Name: Analisi dellunione di estremità non omologhe e dellefficienza di ricombinazione omologa in cellule HEK-293T utilizzando sistemi reporter basati su GFP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Scopri come analizzare l'unione di estremità non omologhe e la ricombinazione omologa in cellule HEK-293T utilizzando saggi reporter extrachromosomici basati su GFP e citometria a flusso.

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Questa ricerca è stata finanziata dalla Natural Science Foundation della provincia cinese di Heilongjiang (YQ2022C036) e dalla Graduate Innovation Foundation della Qiqihar Medical University (QYYCX2022-06). Figura 1 prodotta utilizzando MedPeer.

1. Isolamento plasmidico
<ol><li>Trasformare E. coli competente con i plasmidi EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plasmide che esprime I-Sce I) e PCI2-HA-mCherry (plasmide che esprime mCherry) (vedi Tabella dei materiali) seguendo il protocollo di trasformazione standard20. NOTA: PCI2-HA-mCherry può essere sostituito con altri plasmidi che esprimono mCherry o DsRed.</li>
	<li>Coltivare l'E. coli trasformato in 500 mL di terreno LB liquido integrato con 100 μg/mL di ampicillina per una notte a 37 °C con agitazione.</li>
	<li>Isolare i plasmidi utilizzando un maxi kit di isolamento plasmidico privo di endotossine disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Quantificare le concentrazioni di plasmidi utilizzando spettrofotometri a microvolume nanodrop. Regolare la concentrazione del plasmide a 1 μg/μL.</li>
</ol>2. Preparazione e trasfezione cellulare
<ol><li>Coltura di cellule HEK-293T in terreno DMEM integrate con il 10% di siero fetale bovino. Assicurarsi che le cellule HEK-293T o le cellule stabili HEK-293T siano in buono stato di crescita. NOTA: Le celle congelate devono essere sottoposte ad almeno due cicli di scissione prima della trasfezione.</li>
	<li>Il giorno prima della trasfezione, seminare le cellule HEK-293T in una piastra a 6 pozzetti a 2 × 105 cellule/pozzetto per ottenere una confluenza di circa il 60% il giorno successivo.</li>
	<li>Il giorno della trasfezione, confermare la confluenza cellulare, puntando a circa il 60%. Per il test NHEJ, trasfettare le cellule del campione sperimentale in una piastra a 6 pozzetti con 1 μg di EJ5-GFP, 1 μg di pCBASceI e 1 μg di plasmidi PCI2-HA-mCherry, utilizzando un reagente di trasfezione commerciale seguendo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali). Per il test HR, sostituire il plasmide EJ5-GFP con il plasmide DR-GFP.</li>
	<li>Per i controlli di calibrazione FACS, lasciare un pozzetto di cellule non trasfettate come controllo negativo. Tranfettare le cellule in una piastra a 6 pozzetti con (1) 1 μg di EJ5-GFP (per il test NHEJ) o 1 μg di DR-GFP (per il test HR), insieme a 1 μg di pCBASceI come controllo GFP a colore singolo, o (2) 1 μg di PCI2-HA-mCherry come controllo mCherry a colore singolo.</li>
</ol>3. Analisi delle cellule GFP-positive e mCherry-positive mediante citometria a flusso
<ol><li>Due giorni dopo la trasfezione, confermare l'espressione delle proteine GFP e mCherry utilizzando un microscopio a fluorescenza.</li>
	<li>Tre giorni dopo la trasfezione, rimuovere il terreno dai pozzetti, lavare una volta con PBS e aggiungere 500 μL di tripsina a ciascun pozzetto. Incubare per 5 minuti a 37 °C per staccare tutte le cellule dalla piastra. Durante questo e i passaggi successivi, proteggi le celle dalla luce diretta.</li>
