Name: Differenziamento e caratterizzazione di osteoclasti da cellule staminali pluripotenti indotte umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Scopri il differenziamento di osteoclasti da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo metodo fornisce un protocollo affidabile per la ricerca sulle malattie ossee e l'ingegneria tissutale.

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Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Giachelli per il loro aiuto tecnico e supporto. Ringraziamo il Centro di Microscopia W. M. Keck e il direttore del Centro Keck, Dr. Nathanial Peters, per l'assistenza nell'ottenere le immagini di microscopia confocale e microscopia a campo largo. Si ringraziano inoltre la UW Flow Core Facility e il Flow Core Facility manager, Aurelio Silvestroni, per il supporto tecnico e l'assistenza. Infine, ringraziamo Hannah Blümke per il supporto con l'illustrazione e il graphic design.
Il finanziamento è stato fornito attraverso la sovvenzione R35 HL139602-01 del National Institutes of Health. Riconosciamo anche la sovvenzione NIH S10, la OD016240 S10 per il finanziamento dello strumento presso il W. M. Keck Center e la sovvenzione NIH 1S10OD024979-01A1 per il finanziamento dello strumento presso la UW Flow Core Facility.

NOTA: Tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo sono riportati nella Tabella dei materiali. Se non diversamente specificato, tutti i fluidi sono stati pre-bilanciati a 37 °C prima dell'uso. Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a 37 °C e utilizzando la modalità di accelerazione/decelerazione più lenta. Se non diversamente specificato, il surnatante viene sempre rimosso utilizzando pipette di vetro Pasteur monouso.
1. Scongelamento e propagazione delle iPSC umane
<ol><li>Un giorno prima dello scongelamento delle iPSC, rivestire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di un estratto di membrana basale a una concentrazione di 200-300 μg/mL. Posizionare la piastra a pozzetto a 4 °C per una notte.</li>
	<li>Il giorno successivo, scongelare e trasferire le cellule in una provetta da 15 ml utilizzando una pipetta P1000. A goccia, aggiungere 5-7 mL di DMEM/F-12 con 15 mM di HEPES.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min. Rimuovere delicatamente le cellule dalla centrifuga e assicurarsi di non disturbare il pellet cellulare.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta di vetro Pasteur e risospendere le cellule in 1 mL di terreno privo di siero hiPSC (hiPSC-SFM contenente 10 μM di inibitore della Rho chinasi (ROCK) Y-27632) utilizzando P1000 con punte a foro largo.</li>
	<li>Aspirare l'estratto di membrana basale dal pozzetto rivestito il giorno precedente (passaggio 1.1) e trasferire 1 mL di hiPSC-SFM con 10 μM Y-27632 nel pozzetto. Aggiungere le iPSC risospese al pozzetto per raggiungere un volume finale di 2 mL per pozzetto.</li>
	<li>Agitare la piastra per distribuire uniformemente gli aggregati iPSC prima di metterli in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 .</li>
	<li>Eseguire cambi di terreno a giorni alterni utilizzando hiPSC-SFM (senza l'aggiunta dell'inibitore ROCK Y-27632). Le iPSC di solito raggiungono il 70-80% di confluenza dopo 3-4 giorni di propagazione.</li>
</ol>2. Passaging di iPSC
<ol><li>Un giorno prima del passaggio delle iPSC, rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con un estratto di membrana basale a una concentrazione di 200-300 μg/mL. Posizionare la piastra a pozzetto a 4 °C per una notte. NOTA: Verificare che le cellule abbiano raggiunto circa il 70-80% di confluenza. Assicurarsi che le iPSC non diventino eccessivamente confluenti (oltre l'80% di confluenza), in quanto ciò promuoverà la differenziazione spontanea.</li>
	<li>Iniziare a far passare le iPSC rimuovendo le regioni differenziate o le regioni con molti aggregati di iPSC morti sotto lo stereomicroscopio utilizzando puntali per pipette da 10 μL o 20 μL o un raschietto per cellule. Le regioni differenziate appariranno di colore più denso o più bianco. NOTA: Gli aggregati cellulari raschiati possono ancora attaccarsi parzialmente al fondo del pozzetto.</li>
	<li>Lavare più volte il fondo del pozzetto con una pipetta P1000 a foro largo per rimuovere eventuali aggregati che potrebbero essere ancora parzialmente attaccati al fondo del pozzetto.</li>
	<li>Scartare il terreno esaurito in cui sono state coltivate le iPSC che contiene gli aggregati di iPSC staccati. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</li>
	<li>Successivamente, aggiungere 1 mL di Dispase 5 U/mL per pozzetto. I bordi delle colonie di iPSC si solleveranno dalla piastra del pozzetto, che può essere osservata al microscopio stereoscopico dopo 3-5 minuti di incubazione a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere con cautela Dispase per evitare di rimuovere gli aggregati leggermente staccati e aggiungere 1 mL di DMEM/F-12 con 15 mM di HEPES. Utilizzare un sollevatore cellulare monouso per tagliare gli aggregati in piccole dimensioni. La consistenza delle dimensioni degli aggregati di iPSC può essere migliorata con uno strumento di passaggio delle cellule staminali.</li>
	<li>Lavare via gli aggregati iPSC affettati con il terreno nel pozzetto e trasferire il terreno con gli aggregati in una provetta conica da 15 mL utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL o P1000 con una punta a foro largo.</li>
	<li>Sciacquare il pozzetto con DMEM/F-12 e trasferire il terreno nella provetta da 15 mL con gli aggregati iPSC.</li>
	<li>Centrifugare gli aggregati di iPSC affettati a 200 x g per 3 minuti. Rimuovere il surnatante con una pipetta di vetro Pasteur e aggiungere 2 mL di hiPSC-SFM per rimuovere e risospendere le iPSC utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL o P1000 con puntali a foro largo.</li>
	<li>Aspirare l'estratto di membrana basale rimanente dalle piastre a pozzetti prerivestite e aggiungere 1 mL di hiPSC-SFM a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti.</li>
	<li>Trasferire le iPSC in nuovi pozzetti di una piastra a 6 pozzetti in modo che il volume finale sia di 2 mL di hiPSC-SFM per pozzetto utilizzando un P1000 con punte a foro largo. A seconda della linea iPSC, i rapporti di divisione devono essere ottimizzati. In questo caso, è stato utilizzato un rapporto di divisione 1:6.</li>
	<li>Controllare il pozzetto per gli aggregati galleggianti e le dimensioni degli aggregati allo stereomicroscopio. Idealmente, la dimensione dell'aggregato dovrebbe essere compresa tra 50 e 200 μm.</li>
	<li>Agitare la piastra del pozzetto per distribuire uniformemente le cellule sulla piastra dopo che gli aggregati sono stati trasferiti e incubare a 37 °C al 5% di CO2 fino al 70-80% di confluenza.</li>
</ol>3. Congelamento delle iPSC
<ol><li>Per congelare le cellule iPSC, le cellule di passaggio come descritto sopra (vedere il passaggio del protocollo "2. Passaggio di iPSC"). Dopo che le cellule sono state tagliate in colonie e lavate via dal fondo del pozzetto (passaggio 2.10), centrifugare gli aggregati affettati a 200 x g per 3 minuti. Aspirare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di terreno di crioconservazione senza siero per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti alla provetta da 15 mL e risospendere gli aggregati affettati utilizzando un P1000 con punta a foro largo.</li>
	<li>Trasferire le cellule in criotubi preetichettati. Chiudere le provette e trasferire le provette in un contenitore di crioconservazione prerefrigerato a 4 °C. Conservare le cellule a -80 °C per 24-48 ore.</li>
	<li>Trasferisci crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. NOTA: Un riepilogo schematico del processo di differenziazione OC è illustrato nella Figura 1.</li>
</ol>4. Induzione del corpo embrioide
<ol><li>Coltivare ed espandere un numero sufficiente di iPSC come descritto sopra per l'induzione dell'EB. NOTA: La produzione di OC può essere aumentata aumentando il numero di corpi embrioidi, che a loro volta producono una resa complessiva più elevata di cellule ematopoietiche. Un pozzetto di iPSC confluenti al 70-80% produce circa 8,4 x 105 cellule per pozzetto di un pozzetto a piastra a 6 pozzetti. Sono necessarie 12.500 iPSC unicellulari per formare un corpo embrioide.</li>
