriche è stato impegnativo. La tomografia seriale a due fotoni (STP) fornisce una risoluzione spaziale sufficiente per rilevare singole cellule batteriche in interi organi, sezionamento e imaging automatizzati e una produttività sufficiente (~1 organo al giorno)11. Mentre gli antigeni dell'ospite possono essere colorati in vivo, le cellule patogene dovrebbero esprimere proteine fluorescenti adeguate per garantire il rilevamento completo delle cellule patogene intracellulari. I set di dati risultanti (0,5-1,5 TeraByte per organo) pongono sfide sostanziali alle infrastrutture IT per l'analisi e l'archiviazione dei dati.
Ci sono diversi passaggi critici in questo metodo. In primo luogo, è necessario un ceppo patogeno con espressione rilevabile e omogenea della proteina fluorescente GFP o YFP. Idealmente, una cassetta di espressione cromosomica25 viene utilizzata per ridurre al minimo l'eterogeneità della fluorescenza dovuta alla variazione del numero di copie del plasmide. È richiesta un'intensità di fluorescenza sufficiente, ma devono essere evitati livelli eccessivi di proteina fluorescente per evitare compromessi di fitness del patogeno23. Livelli di espressione appropriati possono essere ottenuti selezionando un promotore appropriato e mettendo a punto il sito di legame ribosomiale25 o l'intera regione 5' non tradotta (UTR)26. In secondo luogo, la fissazione della perfusione dovrebbe comportare un lavaggio iniziale con tampone per rimuovere il maggior numero possibile di eritrociti dalla circolazione sanguigna. Questo è particolarmente critico per la milza e il fegato (anche se la rimozione completa degli eritrociti da questi organi è difficile). Gli eritrociti rimanenti assorbono la luce nella parte visibile dello spettro, compromettendo la qualità dell'imaging27. In terzo luogo, la conservazione dei tessuti fissati nel crioprotettore è fondamentale per ridurre l'autofluorescenza tissutale, che è particolarmente elevata nei tessuti infiammati e può mettere in ombra la fluorescenza relativamente debole delle cellule patogene11. In quarto luogo, l'efficace reticolazione del tessuto con il blocco di agarosio circostante è fondamentale per un taglio regolare del vibratomo senza che il tessuto salti fuori dal blocco di agarosio. In quinto luogo, i segnali fluorescenti e la loro identificazione come cellule patogene devono essere verificati in modo indipendente utilizzando approcci ortogonali come la colorazione con anticorpi contro componenti patogeni (come il lipopolisaccaride per i batteri Gram-negativi) e la microscopia confocale delle sezioni recuperate dal tomografo11. Alcuni tessuti infetti contengono particelle autofluorescenti con forma simile e spettri di fluorescenza sovrapposti che possono essere facilmente interpretati erroneamente come cellule patogene. In sesto luogo, la quantità di cellule patogene all'interno delle microcolonie dovrebbe essere confrontata con approcci ortogonali come la microscopia confocale per valutarne l'accuratezza. Le cariche batteriche complessive basate su questi calcoli devono essere verificate confrontandole con approcci ortogonali come la citometria a flusso e la piastra.
Importanti modifiche al protocollo STP, ampiamente utilizzato, includono il posizionamento di un filtro passa-banda stretto a 510/20 nm davanti al fotomoltiplicatore 211, per ridurre l'interferenza dell'autofluorescenza verde-gialla che è particolarmente forte nel fegato, nella milza e nelle chiazze di Peyer infette e infiammate. La forte autofluorescenza e l'aumento della dispersione della luce di tali organi rispetto al cervello (che domina altre applicazioni della STP) generano anche la necessità di una correzione più efficace per l'illuminazione irregolare. Come altra modifica, questo protocollo impiega l'approccio CIDRE22 per questo scopo (Figura 3) e la segmentazione dei batteri basata sull'intelligenza artificiale. Infine, il pretrattamento tissutale è stato modificato includendo una fase di incubazione nel crioprotettore a -20 °C che riduce l'autofluorescenza tissutale e quindi facilita il rilevamento di piccole cellule patogene con fluorescenza relativamente debole11.
La risoluzione dei problemi potrebbe essere necessaria se non è possibile rilevare alcun segnale patogeno o se la segmentazione produce una sensibilità insufficiente (troppe cellule patogene vengono perse) o una precisione insufficiente (troppe particelle di fondo vengono segmentate come cellule patogene). Se l'autofluorescenza tissutale di fondo è rilevabile ma ci sono troppo pochi segnali patogeni, i patogeni potrebbero contenere quantità insufficienti di proteine fluorescenti. Questo può essere testato utilizzando la microscopia confocale di sezioni di tessuto dello stesso tessuto infetto o la citometria a flusso di omogeneizzati tissutali19,28. Le ragioni sottostanti potrebbero essere livelli di espressione insufficienti o instabilità della cassetta di espressione. Le strategie di mitigazione potrebbero includere promotori alternativi per guidare l'espressione, l'adattamento dei codoni dei geni che codificano la proteina fluorescente per le specie patogene, l'impiego di costrutti episomiali con un numero di copie più elevato o la stabilizzazione delle cassette di espressione mediante integrazione cromosomica o complementazione bilanciata-letale29. Anche la scelta della proteina fluorescente è importante, ma il rilevamento è possibile con GFP.mut2, mWasabi, YPet e TIMERbac. Se la segmentazione è imprecisa, ciò potrebbe essere causato da una fluorescenza del patogeno troppo debole che potrebbe essere affrontata come descritto sopra, o da un fondo di autofluorescenza tissutale troppo elevato. Un'estesa perfusione della soluzione di lavaggio o un'incubazione prolungata nel tampone di conservazione immediatamente prima dell'inclusione nel blocco di agarosio e nella tomografia potrebbero risolvere questi problemi. Infine, è necessario un addestramento sufficiente della rete neurale per una classificazione precisa, ma un addestramento eccessivo può portare a un overfitting che compromette le prestazioni per i nuovi campioni.
Attualmente, nessun altro metodo è in grado di visualizzare interi organi con una risoluzione spaziale sufficiente in 3D per rilevare singoli batteri. I futuri miglioramenti nella pulizia dei tessuti e nella microscopia a foglio di luce potrebbero raggiungere una risoluzione simile. Ciò potrebbe consentire l'imaging a velocità più elevata e con più canali fluorescenti.
Un'importante limitazione dell'STP è la risoluzione dei pixel nel piano di ~0,5 μm e la risoluzione verticale da 5 a 10 μm, che è insufficiente per risolvere batteri vicini, ad esempio all'interno di una microcolonia densamente compatta. Tuttavia, è possibile recuperare sezioni di tessuto dopo la tomografia per la microscopia confocale secondaria ad alta risoluzione di parti di tessuto selezionate. Un'altra limitazione dell'STP è la disponibilità di soli tre canali di fluorescenza, che limita il numero di fluorofori che possono essere visualizzati contemporaneamente. Anche in questo caso, l'analisi secondaria delle sezioni di tessuto recuperate con metodi di multiplexing può rivelare la posizione e l'intensità di molti più marcatori per parti di tessuto selezionate. Queste informazioni potrebbero essere integrate nella struttura 3D complessiva del tessuto circostante come determinato con STP.
In conclusione, questo protocollo consente indagini dettagliate sulle interazioni ospite-patogeno a livello locale e di intero organo. Il protocollo dovrebbe essere facilmente adattabile ad altri agenti patogeni (a condizione che possano essere ottenuti come ceppi fluorescenti), ad altri organi e a diverse specie ospiti.