	<li>Aggiungere 500 μl di terreno DMEM completo a ciascun pozzetto, risospendere le cellule, assicurandosi che non siano visibili grumi.</li>
	<li>Trasferire tutte le cellule da ciascun pozzetto in provette da centrifuga da 1,5 mL, quindi centrifugare le celle per 2 minuti a 1000 × g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante mediante pipettaggio e lavare una volta con 1,0 mL di PBS.</li>
	<li>Anche in questo caso, rimuovere con cura il surnatante mediante pipettaggio, risospendere le cellule in 500 μl di PBS e trasferire le cellule in provette FACS (vedere la Tabella dei materiali). NOTA: Per ottenere risultati ottimali, iniziare l'analisi della citometria a flusso subito dopo il prelievo delle cellule. In alternativa, le cellule possono essere conservate sul ghiaccio per diverse ore.</li>
	<li>Calibrare il FACS con celle non trasfettate (controllo negativo), celle trasfettate EJ5-GFP/DR-GFP e pCBASceI (controllo monocolore GFP) e celle trasfettate mCherry (controllo monocolore mCherry). Regolare la tensione e la compensazione per ridurre al minimo lo spillover della fluorescenza tra GFP e mCherry.</li>
	<li>Acquisire e registrare almeno 10.000 cellule intatte da ciascuna provetta.</li>
</ol>4. Analisi dei dati
NOTA: I seguenti passaggi vengono eseguiti utilizzando il software FlowJo (vedere la tabella dei materiali) per analizzare i dati FACS. Procedure comparabili possono essere eseguite in software di analisi alternativi.
<ol><li>Trascinare tutti i file FACS nel dashboard. Fare doppio clic su uno dei file per visualizzare il grafico FSC/SSC.</li>
	<li>Crea un cancello poligonale per selezionare le celle intatte, esclusi i detriti nell'angolo in basso a sinistra. Assegna a questa sottopopolazione il nome "Celle intatte" e trascina questo cancello sulla barra "Tutti i campioni". Scorrere ogni campione utilizzando il pulsante Campione successivo per garantire un gating appropriato per ciascun campione (Figura 2A).</li>
	<li>Fare doppio clic sulla sottopopolazione Celle intatte del campione di controllo negativo (cellule non trasfettate) per visualizzare un nuovo grafico. Modificare gli assi in FL1-H (asse x, GFP) e FL2-H (asse y, mCherry).</li>
	<li>Selezionare lo strumento Quad Gating e fare clic sull'estremità superiore destra della popolazione di celle negative (Figura 2B). Trascina i quattro cancelli rettangolari sulla barra "Celle intatte". Scorrere i campioni del controllo a colore singolo GFP o del controllo a colore singolo mCherry utilizzando il pulsante Campione successivo per garantire un gating appropriato per discriminare le celle di controllo GFP-positive o mCherry positive da quelle negative (Figura 2C,D). Se necessario, regolare il gating del quadrante e applicarlo a tutte le popolazioni di "Celle intatte".</li>
	<li>Fare clic sull'editor di layout. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui grafici rappresentativi e scegliere Copia nell'editor di layout. Selezionare tutti i grafici rappresentativi, quindi fare doppio clic per aprire Definizione grafico. Regolare l'etichetta, l'annotazione e la legenda dell'asse come desiderato.</li>
	<li>La percentuale di cellule mCherry-positive nei campioni sperimentali funge da controllo dell'efficienza della trasfezione. Calcola l'efficienza relativa della riparazione del DNA confrontando il numero di cellule GFP-positive con il numero di cellule mCherry-positive nello stesso grafico.</li>
</ol>