	<li>Aspirare il terreno esausto dalle colture di iPSC e risciacquare le colonie di iPSC con D-PBS.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di reagente di dissociazione a singola cellula preriscaldato a temperatura ambiente a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e agitare il recipiente di coltura per rivestire l'intera superficie del pozzetto. Incubare il recipiente di coltura a 37 °C per 5-8 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il recipiente dall'incubatore, aspirare il reagente di dissociazione a singola cellula e aggiungere 1 mL del terreno di differenziazione di fase 1 ai pozzetti, costituito da terreno privo di siero hiPSC con 50 ng/mL di proteina morfogenetica ossea umana 4 (hBMP4), 50 ng/mL di fattore di crescita endoteliale vascolare umano-165 (hVEGF), 20 ng/mL di fattore di cellule staminali umane (hSCF), e 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Staccare delicatamente le cellule risciacquando il pozzetto con il terreno Stage 1. Raggruppare le iPSC dissociate in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione di fase 1 ai pozzetti e lavare via le cellule rimanenti o utilizzare un raschietto per cellule per le colonie che non si lavano via facilmente.</li>
	<li>Dopo aver trasferito tutte le cellule nella provetta, centrifugare a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per formare un pellet cellulare. Aspirare e risospendere le cellule in un totale di 2 mL di terreno di differenziazione prebilanciato Stage 1 utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL o una P1000 con punta a foro largo.</li>
	<li>Conta le cellule utilizzando un emocitometro o un dispositivo automatico per il conteggio delle cellule. Aggiungere il terreno alla provetta da 15 mL contenente la sospensione a cellula singola per ottenere una piastra di 12.500 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti a bassissimo attacco a fondo tondo in 100 μL del terreno di differenziazione di fase 1. NOTA: Al microscopio, le cellule appariranno come una sospensione unicellulare con cellule disperse in tutto il pozzetto.</li>
	<li>Centrifugare le piastre a 96 pozzetti per 3 minuti a 100 x g. Dopo la centrifugazione, le cellule dovrebbero iniziare ad assomigliare agli sferoidi se osservate al microscopio. Mettere la piastra in un incubatore a 37 °C per 24 ore.</li>
	<li>Cambiare metà del terreno il giorno 1 e il giorno 2 con il mezzo di differenziazione della fase 1. Per migliorare l'efficienza, utilizzare una pipetta multicanale per smaltire 50 μL del terreno di differenziazione esausto dello Stadio 1 in una capsula di Petri.</li>
	<li>Dopo aver smaltito il terreno dalla piastra a 96 pozzetti, verificare la presenza di EB sotto lo stereomicroscopio che potrebbero essere stati rimossi accidentalmente. Trasferire gli EB rimossi accidentalmente sulla piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta P1000 con puntali a foro largo.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di terreno di differenziazione fresco di fase 1 a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con attacco ultrabasso a fondo tondo utilizzando una pipetta multicanale.</li>
</ol>5. Differenziamento ematopoietico
<ol><li>Un giorno prima di iniziare la differenziazione ematopoietica, rivestire un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di un estratto di membrana basale a una concentrazione di 200-300 μg/mL. Posizionare la piastra a pozzetto a 4 °C per una notte. NOTA: Ogni pozzetto riceverà 8 EB in un secondo momento di questo protocollo. A seconda del numero di EB preparati, rivestire i pozzetti in modo corrispondente.</li>
	<li>Aspirare l'estratto di membrana basale in eccesso e preriempire i pozzetti della piastra a 6 pozzetti con 3 mL del terreno di differenziazione di Stadio 2, costituito da un terreno basale ematopoietico a cui vengono aggiunti 2 mM di ultraglutammina, 55 μM di 2-mercaptoetanolo, 25 ng/mL di interleuchina umana 3 (hIL-3) e 100 ng/mL di fattore stimolante le colonie di macrofagi umani (hM-CSF).</li>
	<li>Utilizzando un P1000 con punte a foro largo, trasferire 8 EB in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Dopo il trasferimento, confermare a occhio o sotto lo stereomicroscopio che in ogni pozzetto sono presenti 8 EB. NOTA: Dopo 1 giorno, gli EB galleggianti aderiranno al fondo del pozzo. Nei 5-7 giorni successivi, dovrebbe diventare visibile una popolazione cellulare fluttuante comprendente cellule ematopoietiche. Il periodo di differenziazione ematopoietica può essere variato, a partire da 7 giorni. La differenziazione per 10 giorni ha mostrato una popolazione ematopoietica composta da grandi sottopopolazioni CD45+, CD14+ e CD11b+ .</li>
	<li>Dopo 5 giorni di trattamento con il terreno di differenziazione di fase 2, eseguire un cambio di terreno rimuovendo il terreno esausto e distribuendolo in una provetta conica da 50 ml. Pipettare lentamente per cercare di rimuovere il minor numero possibile di cellule flottanti e mantenere lo sforzo di taglio il più basso possibile. Il pipettaggio al microscopio stereoscopico può aiutare a evitare la rimozione accidentale delle cellule.</li>
	<li>Aggiungere immediatamente 1 mL di terreno di differenziazione fresco Stage 2 ai pozzetti. Al fine di recuperare eventuali cellule ematopoietiche galleggianti che potrebbero essere già presenti a questo punto del processo di differenziazione, non scartare il mezzo erogato. Piuttosto, centrifugare la provetta con il mezzo esausto a 300 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere il terreno di differenziazione fresco di fase 2 alla provetta e risospendere per staccare le cellule che potrebbero essere state trasferite con il terreno esausto.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL del terreno di differenziazione fresco di fase 2 con le cellule recuperate in ciascun pozzetto, che è stato precedentemente riempito con 1 mL di terreno di differenziazione di fase 2.</li>
	<li>Il giorno 10 della differenziazione ematopoietica, verificare la presenza di un gran numero di cellule ematopoietiche fluttuanti. Raccoglieteli raccogliendoli in una provetta da 50 ml. Possono essere congelati al 10% di DMSO, al 50% di FBS e al 40% di terreno o utilizzati immediatamente per differenziare le cellule in OC.</li>
</ol>6. Maturazione M-CSF e differenziamento OC
<ol><li>Cellule di seme ad una concentrazione di 200.000 cellule/cm2 su piastre di coltura tissutale trattate bene e trattate con alfa-MEM, integrate con FBS al 10% e 50 ng/mL hM-CSF.</li>
	<li>Per eseguire saggi funzionali o imaging, staccare le cellule mature M-CSF 3 giorni dopo la semina lavandole con PBS preriscaldato a 37 °C utilizzando un P1000 con punta a foro largo. Potrebbero essere necessarie ripetute fasi di lavaggio per staccare completamente le celle.</li>
	<li>Trasferire le cellule staccate in una provetta da 15 mL utilizzando una P1000 con punta a foro largo e centrifugare a 300 x g per 5 min. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere e sciogliere il pellet cellulare con il mezzo di differenziazione OC, costituito da alfa-MEM integrato con FBS al 10%, 50 ng/mL hM-CSF e 80 ng/mL hRANKL. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un dispositivo automatico di conteggio delle cellule e riseminare le cellule mature M-CSF a una densità di 200,00-250,000 cellule/cm2 in un materiale di coltura appropriato per saggi funzionali o imaging (ad esempio, saggi di riassorbimento osseo, vetrini coprioggetti per l'imaging, ecc.).</li>
	<li>Differenziare con il mezzo di differenziazione OC per 7-9 giorni. Eseguire un cambio completo del terreno di coltura con il terreno di differenziazione OC fresco ogni 2-3 giorni. NOTA: Gli OC multinucleati compaiono in genere dopo 5-7 giorni.</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