Le infezioni si verificano in tessuti con anatomia complessa e fisiologia compartimentalizzata. I diversi microambienti che coesistono nel tessuto infetto possono determinare il destino dei sottogruppi di patogeni locali e il loro contributo all'esito complessivo della malattia 1,2,3. Tuttavia, la mappatura 3D completa dei patogeni microbici in tessuti di dimensioni centimetriche rimane impegnativa4. L'imaging del cervello e di altri organi è un campo di ricerca molto attivo con strategie sperimentali in costante miglioramento5, ma molti metodi mancano ancora della risoluzione inferiore al μm che sarebbe necessaria per identificare con sicurezza i patogeni batterici di dimensioni μm. Al contrario, la tomografia seriale a due fotoni (STP)6 consente l'imaging automatizzato multicolore e privo di deformazioni di interi tessuti con risoluzione in piano inferiore al μm, producendo set di dati volumetrici completi. Questo metodo combina il sezionamento fisico ripetuto del tessuto utilizzando un vibratomo con l'imaging intermittente a due fotoni delle facce emergenti del blocco con luce infrarossa. La tomografia STP è stata ampiamente utilizzata per mappare gli assoni sottili nel cervello per stabilire mappe di connettività 7,8,9,10.
La tomografia STP consente inoltre la mappatura 3D di singole cellule microbiche patogene (Salmonella, Toxoplasma) in tutti i tessuti infetti11,12 utilizzando un tomografo. La generazione della seconda armonica rivela guaine di collagene attorno alle arterie e nelle bande fibrose come le trabecole della milza, fornendo così un contesto anatomico. Gli anticorpi fluorescenti iniettati in vivo possono essere utilizzati per colorare le cellule ospiti per rivelare le interazioni tra le singole cellule patogene e le cellule immunitarie infiltranti come i neutrofili. Qui viene descritta la pipeline che coinvolge l'elaborazione del tessuto, l'imaging, lo stitching di piastrelle di imaging con correzione dell'illuminazione, l'impilamento di immagini in tre dimensioni e la segmentazione utilizzando strumenti di apprendimento automatico. Questa pipeline produce posizioni 3D di singoli agenti patogeni, cellule e microcolonie all'interno del loro contesto ospite. Il conteggio del numero di singole cellule all'interno delle microcolonie rimane difficile a causa dei limiti di risoluzione, ma tali numeri possono essere stimati in base alla luminosità integrata della microcolonia. La pipeline può essere facilmente adattata ad altri modelli di infezione se sono disponibili patogeni ricombinanti che esprimono GFP o YFP.