Analisi FACS delle cellule reporter GFP e mCherry per valutare l'efficienza di NHEJ e HR

<ol><li>Huang, R., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+repair%3A+historical+perspectives%2C+mechanistic+pathways+and+clinical+translation+for+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).</li>
<li>Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhomologous+DNA+end-joining+for+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).</li>
<li>Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+the+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).</li>
<li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li>
<li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative-NHEJ+Is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).</li>
<li>Zuo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+end-joining+in+HNSC+cell+lines+using+DNA+Double-strand+break+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays.</a> Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).</li>
<li>Schrank, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ARP2%2F3+drives+DNA+break+clustering+for+homology-directed+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair.</a> Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).</li>
<li>Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+promotes+chromatin+decondensation+to+facilitate+initiation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response.</a> Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hCINAP+regulates+the+DNA-damage+response+and+mediates+the+resistance+of+acute+myelocytic+leukemia+cells+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy.</a> Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WASH+interacts+with+Ku+to+regulate+DNA+double-stranded+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair.</a> iScience. 25 (1), 103676(2022).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+RIG-I+and+XRCC4+connects+DNA+repair+with+RIG-I+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling.</a> Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).</li>
<li>Watkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+profiling+reveals+that+HORMAD1+overexpression+contributes+to+homologous+recombination+deficiency+in+triple-negative+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers.</a> Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP44+regulates+irradiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+and+suppresses+tumorigenesis+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma.</a> Nat Commun. 13 (1), 501(2022).</li>
<li>Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+double-strand+break+%28DSB%29+repair+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells.</a> JoVE. (43), e2002(2010).</li>
<li>Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakanishi%2C+K+%22DNA+recombination%3A+Methods+and+Protocols%22">DNA recombination: Methods and Protocols</a>. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).</li>
<li>Cavallo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+proficiency+in+homologous+recombination+underlies+the+high+sensitivity+of+embryonal+carcinoma+testicular+germ+cell+tumors+to+cisplatin+and+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition.</a> PLoS One. 7 (12), e51563(2012).</li>
<li>Unfried, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+NIHCOLE+promotes+ligation+efficiency+of+DNA+double-strand+breaks+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).</li>
<li>Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCavallo%2C+F+%22Testicular+Germ+Cell+Tumors%3A+Methods+and+Protocols%22">Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols</a>. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hanahan+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+Escherichia+coli%3A+high-efficiency+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).</li>
<li>Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+steps+of+mammalian+homologous+repair+with+distinct+mutagenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences.</a> Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse da divulgare.

Il metodo qui descritto è stato impiegato in diversi articoli per valutare l'efficienza NHEJ e l'efficienza HR 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Questo metodo è pertinente per chiarire i meccanismi alla base della riparazione del DNA DSB e identificare nuovi fattori associati a NHEJ e HR. Ad esempio, la funzione della subunità catalitica della proteina chinasi DNA-dipendente (DNA-PKcs)9, della proteina ATPasi nucleare interagente con la colina (hCINAP)10, del WASH11, del gene I inducibile dall'acido retinoico (RIG-I)12, della proteina complementante incrociata 4 di riparazione a raggi X (XRCC4)12, della proteina 1 (HORMAD1)13 contenente il dominio HORMA, della proteasi 44 specifica per l'ubiquitina (USP44)14e lncRNA NIHCOLE (RNA non codificante indotto nel carcinoma epatocellulare con un ruolo oncogenico nell'efficienza della legatura) in NHEJ o HR sono stati svelati o convalidati attraverso l'applicazione di metodi extracromosomici. A differenza dell'approccio cromosomicamente integrato, questo approccio extracromosomico consente una rapida analisi dell'efficienza NHEJ o HR attraverso l'utilizzo di linee cellulari stabili consolidate.
I saggi extracromosomici NHEJ e HR, che sono stati precedentemente utilizzati nelle cellule HEK-293T da noi e da altri 10,11,12, sono stati impiegati anche da diversi altri gruppi di ricerca in varie linee cellulari, tra cui le cellule U2OS 16,17, le cellule di carcinoma embrionale17,19, le cellule HCT116 9, le cellule SUM15913, le cellule HCC114313, le cellule MDA-MB-43613, Cellule SUNE114, cellule Huh718 e cellule JHH618. Il protocollo fornisce una descrizione dettagliata dei saggi NHEJ e HR condotti in cellule HEK-293T. Data la notevole efficienza di trasfezione delle cellule HEK-293, una combinazione di 1 μg di EJ5-GFP o 1 μg di DR-GFP, insieme a 1 μg di pCBASceI, è ritenuta adeguata per le cellule HEK-293T coltivate in una piastra a 6 pozzetti. Tuttavia, le condizioni di trasfezione possono differire in linee cellulari diverse da HEK-293T 9,16,17, richiedendo allo sperimentatore di determinare meticolosamente le condizioni esatte per una trasfezione di successo.
Raggiungere la confluenza cellulare richiesta prima della trasfezione è una procedura fondamentale del protocollo. Un numero insufficiente o eccessivo di cellule può ostacolare sostanzialmente l'efficacia della trasfezione. Un numero inadeguato di cellule aggrava la tossicità post-trasfezione, impedendo così la valutazione precisa della riparazione del DSB. Inoltre, è importante utilizzare la stessa miscela di plasmidi e reagente di trasfezione all'interno di un esperimento, poiché le deviazioni nella miscela di EJ5-GFP/DR-GFP, pCBASceI, PCI2-HA-mCherry e reagente di trasfezione possono potenzialmente influire sul risultato.
Oltre a NHEJ e HR, la giunzione a estremità alternata (a-EJ) e la ricottura a filamento singolo (SSA) sono state identificate come meccanismi aggiuntivi per la riparazione dei DSB. Tuttavia, nelle cellule wild-type, NHEJ e HR sono le vie primarie per la riparazione del DSB, mentre a-EJ e SSA danno solo un contributo minore in questo senso. Vale la pena notare che il test NHEJ che utilizza il plasmide EJ5-GFP rileva sia gli eventi NHEJ che a-EJ, e quindi può essere considerato come un test per NHEJ totale, includendo sia NHEJ che a-EJ5. Un'analisi individuale di a-EJ può essere ottenuta semplicemente sostituendo l'EJ5-GFP con l'EJ2-GFP18. Saggi simili potrebbero essere eseguiti anche per analizzare l'efficienza di riparazione dell'SSA sostituendo il reporter GFP interrotto con hprtSAGFP21.