Questo protocollo offre un metodo affidabile e robusto per differenziare le iPSC in OC. Tuttavia, ci sono diverse insidie che si possono incontrare durante il processo di differenziazione. Le linee di iPSC umane generate da cellule di diversa origine tissutale sono state differenziate con successo utilizzando questo protocollo33. Quando si congelano le iPSC (vedere il passaggio del protocollo "3. Congelamento delle iPSC"), un pozzetto nel punto di passaggio è stato congelato in un crioviale. Durante lo scongelamento (vedere il passaggio del protocollo "1. Scongelamento e propagazione di iPSC umane"), una crioviale è stata scongelata in un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Le diverse linee di iPSC si comporteranno in modo leggermente diverso e i tassi di proliferazione variano. Il tasso di suddivisione dovrà essere regolato di conseguenza.
Quando si fanno passare le iPSC o le si dissociano in una sospensione unicellulare per l'induzione dell'EB, è importante rimuovere eventuali colonie o aggregati spontaneamente differenziati di cellule morte per migliorare l'efficacia e l'efficienza della differenziazione mesodermica ed ematopoietica. Questo può essere fatto con uno stereomicroscopio utilizzando un raschietto per cellule, puntali per pipette da una pipetta P10 o P20 o uno strumento di raschiatura costruito da una pipetta Pasteur35.
Come accennato in precedenza, questo protocollo prevede la dissociazione delle colonie di iPSC in una sospensione unicellulare per l'induzione di EB, mentre con altri protocolli, le iPSC vengono lasciate come aggregati da centrifugare per l'induzione di EB36. È stato riportato che le dimensioni, il numero di cellule, la forma e la morfologia dell'EB influenzano la differenziazione 37,38,39. Pertanto, ipotizziamo che la dissociazione in una sospensione unicellulare consenta una migliore uniformità da EB a EB in termini di dimensioni e forma dopo la centrifugazione e, quindi, risultati più coerenti nella produzione di cellule ematopoietiche31.
Sono stati descritti altri metodi per l'induzione dell'EB. Tali metodi che utilizzano una sospensione a singola cellula in combinazione con l'inibitore ROCK per migliorare la sopravvivenza cellulare sono stati segnalati per essere vantaggiosi nel controllo delle dimensioni dell'EB e dell'esito della differenziazione31.
Il metodo di induzione EB con piastra a fondo tondo a 96 pozzetti descritto in questo protocollo è adatto per la produzione su larga scala di EB e consente l'aumento della produzione di OC. Recentemente sono stati descritti metodi più innovativi per il differenziamento ematopoietico senza una fase di induzione del corpo embrioide con il potenziale di facilitare il processo di differenziazione32. Ciononostante, questi protocolli non sono ancora stati stabiliti per la differenziazione dell'OC33.
Nel protocollo sopra menzionato, descriviamo il cambiamento del mezzo il giorno 5 del differenziamento ematopoietico. Un piccolo numero di cellule fluttuanti può già apparire intorno al 4-5° giorno di differenziazione. Per evitare di scartare le cellule galleggianti, il terreno deve essere raccolto in una provetta e centrifugato prima di essere scartato. Il pellet cellulare sul fondo della provetta deve quindi essere rimosso con il mezzo fresco e deve essere trasferito nuovamente nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Tuttavia, il significato della popolazione di cellule fluttuanti precoci nel differenziamento OC deve ancora essere determinato.
La produzione di cellule ematopoietiche può essere valutata utilizzando la citometria a flusso. Alte rese di cellule CD45+, CD14+ e CD11b+ sono auspicabili per la differenziazione degli osteoclasti33. È stato riportato che la crioconservazione delle cellule ematopoietiche galleggianti raccolte è impegnativa, con tassi di recupero generalmente limitati e bassa vitalità cellulare40,41. Mediante crioconservazione delle cellule ematopoietiche in un terreno di crioconservazione costituito per il 50% da un terreno di espansione cellulare ematopoietico privo di siero (vedi Tabella dei materiali), 40% FBS e 10% DMSO, siamo stati in grado di recuperare cellule con una vitalità cellulare di circa il 90,3% ± 2,62 SD (n = 7) dopo lo scongelamento.
L'osteoclastogenesi richiede la fusione di più precursori OC mononucleati per formare osteoclasti multinucleati in grado di riassorbimento minerale e osseo. Mentre le linee cellulari murine di precursori dell'OC richiedono semplicemente l'aggiunta di RANKL per indurre la formazione di OC42, i precursori umani richiedono M-CSF aggiuntivo per la sopravvivenza e la proliferazione cellulare43. OSCAR è stato recentemente scoperto come un recettore aggiuntivo coinvolto nella differenziazione OC, anche se solo il collagene di tipo I è stato finora identificato come ligando. Mentre la ricerca di OSCAR con OC derivati da iPSC è ancora limitata, le concentrazioni suprafisiologiche in vitro di RANKL e M-CSF in una linea cellulare murina sembrano bypassare la necessità di attivazione di OSCAR44, l'attivazione di OSCAR in vivo sembra essere un segnale costimolatorio necessario per l'osteoclastogenesi45. Un ulteriore fattore da considerare è la superficie della piastra del pozzetto. È noto che le proprietà superficiali chimiche46 e fisiche47 influenzano la differenziazione degli osteoclasti e possono promuovere o ostacolare il successo della differenziazione. Una certa eterogeneità all'interno della popolazione dei precursori appare anche fondamentale per il successo della fusione degli OC, poiché diversi fattori correlati alla fusione come CD47 e DC-STAMP agiscono in diversi stadi della fusione degli osteoclasti48.
In conclusione, questo protocollo consente di differenziare l'OC umano dalle iPSC per facilitare e accelerare la ricerca sull'OC.