<table><tbody><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosio Low Melt</td><td>Roth</td><td>Art. 6351.5 25g</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo istantaneo Loctite 435</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>Boroidruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71321-25g</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Merck</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>Periodato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodio tetraborato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732-100g</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris-tamponed salino (TBS)</td><td>Merck</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Vuoto filtrazione 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Campden Instruments Limited&nbsp;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAI Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stampo in plastica staccabile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>TissueCyte 1000 tomografo</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibody/coloranti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primary anticorpi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-LPS Salmonella, coniglio</td><td>Sifin</td><td>REF TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD169-PE, clone 3D6.112</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td></td><td></td>142403</tr><tr><td>anti-Ly-6G-PE, clone 1A8</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>127608</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi secondari</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pollo anti-coniglio Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Company</td><td>Version</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Image J</td><td>1.54g o successivo</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MATLAB MathWorks</td><td>2017b/2018b o successivo</td><td></td></tr><tr><td>Orchestratore (tomografo)</td>Software di visualizzazione <td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0 o successivo</td><td></td></tr></tbody></table>

tomografia tridimensionale tridimensionale ad alta risoluzione di infezioni microbiche

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

La maggior parte delle infezioni avviene all'interno di tessuti ospiti tridimensionali con un'anatomia complessa e una fisiologia dell'ospite variabile localmente. Il posizionamento delle cellule patogene all'interno di questo ambiente diversificato influenza in modo significativo i loro livelli di stress, le risposte, il destino e il contributo alla progressione complessiva della malattia e al fallimento del trattamento. Tuttavia, a causa delle difficoltà tecniche nel localizzare cellule patogene di dimensioni μm all'interno di organi ospiti di dimensioni cm, quest'area di ricerca è stata relativamente inesplorata. Qui presentiamo un metodo per affrontare questa sfida. Utilizziamo la tomografia seriale a due fotoni e l'analisi delle immagini potenziata dall'intelligenza artificiale per localizzare le singole cellule di Salmonella in tutta la milza, i lobi epatici e i linfonodi interi dei topi infetti. Utilizzando reporter fluorescenti e la somministrazione di anticorpi in vivo , è possibile determinare il tasso di replicazione delle singole cellule di Salmonella , la loro interazione locale con specifiche cellule immunitarie e le risposte batteriche agli antibiotici. Queste metodologie aprono la strada a un esame completo delle infezioni, della loro prevenzione e del loro trattamento all'interno del contesto tissutale tridimensionale.