Una rottura del doppio filamento di DNA (DSB) è la forma più deleteria di danno al DNA, che può portare a instabilità del genoma, riarrangiamenti cromosomici, senescenza cellulare e morte cellulare se non riparata prontamente1. Due vie ben consolidate, l'unione delle estremità non omologhe (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR), sono riconosciute per la loro efficacia nell'affrontare i DSBdel DNA 2,3. L'HR è considerato un meccanismo privo di errori per la riparazione del DSB, utilizzando sequenze omologhe nel cromatide fratello come modello per ripristinare la configurazione originale della molecola di DNA danneggiata3. NHEJ, d'altra parte, è un percorso di riparazione DSB soggetto a errori che unisce le estremità del DNA rotte senza fare affidamento su alcun modello2.
Il test NHEJ e il test HR sono metodi classici originariamente sviluppati nel laboratorio di Jasin presso il Memorial Sloan-Kettering Cancer Center e utilizzati per quantificare l'efficienza di NHEJ e HR, rispettivamente 4,5,6,7. Questi saggi svolgono un ruolo cruciale nello studio dei meccanismi e dei fattori rilevanti associati a NHEJ e HR 8,9,10,11,12,13,14. Entrambi i test si basano sull'implementazione di due reporter GFP interrotti, EJ5-GFP e DR-GFP, per monitorare la riparazione dei DSB indotta dall'endonucleasi I-SceI. Il reporter EJ5-GFP è impiegato nel test NHEJ, mentre il reporter DR-GFP è utilizzato nel test HR. Ogni reporter è sottilmente progettato in modo che i DSB indotti da I-Scepossano essere riparati solo da una specifica via di riparazione per ripristinare una cassetta di espressione GFP 4,5.
Il test NHEJ e il test HR possono essere condotti utilizzando un approccio cromosomicamente integrato o extracromosomico15,16. L'approccio cromosomicamente integrato richiede l'integrazione dei reporter GFP interrotti nel genoma, consentendo l'analisi della riparazione DSB all'interno di un contesto cromosomico 6,15. Tuttavia, questo approccio richiede un passaggio cellulare prolungato e non è adatto per studi comparativi che coinvolgono più linee cellulari a causa di un'integrazione cromosomica arbitraria, introducendo un ulteriore fattore di confusione oltre alle differenze intrinseche. In questo protocollo, descriviamo il saggio NHEJ extracromosomico e i saggi HR, che coinvolgono la trasfezione transitoria dei plasmidi GFP e I-SceI interrotti in cellule HEK-293T, seguita da analisi di citometria a flusso (il flusso di lavoro dell'esperimento è mostrato nella Figura 1). Questi saggi reporter non integrati sono stati originariamente riportati dal laboratorio di Jasin per studiare la riparazione dei legami incrociati tra i filamenti di DNA16 e sono stati impiegati per valutare l'efficienza NHEJ e l'efficienza HR da diversi laboratori 9,10,11,12,13,14,17,18,19, incluso il nostro 11. Questi approcci extracromosomici facilitano l'analisi della riparazione del DSB in studi comparativi che coinvolgono più linee cellulari stabili stabili.