Gli osteoclasti (OC) sono tipi di cellule di derivazione ematopoietica 1,2, versatili che sono comunemente usati dai ricercatori in aree come la ricerca sulle malattie ossee 3,4, la ricerca sul cancro 5,6, l'ingegneria tissutale 7,8 e la ricerca sull'endoprotesi 9,10. Ciononostante, il differenziamento degli OC può essere impegnativo in quanto la fusione di precursori mononucleari in OC multinucleati è necessaria per creare OC funzionali11. Diversi fattori biologici, come l'attivatore del recettore del ligando NF-κB (RANKL) e il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), sono necessari per la differenziazione dell'OC. È stato riportato che M-CSF ha un effetto positivo sulla proliferazione cellulare, sulla sopravvivenza cellulare e sull'espressione di RANK 12,13,14. D'altra parte, RANKL si lega a RANK, che attiva cascate di segnalazione a valle che inducono l'osteoclastogenesi. L'attivazione è mediata dal fattore 6 associato al recettore del TNF (TRAF6), che porta alla degradazione del fattore nucleare del potenziatore genico del polipeptide leggero kappa nell'inibitore delle cellule B, alfa (IκB-α), una proteina legante che lega i dimeri NF-kB16,17. Quindi, la degradazione di IκB-α rilascia dimeri di NF-kB, che poi traslocano nel nucleo e inducono l'espressione dei fattori di trascrizione c-Fos e del fattore nucleare delle cellule T attivate 1 (NFATc1). Questo, a sua volta, innesca la trascrizione di una moltitudine di proteine correlate al differenziamento OC15,18. Le proteine sovraregolate come DC-Stamp e Atp6v0d2 mediano la fusione cellula-cellula dei precursori OC, portando alla formazione del sincizio 19,20,21.
Per quanto riguarda le cellule primarie umane, le PBMC CD34+ e CD14+ sono attualmente i tipi cellulari più utilizzati per il differenziamento in OC22. Tuttavia, questo approccio è limitato dall'eterogeneità all'interno della popolazione CD34+ di cellule raccolte da donatori23 e dalla loro limitata espandibilità. Le iPSC umane rappresentano una fonte alternativa per gli OC. Poiché possono essere propagati indefinitamente24, consentono l'espandibilità e l'upscaling della produzione di OC. Ciò consente la differenziazione di un gran numero di OC, il che facilita la ricerca OC.
Sono stati pubblicati diversi protocolli per la differenziazione delle iPSC in OC 25,26,27. L'intero processo di differenziazione può essere suddiviso in una parte di propagazione delle iPSC, una parte di differenziazione mesodermica ed ematopoietica e una parte di differenziazione OC. La propagazione delle iPSC prima del processo di differenziazione consente l'aumento della produzione di OC prima della differenziazione. Esistono diversi approcci per quanto riguarda il differenziamento mesodermico ed ematopoietico. Tradizionalmente, la formazione di corpi embrioidi (EB) è stata utilizzata per differenziare le cellule ematopoietiche, ma gli approcci basati sul monostrato rappresentano un'altra strategia di differenziamento ematopoietico che non richiede l'induzione di EB. Ciononostante, i sistemi basati su monostrato sembrano richiedere un'ulteriore ottimizzazione, poiché noi e altri abbiamo trovato gli approcci basati sull'EB più robusti per la differenziazione degli OC.
Qui, descriviamo la differenziazione delle OC dalle iPSC umane utilizzando un protocollo basato su EB. Questo protocollo è stato adattato da Rössler et al.26 e modificato per aumentare la robustezza e consentire la crioconservazione durante il processo di differenziazione. In primo luogo, abbiamo raccolto cellule ematopoietiche solo una volta dopo 10 giorni di differenziazione. Le cellule ematopoietiche sono state quindi crioconservate per consentire una maggiore flessibilità durante il processo di differenziazione. Inoltre, abbiamo aumentato la densità di semina delle cellule ematopoietiche da 1 x 105 a 2 x 105 cellule/cm2 per la differenziazione OC. È stato utilizzato un terreno umano più recente privo di siero iPSC (hiPSC-SFM, vedi Tabella dei materiali) e il rivestimento dei pozzetti è stato eseguito con 200-300 μg/mL di un estratto di membrana basale (vedi Tabella dei materiali) invece dello 0,1% di gelatina. La penicillina/streptomicina non è stata aggiunta ai media.
Il protocollo di Rössler et al.26 è stato originariamente adattato da una iPSC a un protocollo di differenziazione dei macrofagi28 che utilizza la formazione di EB per la differenziazione ematopoietica. Mentre la formazione di EB è stata utilizzata per un lungo periodo di tempo dai ricercatori per la differenziazione ematopoietica29,30, in letteratura sono stati descritti diversi metodi di induzione di EB, come l'aggregazione spontanea, la centrifugazione in una piastra a pozzetti a fondo tondo, la coltura a goccia sospesa, la coltura di bioreattori, la coltura di tubi conici, il vaso laterale a rotazione lenta e la coltura di gel micromold31. Questo protocollo utilizza la centrifugazione di iPSC dissociate in una piastra a pozzetti a fondo tondo per avvicinare le singole cellule iPSC l'una all'altra e consentire la formazione di sfere (EB), come descritto di seguito.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - Anti-Catepsina K&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - Anticorpo CD45</td><td>BD</td><td>555485</td><td></td>umano coniugato</tr> con <tr><td>APC - IgG1 di topo coniugato con APC, &kappa; Controllo isotipo</td><td>BD</td><td>555751</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - BV711-coniugato Anti-umano CD14</td><td>BD</td><td>563372</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - BV711-coniugato IgG2b di topo, &kappa; Controllo isotipo</td><td>BD</td><td>563125</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - Capra Anti-coniglio IgG H& L Alexa Fluor&reg; 647</td><td>Abcam</td><td>ab150079</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - PE-coniugato Anti-umano CD14</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3832P-025</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - Integrina umana alfa M/CD11b coniugata PE</td><td>R& D Systems</td><td>FAB16991P-025</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - PE-Cy7-coniugato Anti-umano CD34</td><td>BD</td><td>560710</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - PE-Cy7-coniugato IgG1 di topo &kappa; Controllo isotipo:</td><td>BD</td><td>557872</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - PE/Cianina5-coniugato Anti-umano CD11b</td>, <td>Biolegend</td><td>301308</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - PE/Cianina5-coniugato IgG1 di topo, &kappa; Isotipo Ctrl</td><td>Biolegend</td><td>400118</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo - PerCP-Cy5.5-coniugato IgG1 di topo &kappa; Anticorpo</td><td>BD</td><td>550795</td><td></td>per il controllo dell'isotipo</tr> - Kit per il test di riassorbimento osseo <tr><td>563521</td><td></td><td>anti-umano CD43 BD coniugato PerCpCy5.5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>CosmoBioUSA</td><td>CSR-BRA-24KIT</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato Countess 3</td><td>ThermoFisher</td><td>16812556</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di membrana basale con fattore di crescita ridotto qualificato per cellule staminali Cultrex</td><td>R& D Sytems</td><td>3434-010-02</td><td>Estratto di membrana basale</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>R& D Systems</td><td>5748/10</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (5 U/mL)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 con 15 mM</td><td>HEPES Stem Cell</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78211</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologie IL-3</td><td>STEMCELL umane</td><td>78146.1</td><td></td></tr><tr><td>Fattore stimolante le colonie di macrofagi umani (hM-CSF)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78150.1</td><td></td></tr><tr><td>Attivatore del recettore solubile umano del fattore nucleare-&kappa; Ligando B (hsRANKL)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78214.1</td><td></td></tr><tr><td>Fattore delle cellule staminali umane (hSCF)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78155.1</td><td></td></tr><tr><td>Human TruStain FcX (Soluzione di blocco del recettore Fc)</td><td>Biolegend</td><td>422301 Fattore di</td><td></td></tr><tr><td>crescita dell'endotelio vascolare umano-165 (hVEGF165)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78073</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Rhodamine Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>MEM &alfa;, nucleosidi, senza rosso fenolo</td><td>ThermoFisher</td><td>41061029</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05855</td><td>Terreno di crioconservazione senza siero</td></tr><tr><td>mTeSR Plus medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td>Terreno umano privo di siero iPSC (hiPSC-SFM)</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera a 96 pozzetti, Nunclon trattato con sfera, fondo a forma di U Micropiastra</td><td>Thermo Scientific</td><td>174925</td><td>Fondo rotondo attacco ultra-basso piastra a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>P1000 Punte a foro largo</td><td>ThermoFisher</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>StemCell</td><td>09650</td><td>Terreno di coltura cellulare ematopoietica</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1X), senza rosso fenolo</td><td>Thermo Fisher</td><td>12563011</td><td>Reagente di dissociazione a singola cellula</td></tr><tr><td>Ultraglutammina</td><td>Bioscience Lonza</td><td>BE17-605E/U1</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Terreno cellulare ematopoietico senza siero</td><td>Bioscience Lonza</td><td>04-418Q</td><td>Terreno basale ematopoietico</td></tr> &<tr><td>micro;-Slide 8 pozzetti Alto</td><td>Ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