La procedura descritta consente il rilevamento di singole cellule di Salmonella in interi organi di topo come milza, fegato, linfonodi mesenterici e cerotti di Peyer11 (Figura 5 e Figura 6). Rileva anche i parassiti Toxoplasma gondii nel cervello del topo12. Alcuni tessuti infetti, tra cui il fegato, le chiazze di Peyer e la milza, emettono una sostanziale autofluorescenza nell'intervallo verde-giallo. L'autofluorescenza è ulteriormente potenziata dalla fissazione con paraformaldeide, necessaria per preservare la struttura tissutale. La rilevazione della fluorescenza verde da GFP, mWasabi e la componente verde di TIMERbac su questo sfondo di autofluorescenza è migliorata mettendo un filtro passa-banda stretto a 510/20 nm (che trasmette la maggior parte delle emissioni di GFP ma blocca gran parte dello spettro di autofluorescenza) davanti al fotomoltiplicatore 2 (che raccoglie le emissioni verdi) e riducendo l'autofluorescenza tissutale conservando i tessuti fissati per 3 o più giorni in crioprotettore11. Tuttavia, i batteri dovrebbero comunque esprimere almeno alcune migliaia di copie per cellula di GFP o altre proteine fluorescenti. D'altra parte, livelli eccessivi di proteine fluorescenti dovrebbero essere evitati per ridurre al minimo i costi di fitness che potrebbero portare a una virulenza attenuata23.
La corretta segmentazione dei batteri fluorescenti nei tessuti può essere confermata dall'immunoistochimica delle sezioni di tessuto recuperate dopo l'imaging. In particolare, gli oggetti colorati con un anticorpo contro i componenti batterici della superficie come il lipopolisaccaride possono essere allineati con l'immagine di fluorescenza ottenuta mediante tomografia STP (Figura 5). È importante notare che alcune cellule di Salmonella colorate mancano di proteine fluorescenti e quindi di fluorescenza rilevabile sia nella microscopia confocale che nella tomografia STP. Queste cellule sono Salmonella che sono state uccise dal sistema immunitario dell'ospite, come dimostrato dalla selezione citofluorimetrica e dalle colture di crescita da singole cellule selezionate, nonché dalla stretta correlazione tra il numero di unità formanti colonie su piastre di agar e il numero di cellule fluorescenti di Salmonella come determinato dalla citometria a flusso24. Inoltre, la perdita di plasmidi può portare a cellule vitali non fluorescenti e questo deve essere testato mediante placcatura su terreni con e senza antibiotici appropriati corrispondenti al marcatore di selezione sul plasmide. Per i plasmidi derivati da pSC101, la perdita di plasmidi in vivo è rara19. Per la maggior parte delle cassette di espressione cromosomicamente integrate come sifB::gfp utilizzate in11, la perdita di espressione non è rilevabile in vivo. Se la segmentazione non è coerente con i dati immunoistochimici, la pipeline di segmentazione deve essere modificata.
La risoluzione della tomografia STP è insufficiente per risolvere le singole cellule batteriche all'interno di microcolonie densamente impacchettate. Tuttavia, l'intensità totale della fluorescenza della microcolonia consente di stimare il numero di cellule di Salmonella . Ciò richiede un ceppo fluorescente con livelli di fluorescenza altamente omogenei come Salmonella sifB::gfp11. Combinando il numero stimato di cellule di Salmonella per tutte le microcolonie e le singole cellule si ottengono cariche tissutali batteriche totali coerenti con metodi alternativi come la piastratura o la citometria a flusso di omogeneizzati tissutali11. La piastratura e la citometria a flusso non possono essere eseguite direttamente dagli stessi tessuti perché devono essere fissate per perfusione per la tomografia STP. Invece, devono essere fatti con animali aggiuntivi che non sono fissi. Se le cariche batteriche mediane, come determinato dai vari approcci, differiscono di oltre 3 volte, la vitalità dei batteri fluorescenti potrebbe essere compromessa (nel caso di unità formanti colonie inferiori) o alcuni batteri potrebbero aver perso il costrutto reporter fluorescente (nel caso di unità formanti colonie più elevate). Sarà necessario un esperimento di controllo per identificare la fonte di tali discrepanze.
La tomografia STP fornisce la localizzazione delle cellule batteriche all'interno della struttura 3D dei tessuti infetti. I secondi segnali armonici del collagene forniscono punti di riferimento anatomici come arterie e trabecole. Inoltre, le cellule ospiti possono essere colorate in vivo iniettando un anticorpo ai marcatori di superficie prima della perfusione (Figura 5 e Figura 6). Questa colorazione fornisce ulteriori punti di riferimento per i compartimenti tissutali e i microambienti specifici, compresi i focolai di infiammazione (i marcatori intracellulari e alcuni compartimenti con barriere diffusionali come la polpa bianca splenica o il cervello non sono facilmente accessibili, adatti a questa colorazione in vivo ). Questo approccio ha rivelato che la polpa bianca splenica è un compartimento tissutale che consente la sopravvivenza a lungo termine della Salmonella durante la chemioterapia antimicrobica11.
Infine, la replicazione della Salmonella a velocità moderate o lente può essere identificata e localizzata all'interno della struttura 3D dei tessuti utilizzando ceppi che esprimono il timerbac, un reporter a singola cellula per una velocità di replicazionedi 11,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg"> Figura 1: Procedura per l'imaging dell'intero organo mediante tomografia seriale a due fotoni (STP). (A-B) L'organo viene prelevato dopo perfusione transcardica e conservato per una notte in paraformaldeide al 4% (PFA) a 4 °C. (C-E) L'organo viene incorporato in agarosio ossidato e reticolato, quindi il tessuto viene scansionato e affettato utilizzando la tomografia STP. Le fette vengono raccolte per la successiva immunoistochimica. (F-J) Pipeline di analisi computazionale per la quantificazione del numero di batteri, la conferma di batteri fluorescenti e la ricostruzione 3D delle posizioni batteriche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg"> Figura 2: Configurazione della tomografia seriale a due fotoni (STP). (A) Tomografo che incorpora (B) imaging a 2 fotoni con (C) sezionamento seriale automatizzato dei tessuti. (D) Sezioni di tessuto raccolte per indagini di follow-up. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg"> Figura 3: Cucitura delle piastrelle e correzione dell'illuminazione. Le piastrelle vengono cucite e l'illuminazione irregolare viene corretta utilizzando distribuzioni di intensità corrette utilizzando la minimizzazione dell'energia regolarizzata (CIDRE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg"> Figura 4: Segmentazione di Salmonella che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) utilizzando una Support Vector Machine (SVM) e una rete neurale convoluzionale (CNN). (A) Immagini rappresentative di oggetti GFP segmentati da SVM (a sinistra) e immagini corrispondenti (a destra) con regioni segmentate da SVM (barra di scala: 10 μm). (B) Distribuzione dei valori raggruppati rosso-verde-blu (RGB) per le regioni segmentate. (C) Immagini rappresentative di oggetti non GFP erroneamente identificati dalla SVM come batteri (a sinistra). La CNN li liquida correttamente come sfondo (a destra, barra della scala: 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg"> Figura 5: Rilevamento di Salmonella che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) mediante tomografia e conferma mediante immunoistochimica. Immagini della stessa sezione acquisite mediante tomografia (a sinistra) o microscopia confocale dopo colorazione con un anticorpo contro il lipopolisaccaride di Salmonella (a destra). I neutrofili (rosso) sono stati colorati mediante iniezione in vivo di un anticorpo anti-Ly-6G marcato con PE prima della perfusione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg"> Figura 6: Ricostruzione 3D e localizzazione di Salmonella nella milza di topo infetta. (A) Ricostruzione tridimensionale (3D) di una fetta di milza di 5 mm di spessore e colorata in vivo prima della perfusione con anticorpo anti-CD169 (rosso). Il segnale blu rappresenta il collagene rilevato dalle seconde armoniche. (B) Un piano ottico della pila 3D mostrata in (A). Le posizioni delle cellule o delle microcolonie di Salmonella sono indicate da stelle. (C) Ricostruzione 3D delle posizioni (stelle) della Salmonella nel fegato infetto. Le arterie sono visibili in base alle loro guaine di collagene (blu). Barra della scala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