<table><tbody><tr><td>Piatti da 6 cm&nbsp;</td><td>BBI</td><td>F611202-9001</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Beyotime</td><td>ST007</td><td>Concentrazione di lavoro: 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>DH5&alfa; Cellule competenti</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DR-GFP</td><td>Addgene</td><td>26475</td><td></td></tr><tr><td>EJ5-GFP</td><td>Addgene</td><td>44026</td><td></td></tr><tr><td>Kit EndoFree Maxi Plasmid&nbsp;</td><td>TIANGEN</td><td>DP117</td><td>kit alternativo per l'estrazione di plasmidi privi di endotossine può essere utilizzato</td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>FALCON</td><td>352054</td><td></td></tr><tr>Citometro a flusso <td>CLARK</td><td>FB25015</td><td></td>per <td>siero bovino fetale</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V.10.1</td> Il <td>software di analisi alternativo</td><td>Treestar</td><td></td> può essere utilizzato</tr><tr><td>Cellule HEK-293T</td><td>Infrastruttura nazionale della risorsa della linea cellulare</td><td>1101HUM-PUMC000091</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td>possono essere utilizzati reggenti di trasfezione alternativi</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>pCBASceI</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td>I-SceI che esprime il plasmide</td></tr><tr><td>PCI2-HA-mCherry</td><td></td><td></td><td>è possibile utilizzare plasmidi alternativi contenenti DsRed</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi dell'unione di estremità non omologhe e dell'efficienza di ricombinazione omologa in cellule hek-293t utilizzando sistemi reporter basati su gfp

Analysis of Nonhomologous End Joining and Homologous Recombination Efficiency in HEK-293T Cells Using GFP-Based Reporter Systems

Le rotture del doppio filamento del DNA (DSB) rappresentano le lesioni del DNA più pericolose, in grado di indurre una sostanziale perdita di informazioni genetiche e la morte cellulare. In risposta, le cellule impiegano due meccanismi primari per la riparazione del DSB: l'unione delle estremità non omologa (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR). Quantificare separatamente l'efficienza di NHEJ e HR è fondamentale per esplorare i meccanismi e i fattori rilevanti associati a ciascuno. Il test NHEJ e il test HR sono metodi consolidati utilizzati per misurare l'efficienza dei rispettivi percorsi di riparazione. Questi metodi si basano su plasmidi meticolosamente progettati contenenti un gene della proteina fluorescente verde (GFP) interrotto con siti di riconoscimento per l'endonucleasi I-SceI, che induce DSB. Qui, descriviamo il saggio NHEJ extracromosomico e il saggio HR, che comportano la co-trasfezione di cellule HEK-293T con plasmidi EJ5-GFP/DR-GFP, un plasmide che esprime I-SceI e un plasmide che esprime mCherry. I risultati quantitativi dell'efficienza NHEJ e HR si ottengono calcolando il rapporto tra le cellule GFP-positive e le cellule mCherry-positive, come contato mediante citometria a flusso. A differenza dei saggi cromosomicamente integrati, questi saggi extracromosomici sono più adatti per condurre indagini comparative che coinvolgono più linee cellulari stabili stabili.