differenziamento e caratterizzazione di osteoclasti da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Questo protocollo descrive in dettaglio la propagazione e il passaggio delle iPSC umane e la loro differenziazione in osteoclasti. In primo luogo, le iPSC vengono dissociate in una sospensione unicellulare per un ulteriore utilizzo nell'induzione del corpo embrioide. A seguito dell'induzione mesodermica, i corpi embrioidi subiscono una differenziazione ematopoietica, producendo una popolazione di cellule ematopoietiche fluttuanti. Successivamente, le cellule ematopoietiche prelevate subiscono una fase di maturazione del fattore stimolante le colonie di macrofagi e, infine, il differenziamento degli osteoclasti. Dopo la differenziazione degli osteoclasti, gli osteoclasti sono caratterizzati dalla colorazione per TRAP in combinazione con una colorazione nucleare verde metile. Gli osteoclasti sono osservati come policarioni TRAP+ multinucleati. La loro identificazione può essere ulteriormente supportata dalla colorazione con la catepsina K. I saggi di riassorbimento osseo e minerale consentono la caratterizzazione funzionale, confermando l'identità degli osteoclasti in buona fede. Questo protocollo dimostra un metodo robusto e versatile per differenziare gli osteoclasti umani dalle iPSC e ne consente una facile adozione in applicazioni che richiedono grandi quantità di osteoclasti umani funzionali. Potrebbero essere previste applicazioni nei settori della ricerca sulle ossa, sul cancro, sull'ingegneria tissutale e sulla ricerca sulle endoprotesi.