In questo articolo, descriviamo una procedura che consente il rilevamento a livello di organo di batteri patogeni durante l'infezione e la quantificazione delle attività del reporter fluorescente.

Tomografia tridimensionale tridimensionale ad alta risoluzione di infezioni microbiche

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Le infezioni batteriche sono una grave minaccia per la salute umana. La resistenza antimicrobica è in aumento e mancano ancora vaccini per diversi importanti agenti patogeni. Per identificare nuove vie per le strategie di controllo, abbiamo bisogno di saperne di più su come i patogeni rispondono al sistema immunitario dell'ospite e agli antibiotici in vivo nei tessuti infetti.I batteri sopravvissuti possono causare ricadute se gli antimicrobici non riescono a sradicare un'infezione. Utilizzando la tomografia seriale, dimostriamo che la febbre tifoide che causa la salmonella può persistere durante la terapia in una parte specifica della milza. L'infiammazione è debole in questa regione, il che interrompe la sinergia critica tra antibiotici e infiammazione per un'efficace eliminazione.I batteri sono oggetti di dimensioni micrometriche. È difficile localizzare oggetti così piccoli nel loro contesto tissutale. La tomografia seriale a due fotoni può rilevare un singolo batterio in organi di dimensioni centimetriche e determinarne il tasso di replicazione.Possiamo anche rilevare le cellule immunitarie, come i neutrofili, e determinare la loro relazione spaziale con i batteri. Studiamo le attività degli antibiotici batteriostatici. Questi antibiotici possono curare le infezioni, anche se possono solo inibire la crescita batterica senza uccidere effettivamente l'agente patogeno.Determiniamo anche la diffusione di mutanti batterici privi di determinati fattori di virulenza e l'impatto dei difetti immunitari sull'infezione e sul trattamento.

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Questo protocollo spiega come preparare e montare campioni batterici per l'imaging tridimensionale dal vivo e come ricostruire la forma tridimensionale di E. coli da queste immagini.

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