Per garantire l'accuratezza dell'analisi NHEJ e HR, è necessaria l'implementazione di un'adeguata strategia di adeguamento retributivo e di gating. Tipicamente, la fluorescenza di mCherry non si manifesta nel rivelatore GFP quando si utilizza un filtro da 530 nm. Tuttavia, nei casi di cellule che presentano un'espressione estremamente elevata di GFP, la fluorescenza GFP può contaminare il rivelatore mCherry quando si utilizza un filtro a 575 nm. Per affrontare queste preoccupazioni, sono stati utilizzati campioni di controllo negativo, controllo monocolore GFP e campioni di controllo monocolore mCherry per la compensazione e per regolare la strategia di gating. I risultati tipici del FACS delle celle di controllo sono mostrati nella Figura 2. La regolazione della compensazione e la strategia di gating dovrebbero posizionare la maggior parte delle celle GFP-positive nel quadrante inferiore destro (Figura 2C) e la maggior parte delle celle mCherry-positive nel quadrante superiore sinistro (Figura 2D).
I grafici rappresentativi finali sono mostrati nella Figura 3A, B. A seguito dell'induzione di DSB da parte di I-SceI, eventi di riparazione riusciti ricostituiranno il gene GFP. Quindi, la percentuale di cellule GFP-positive corrisponde all'efficienza della riparazione del DNA DSB e all'efficienza della trasfezione. La percentuale di celle mCherry-positive corrisponde solo all'efficienza di trasfezione. L'efficienza relativa della riparazione del DNA DSB può essere calcolata come il rapporto tra le cellule GFP-positive e le cellule mCherry-positive (Figura 3C).
Un esempio concreto del test NHEJ per caratterizzare il ruolo della proteina della sindrome di Wiskott-Aldrich e dell'omologo SCAR (WASH) nella riparazione del DNA è mostrato nella Figura 4. In questo esempio, abbiamo eseguito il test NHEJ per valutare l'efficienza NHEJ delle cellule shControl e delle cellule shWASH (Figura 4). Ovviamente, la perdita di WASH ha comportato una riduzione dell'efficienza NHEJ, confermando il ruolo di WASH nel promuovere l'efficienza NHEJ come determinato dal test NHEJ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro per il test NHEJ/HR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig02.jpg"> Figura 2: Strategia di gating per l'analisi della citometria a flusso. (A) Gating FSC-H/SSC-H su cellule intatte. (B) Le cellule HEK-293T non trasfettate sono state utilizzate come controllo negativo per escludere le celle autofluorescenti. (C) Le cellule HEK-293T trasfettate con i plasmidi EJ5-GFP e pCBASceI sono state utilizzate per impostare il gating per le cellule GFP-positive. (D) Le cellule HEK-293T trasfettate con plasmidi mCherry sono state utilizzate per impostare il gating per le cellule mCherry-positive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig03.jpg"> Figura 3: Risultati tipici. (A) Grafici rappresentativi che illustrano l'analisi del NHEJ. (B) Grafici rappresentativi che illustrano l'analisi delle risorse umane. (C) Schema del modello del metodo di calcolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig04.jpg"> Figura 4: WASH promuove l'efficienza NHEJ. (A) Grafici rappresentativi che illustrano l'analisi dell'efficienza NHEJ nelle celle shControl e shWASH. (B) Risultati statistici rappresentativi che confrontano l'efficienza NHEJ tra le celle shControl e shWASH. I dati sono presentati come media ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un saggio di giunzione delle estremità extracromosomiche non omologhe (NHEJ) e un saggio di ricombinazione omologa (HR) per quantificare l'efficienza di NHEJ e HR nelle cellule HEK-293T.

Analisi dell'unione di estremità non omologhe e dell'efficienza di ricombinazione omologa in cellule HEK-293T utilizzando sistemi reporter basati su GFP

DNA double-strand breaks (DSBs) represent the most perilous DNA lesions, capable of inducing substantial genetic information loss and cellular demise. In ...

Le rotture del doppio filamento del DNA rappresentano le lesioni del DNA più pericolose. In risposta, le cellule impiegano due meccanismi primari per la riparazione della rottura del doppio filamento del DNA, NHEJ e HR. Quantificare separatamente l'efficienza di NHEJ e HR è fondamentale per esplorare i meccanismi e i fattori rilevanti ad essi associati. Il test NHEJ e il test HR sono metodi consolidati utilizzati per misurare l'efficienza di NHEJ e HR. Questi metodi si basano su plasmidi meticolosamente progettati che contengono un gene proteico fluorescente verde interrotto con siti di riconoscimento per l'endonucleasi I-SceI per l'induzione di DSB.Il test NHEJ e il test HR possono essere condotti utilizzando un approccio cromosomicamente integrato o extracromosomico. L'approccio cromosomicamente integrato consente l'analisi della riparazione di DSB all'interno di un contesto cromosomico. Tuttavia, l'approccio cromosomicamente integrato richiede una cellula prolungata e non è adatto per studi comparativi che coinvolgono più linee cellulari.In questo protocollo, descriviamo i saggi extracromosomici NHEJ e HR che coinvolgono la trasfezione transitoria dei plasmidi GFP e I-SceI interrotti in cellule HEK-293T e la successiva analisi della citometria a flusso. Questi saggi reporter non integrati sono stati impiegati per valutare l'efficienza NHEJ e l'efficienza delle risorse umane da diversi laboratori, incluso il nostro. A differenza dell'approccio cromosomicamente integrato, questo approccio extracromosomico consente un'analisi rapida dell'efficienza NHEJ o HR attraverso l'utilizzo di linee cellulari stabili e stabili.

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