Monitoraggio della morfologia cellulare durante tutto il processo di differenziamento Tutti i risultati descritti di seguito sono stati generati utilizzando la linea MCND-TENS2 iPSC per il differenziamento OC. Questa linea di iPSC è stata precedentemente utilizzata in diversi studi32,33. Tuttavia, anche altre linee di iPSC sono state utilizzate con successo con questo protocollo di differenziazione.
Una valutazione visiva regolare rivela caratteristiche morfologiche diverse e distinte delle iPSC durante il processo di differenziazione in OC (Figura 2). Le colonie di iPSC (Figura 2A) sono state dissociate in una sospensione a singola cellula, che appare come singole cellule in tutta la piastra del pozzetto a fondo rotondo prima della centrifugazione (Figura 2B). Dopo la centrifugazione (fase 4.9 del protocollo), le cellule si raccoglieranno al centro della piastra a pozzetti a bassissimo attacco a fondo tondo e successivamente formeranno sfere (corpi embrioidi, EB, Figura 2C). Gli EB aumenteranno di due o tre volte di dimensioni durante il processo di differenziazione mesodermica (Figura 2D) e diventeranno facilmente visibili all'occhio alla fine del periodo di differenziazione di 4 giorni (Figura 2E). Gli EB possono essere visti aderire e fondersi con il fondo della piastra del pozzetto dopo il trasferimento nei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti per la differenziazione ematopoietica (passaggio 5.3 del protocollo, Figura 2F). Dopo 7-8 giorni, grandi quantità di cellule ematopoietiche fluttuanti diventano visibili nel terreno di coltura (Figura 2G). Dopo la raccolta e la riplaccatura delle cellule ematopoietiche, segue una fase di maturazione M-CSF e viene avviata la differenziazione OC (fase 6.4 del protocollo). Entro 5-6 giorni, le cellule multinucleate con un grande corpo cellulare trasparente diventano visibili per la prima volta (Figura 2H). Un gran numero di cellule mononucleate è ancora visibile in questa fase. Dopo altri 2-3 giorni di differenziamento degli OC, gli OC si fonderanno ulteriormente con le cellule adiacenti per formare grandi policarioni con ancora più nuclei (Figura 2I).
Valutazione della popolazione ematopoietica derivata da EB Il differenziamento ematopoietico può essere eseguito per un periodo di tempo variabile. In letteratura sono stati descritti periodi di tempo che vanno da 7 giorni fino a 9 settimane. In questo protocollo, la differenziazione ematopoietica viene eseguita per un periodo di 10 giorni. Abbiamo scoperto che 10 giorni di differenziazione ematopoietica hanno prodotto un basso numero di progenitori ematopoietici CD34+ precoci (0,53%, Figura 3A) e un numero maggiore di progenitori ematopoietici CD43+ in stadio intermedio (48,5%, Figura 3B). Più criticamente, quantità sufficienti di HPC CD45+ (96,2%, Figura 3C), CD14+ (33%, Figura 3D) e CD11b+ (35,9%, Figura 3E) sono state generate dopo un periodo di trattamento di 10 giorni per differenziarle ulteriormente in OC. Tuttavia, potrebbe essere necessario regolare e ottimizzare il periodo di trattamento con citochine per la differenziazione ematopoietica (fase 5.4 del protocollo) in base alla linea iPSC per generare quantità adeguate di cellule CD45+, CD14+ e CD11b+ .
In media, 6 milioni di cellule ematopoietiche sono state raccolte dopo 10 giorni di differenziazione da ciascun pozzetto con 8 EB.
Valutazione della morfologia e dell'attività del OC A seguito del differenziamento degli OC, gli OC possono essere valutati morfologicamente e funzionalmente. I precursori OC vengono riseminati su vetrini da camera o vetrini coprioggetti dopo la fase di maturazione M-CSF per migliorare la qualità dell'immagine durante la colorazione per TRAP o Cathepsina K. La colorazione enzimatica TRAP dopo la differenziazione OC mostra OC grandi, multinucleati e positivi per TRAP (Figura 4A). Inoltre, si possono vedere cellule mononucleate leggermente positive alla TRAP intervallate tra OC multinucleari. I controlli negativi senza l'aggiunta di RANKL non mostrano OC multinucleare fuso. Ciononostante, è possibile rappresentare un piccolo numero di cellule mononucleate leggermente positive alla TRAP (Figura 4B).
Le immagini al microscopio laser a scansione confocale (CLSM) mostrano OC colorati per la catepsina K (turchese) e la F-actina (rosso) in combinazione con la colorazione nucleare DAPI (blu) (Figura 4C, 4D). Grandi OC multinucleari sono visibili quando trattati con RANKL secondo il protocollo, che descrive un'estesa struttura citoscheletrica di F-actina e una colorazione positiva per la catepsina K (Figura 4C). I controlli negativi senza l'aggiunta di RANKL, d'altra parte, non mostrano cellule multinucleari fuse.
Gli OC possono essere ulteriormente valutati funzionalmente misurando l'attività di riassorbimento. Per determinare l'attività di riassorbimento possono essere utilizzati saggi di riassorbimento osseo o minerale. Qui, i precursori OC sono stati seminati su pozzi rivestiti di fosfato di calcio e differenziati terminalmente. Ampie aree in cui il rivestimento minerale è stato riassorbito sono visibili in un colore grigio-bluastro (Figura 4E). Si possono identificare pozzi di riassorbimento di diverse dimensioni. Non riassorbito, il restante rivestimento di fosfato di calcio è visibile in marrone. La presenza di pozzi di riassorbimento conferma l'identità delle cellule multinucleate differenziate come OC. Inoltre, i pozzi di riassorbimento possono essere ulteriormente quantificati al fine di valutare e confrontare l'attività di riassorbimento. L'area totale del minerale riassorbito sulla superficie totale del pozzo può essere quantificata come misura percentuale. Inoltre, è possibile quantificare ulteriormente le dimensioni e il numero di pozzi di riassorbimento. I controlli negativi non trattati non hanno mostrato pozzi di riassorbimento (Figura 4F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig01.jpg"> Figura 1: Illustrazione schematica del processo di differenziazione degli osteoclasti dalle iPSC umane. Illustrazione disegnata da Hannah Blümke utilizzando Affinity Designer 2.1.1. L'illustrazione utilizza disegni utilizzati in precedenza33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig02.jpg"> Figura 2: Immagini al microscopio durante il processo di differenziazione delle iPSC umane verso gli osteoclasti. (A) Colonie di iPSC indifferenziate durante la propagazione. (B) iPSC in pozzetti a fondo tondo dopo la dissociazione in una sospensione a singola cellula prima della centrifugazione. (C) IPSC a singola cellula raccolte centralmente dopo centrifugazione. (D) Gli EB crescono di dimensioni durante il periodo di differenziazione mesodermica di 4 giorni. (E) Corpi embrioidi visibili a seguito di differenziamento mesodermico. (F) A seguito del trasferimento dei corpi embrioidi su piastre a 6 pozzetti rivestite di estratto di membrana basale, i corpi embrioidi possono essere visti aderire e fondersi con il fondo del pozzetto. (G) Dopo 5-7 giorni di differenziazione ematopoietica, si può osservare un gran numero di cellule ematopoietiche fluttuanti nel terreno. (H) A seguito della maturazione di M-CSF, i primi osteoclasti con 3-4 nuclei compaiono dopo 5-7 giorni di differenziazione con RANKL. (I) Al termine del differenziamento degli osteoclasti, si possono osservare grandi cellule multinucleate. Barre della scala: A, D, F, G = 200 μm, B, C, H, I = 50 μm, E = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig03.jpg"> Figura 3: Analisi dei marcatori di superficie di cellule ematopoietiche derivate da corpi embrioidi mediante citometria a flusso. L'espressione dei marcatori consente l'analisi delle cellule ematopoietiche e l'identificazione di sottopopolazioni dopo il gating per singoletti singoletti e cellule vive. (A) Ontogeneticamente la popolazione di cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ precoci è molto piccola o assente in combinazione con questo protocollo. (B) Le cellule CD43+ costituiscono circa il 50% dell'intera popolazione. (C) Le cellule progenitrici ematopoietiche CD45+ in stadio avanzato costituiscono la maggior parte della popolazione ematopoietica con il 96,2%. (D, E) I precursori OC CD14+ e CD11b+ più diretti costituiscono rispettivamente il 33% e il 36%. In rosso: controllo negativo non colorato, in blu: controlli isotipici, in giallo: cellule colorate con il rispettivo anticorpo marcatore. I grafici utilizzano dati pubblicati in precedenza33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66527/66527fig04.jpg"> Figura 4: Valutazione morfologica e funzionale di osteoclasti umani differenziati con iPSC. (A) La colorazione TRAP dopo il differenziamento degli osteoclasti mostra osteoclasti di grandi dimensioni, multinucleati e positivi a TRAP. Cellule mononucleate leggermente positive alla TRAP possono essere viste intervallate tra osteoclasti multinucleari. (B) I controlli negativi senza l'aggiunta di RANKL colorato per TRAP non mostrano osteoclasti multinucleari fusi. Ciononostante, è possibile raffigurare un piccolo numero di cellule mononucleate leggermente positive alla TRAP. (C) Le immagini al microscopio a scansione laser confocale di cellule ematopoietiche differenziate con osteoclasti su un vetrino coprioggetti colorato per F-actina (rosso) e catepsina K (turchese) in combinazione con colorante nucleare DAPI (blu) mostrano grandi osteoclasti positivi alla catepsina K multinucleata. (D) I controlli negativi senza l'aggiunta di RANKL mostrano simili a (B) cellule mononucleate con una densità cellulare inferiore. (E) La valutazione funzionale può essere effettuata valutando l'attività di riassorbimento degli osteoclasti. Per questo, la differenziazione degli osteoclasti viene eseguita su un test di riassorbimento osseo o minerale. Le immagini a pozzetto piastrellate acquisite con un microscopio a campo largo invertito in modalità di contrasto di fase raffigurano ampie aree di riassorbimento dello strato minerale di fosfato di calcio. L'attività di riassorbimento può essere ulteriormente quantificata misurando l'area di riassorbimento sull'area totale. (F) I controlli negativi senza l'aggiunta di RANKL non mostrano aree di riassorbimento. Barre graduate: A, B = 100 μm, C, D = 50 μm, E, F = 1 mm. Le immagini sono state modificate a partire da dati pubblicati in precedenza33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66527/66527fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo presenta il differenziamento degli osteoclasti umani dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e descrive i metodi per la caratterizzazione degli osteoclasti e dei precursori degli osteoclasti.

