Analisi dell'unione di estremità non omologhe e dell'efficienza di ricombinazione omologa in cellule HEK-293T utilizzando sistemi reporter basati su GFP

Le rotture del doppio filamento del DNA rappresentano le lesioni del DNA più pericolose. In risposta, le cellule impiegano due meccanismi primari per la riparazione della rottura del doppio filamento del DNA, NHEJ e HR. Quantificare separatamente l'efficienza di NHEJ e HR è fondamentale per esplorare i meccanismi e i fattori rilevanti ad essi associati. Il test NHEJ e il test HR sono metodi consolidati utilizzati per misurare l'efficienza di NHEJ e HR. Questi metodi si basano su plasmidi meticolosamente progettati che contengono un gene proteico fluorescente verde interrotto con siti di riconoscimento per l'endonucleasi I-SceI per l'induzione di DSB.

Il test NHEJ e il test HR possono essere condotti utilizzando un approccio cromosomicamente integrato o extracromosomico. L'approccio cromosomicamente integrato consente l'analisi della riparazione di DSB all'interno di un contesto cromosomico. Tuttavia, l'approccio cromosomicamente integrato richiede una cellula prolungata e non è adatto per studi comparativi che coinvolgono più linee cellulari.

In questo protocollo, descriviamo i saggi extracromosomici NHEJ e HR che coinvolgono la trasfezione transitoria dei plasmidi GFP e I-SceI interrotti in cellule HEK-293T e la successiva analisi della citometria a flusso. Questi saggi reporter non integrati sono stati impiegati per valutare l'efficienza NHEJ e l'efficienza delle risorse umane da diversi laboratori, incluso il nostro. A differenza dell'approccio cromosomicamente integrato, questo approccio extracromosomico consente un'analisi rapida dell'efficienza NHEJ o HR attraverso l'utilizzo di linee cellulari stabili e stabili.