Differenziamento e caratterizzazione di osteoclasti da cellule staminali pluripotenti indotte umane

This protocol details the propagation and passaging of human iPSCs and their differentiation into osteoclasts. First, iPSCs are dissociated into a ...

Gli osteoclasti sono un tipo di cellula multinucleata comunemente usato dai ricercatori in aree come la ricerca sulle malattie ossee, la ricerca sul cancro, l'ingegneria tissutale e la ricerca sulle endoprotesi. Tuttavia, la differenziazione degli osteoclasti può essere impegnativa, poiché è necessaria la fusione dei precursori. Inoltre, la differenziazione degli osteoclasti umani dalle IPSC richiede l'uso di una varietà di fattori biologici al momento giusto.Quando si tratta di cellule primarie umane. Le cellule mononucleate del sangue periferico CD34+ sono attualmente il tipo di cellula più utilizzato per la differenziazione in osteoclasti. Tuttavia, questo approccio è limitato dall'eterogeneità all'interno della popolazione CD34+ e dalla loro limitata espandibilità.Le IPSC umane rappresentano una fonte alternativa per gli osteoclasti. Poiché possono essere propagati indefinitamente, consentono l'espandibilità e l'aumento della produzione di osteoclasti. Ciò consente la differenziazione di un gran numero di osteoclasti, il che facilita la ricerca sugli osteoclasti.Qui, il nostro postdoc Alexander Blumke e la dottoranda Jessica Simon, dimostrano la differenziazione degli osteoclasti dalle IPSC umane che passano le IPSC. Iniziare a passare le IPSC rimuovendo le regioni differenziate o le regioni con molti aggregati IPSC morti allo stereomicroscopio utilizzando un puntale per pipette P-10 o P-20 o un raschietto per cellule. Le regioni differenziate appariranno più dense e di colore più bianco.Lavare le cellule staccate con un vecchio terreno, quindi lavare via le cellule staccate rimanenti con PBS due volte. Quindi, aggiungi un millilitro di cinque unità per millilitro di dispasi per pozzetto al pozzetto. I bordi delle colonie che si staccano dalla capsula possono essere osservati allo stereomicroscopio dopo tre-cinque minuti.Rimuovere con cautela la dispasi e aggiungere un millilitro di DMEM/F-12 con HEPES da 15 millimolari. Utilizzare uno strumento per il passaggio di cellule staminali o un sollevatore di cellule usa e getta per tagliare gli aggregati in piccole dimensioni. Trasferire il terreno con gli aggregati in una provetta conica da 15 millilitri utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri o una P-1000 con punta a foro largo.Sciacquare il pozzetto con DMEM/F-12 e trasferire il terreno nella provetta da 15 millilitri. Centrifugare gli aggregati IPSC affettati a 200 G per tre minuti. Rimuovere il surnatante con una pipetta di vetro Pasteur e aggiungere due millilitri di terreno privo di siero IPSC umano per rimuovere e risospendere le IPSC utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri o P-1000 con puntali a foro largo.Aspirare l'estratto di membrana basale rimanente dalle piastre a pozzetti pre-rivestite e aggiungere un millilitro di terreno privo di siero IPSC umano a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Trasferire le IPSC in nuovi pozzetti di una piastra a sei pozzetti in modo che il volume finale sia di due millilitri di terreno umano privo di siero IPSC per pozzetto utilizzando un P-1000 con punte a foro largo. A seconda della linea IPSC, i rapporti di divisione devono essere ottimizzati.In questo caso, è stato utilizzato un rapporto di divisione 1:6. Ruotare la piastra del pozzetto per distribuire uniformemente le cellule sulla piastra dopo che gli aggregati sono stati trasferiti. Induzione del corpo embrioide.Aspirare il vecchio terreno dalle colture IPSC e risciacquare i pozzetti con DPBS. Aggiungere mezzo millilitro di preriscaldato a temperatura ambiente in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e far roteare il recipiente di coltura per rivestire l'intera superficie del pozzetto. Incubare il recipiente di coltura a 37 gradi C per cinque-otto minuti.Rimuovere il recipiente dall'incubatrice, aspirare la soluzione e aggiungere il terreno di fase uno ai pozzetti costituiti da 50 nanogrammi per millilitro di proteina morfogenica dell'osso umano 4, 50 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita endoteliale vascolare umano 165, 20 nanogrammi per millilitro di fattore di cellule staminali umane e 10 inibitori micromolari ROCK Y-27632. Staccare delicatamente le cellule risciacquando il pozzetto con il terreno di stadi uno. Tirare le cellule in un tubo conico.Aggiungere il nuovo terreno di fase uno ai pozzetti e staccare le cellule rimanenti utilizzando un raschietto per cellule. Dopo aver trasferito tutte le cellule nella provetta, centrifugare a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule. Aspirare e risospendere le cellule in un totale di due millilitri di terreno pre-bilanciato di fase uno.Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un dispositivo automatico per il conteggio delle cellule Seme 12, 500 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo con attacco ultrabasso in 100 microlitri di terreno di fase uno. Al microscopio, le cellule appariranno diffusamente in tutta la soluzione. Centrifugare le piastre a 96 pozzetti per tre minuti a 100 G Dopo la centrifugazione, le cellule dovrebbero iniziare ad assomigliare a sferoidi se osservate al microscopio.Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 gradi C. Cambia metà del mezzo il primo giorno e il secondo giorno con il supporto della fase uno. Utilizzare una pipetta multicanale per smaltire il vecchio terreno in una capsula di Petri.Dopo aver smaltito i terreni dalla piastra a 96 pozzetti, verificare la presenza di EB che potrebbero essere stati rimossi accidentalmente. Trasferire nuovamente gli EB rimossi accidentalmente nella capsula di Petri utilizzando una pipetta P-1000 Differenziazione ematopoietica. Pozzetti di pre-riempimento di una piastra a sei pozzetti con tre millilitri di terreno di fase due, a cui vengono aggiunti ultraglutammina bimillimolare, beta-mercaptoetanolo 55-micromolare, 25 nanogrammi per millilitro, interleuchina-3 umana e 100 nanogrammi per millilitro di fattore stimolante le colonie di macrofagi umani.Utilizzando un P-1000 e una punta a foro largo, trasferire otto EB in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Dopo il trasferimento, controllare a occhio sotto lo stereomicroscopio che in ogni pozzetto siano presenti otto EB. Dopo cinque-sette giorni, dovrebbe diventare visibile una popolazione cellulare fluttuante composta da cellule ematopoietiche.Il periodo di differenziazione ematopoietica può essere variato, a partire da sette giorni. La differenziazione per 10 giorni ha mostrato una popolazione ematopoietica composta da grandi sottopopolazioni CD45+CD14+ e CD11b+. Dopo cinque giorni di trattamento con il mezzo di fase due, eseguire un cambio di terreno rimuovendo con cura il vecchio terreno ed erogandolo in un tubo conico da 50 millilitri.Aggiungere immediatamente un millilitro di nuovo terreno di fase due ai pozzetti. Al fine di salvare eventuali cellule ematopoietiche galleggianti che potrebbero essere già presenti, far girare la provetta con il vecchio terreno a 300 G per cinque minuti. Aggiungere il nuovo terreno di fase due alla provetta e risospendere per staccare le cellule che potrebbero essere state trasferite con il vecchio mezzo.Aggiungere due millilitri di nuovo terreno di fase due con le cellule salvate in ciascun pozzetto, che in precedenza era stato riempito con un millilitro di terreno di fase due. Al 10° giorno di differenziazione ematopoietica, le cellule ematopoietiche galleggianti vengono raccolte raccogliendole in una provetta conica da 50 millilitri e possono essere congelate utilizzando il 10% di DMSO, il 50% di FBS e il 40% di medium, o immediatamente utilizzate per differenziare ulteriormente le cellule in osteoclasti. Maturazione M-CSF e differenziamento degli osteoclasti.Cellule del seme a 200.000 cellule per centimetro quadrato e trattare per tre giorni con alfa MEM integrato con 10% FBS e 50 nanogrammi per millilitro M-CSF. Per eseguire saggi funzionali o imaging, staccare le cellule maturate con MCSF lavandole con un P-1000 con punta a foro largo. Trasferire le cellule staccate con il vecchio terreno in una provetta e centrifugare a 300 G per cinque minuti.Risospendere e dissolvere il pellet cellulare con alfa MEM fresco integrato con 10% di FBS, 50 nanogrammi per millilitro di M-CSF e 80 nanogrammi per millilitro di legante RANK. Risemina le cellule a 200.000 cellule per centimetro quadrato e differenzia per sette-nove giorni. Gli osteoclasti multinucleati compaiono in genere intorno al quinto o settimo giorno.Risultati rappresentativi. La composizione della popolazione di cellule ematopoietiche generata può essere analizzata utilizzando la citometria a flusso. Qui, le cellule ematopoietiche mostrano un'ampia popolazione di cellule precursori CD45+.Le popolazioni cellulari che esprimono i marcatori monocitari CD14 e CD11b di solito costituiscono un terzo dell'intera popolazione rispetto ai controlli isotipici. Gli osteoclasti derivati da IPSC terminalmente differenziati possono essere visti al microscopio come cellule multinucleate TRAP-positive. La microscopia confocale mostra la colorazione delle cellule per la catepsina K.I saggi funzionali come i saggi di assorbimento osseo o minerale consentono un'ulteriore quantificazione dell'attività degli osteoclasti.In questo caso, i fossetti di riassorbimento sono visibili dopo aver rimosso l'osteoclasto maturo con candeggina al 10% prima dell'imaging, mentre i precursori degli osteoclasti maturati con M-CSF trattati senza l'aggiunta del ligando RANK non mostrano pozzi di riassorbimento. Conclusione. Questo protocollo consente la differenziazione robusta e affidabile degli osteoclasti umani e potrebbe fornire una soluzione pronta all'uso per le malattie ossee o le malattie che comportano un eccesso di calcificazione. Usiamo gli osteoclasti per ingegnerizzarli ulteriormente nelle nostre cellule RANK che utilizzano un dominio di segnalazione intracellulare che può essere attivato in combinazione con un induttore chimico di dimerizzazione per l'attivazione controllata e indipendente dagli osteoprotegerine.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Gli osteoclasti sono cellule che riassorbono l'osso principale nel corpo. La capacità di isolare osteoclasti in gran numero ha causato notevoli progressi nella comprensione della biologia osteoclasti. In questo protocollo, si descrive un metodo per l'isolamento, la coltivazione e quantificare l'attività degli osteoclasti in vitro.

Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo

La segnalazione notch è una forma di comunicazione cellulare che si basa sul contatto diretto tra le cellule. Per indurre correttamente la segnalazione di Notch in vitro, i ligandi di Notch devono essere presentati alle cellule in uno stato immobilizzato. Questo protocollo descrive i metodi per la stimolazione in vitro della segnalazione Notch nei precursori degli osteoclasti di topo.

La stimolazione di Notch segnalazione in mouse osteoclasti Precursori

Presentiamo un protocollo per generare una linea condrogenica dal sangue periferico umano (PB) attraverso cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) utilizzando un metodo senza integrazione, che comprende la formazione del corpo embrionale (EB), l'espansione delle cellule fibroblasiche e l'induzione condrogenica.

Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo derivato dal sangue

In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) da fibroblasti derivata pazienti di sindrome di Li-Fraumeni (LFS), differenziazione delle iPSCs tramite cellule staminali mesenchimali (MSCs) di osteoblasti e modellazione in vivo tumorigenesi utilizzando osteoblasti derivati paziente LFS.

Modellazione di Osteosarcoma con la sindrome di Li-Fraumeni paziente-derivato indotto Pluripotent Stem Cells

Gli osteoclasti sono polykaryons di macrofage specifici del tessuto derivato dal lignaggio dei monociti-macrofage delle cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo descrive come isolare le cellule del midollo osseo in modo da ottenere grandi quantità di osteoclasti riducendo il rischio di incidenti riscontrati nei metodi tradizionali.

Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto

Gli osteoclasti sono cellule chiave che riassorbono le ossa nel corpo. Questo protocollo descrive un metodo affidabile per la differenziazione in vitro degli osteoclasti dai monociti del sangue periferico umano. Questo metodo può essere utilizzato come uno strumento importante per comprendere ulteriormente la biologia degli osteoclasti nell'omeostasi e nelle malattie.

Differenziazione degli osteoclasti funzionali dai monociti CD14+ del sangue periferico umano

Questo protocollo descrive e confronta due metodi rappresentativi per differenziare le hiPSC in cellule stromali mesenchimali (MSC). Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica. Il metodo dei corpi embrioidi (EBs) è caratterizzato da un minor consumo di tempo.

Confronto di due metodi rappresentativi per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali

Qui, descriviamo un robusto protocollo per la derivazione di cardiomiociti umani che combina la differenziazione cardiaca modulata da piccole molecole e la purificazione dei cardiomiociti mediata dalla privazione di glucosio, consentendo la produzione di cardiomiociti purificati ai fini della modellazione delle malattie cardiovascolari e dello screening dei farmaci.

Derivazione di Cardiomyocytes altamente purificato da cellule staminali umane pluripotenti indotte utilizzando piccoli Differenziazione Molecola-modulato e successiva glucosio Starvation

Spine dendritiche di neuroni piramidali sono i siti di maggior sinapsi eccitatorie in mammiferi corteccia cerebrale. Il metodo descrive un'analisi quantitativa 3D di morfologie della colonna vertebrale nei neuroni piramidali glutamatergici corticali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.

Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da piramidale neuroni derivate da cellule staminali umane pluripotenti indotte

Scopri il differenziamento di osteoclasti da cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo metodo fornisce un protocollo affidabile per la ricerca sulle malattie ossee e l'ingegneria tissutale.

Differenziamento e caratterizzazione di osteoclasti da cellule staminali pluripotenti indotte umane

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