Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

Cerchiamo di comprendere gli intricati meccanismi alla base della lesione cerebrale traumatica lieve causata dall'esposizione alle onde d'urto indotte dall'esplosione. Stiamo anche studiando metodi per alleviare questi sintomi. È stata una descrizione completa della fase iniziale della rottura della barriera emato-encefalica a causa di onde d'urto indotte da esplosioni di bassa intensità.

In particolare, la rottura inizia bruscamente circa tre ore dopo l'esposizione e le lesioni colpite subiscono un rimodellamento per circa un giorno dopo l'esordio. Questo metodo ci permette di esaminare la degradazione della BBB in modo più dettagliato, fornendo una metrica aggiuntiva per valutare l'efficacia dei vari trattamenti che possono essere impiegati in caso di esplosione. Per iniziare, prepara un tubo d'urto per esporre l'animale alle onde d'urto indotte dall'esplosione.

Posizionare il mouse anestetizzato a cinque centimetri di distanza dall'estremità di uscita del tubo dell'ammortizzatore, assicurandosi che l'asse del corpo sia parallelo, ma non allineato con l'asse del tubo. Quindi eroga una singola onda d'urto esplosiva con un picco di sovrapressione di 25 kilopascal alla testa dell'animale. Per l'iniezione di Evans blue, preparare una soluzione salina di Evans blue al 4% in peso in volume.

Agitare la soluzione e conservarla al buio fino al momento dell'uso. Iniettare la soluzione di blu di Evans nella vena caudale alla dose di 2,5 microlitri per grammo. Dopo aver perfuso il topo anestetizzato con il colorante FITC-destrano e la paraformaldeide, utilizzare forbici chirurgiche e pinzette per rimuovere con cura il cervello.

Postfissa il cervello durante la notte nello stesso fissativo a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, sostituire il fissativo con PBS. Per iniziare, ottenere il cervello fisso da un topo trattato con onde d'urto a blast iniettato con coloranti blu di Evans e destrano FITC.

Preparare una piastra a 24 pozzetti con 500 microlitri di glicerolo al 20% in tampone fosfato regolato a pH 7,4 in ciascun pozzetto. Usando un'affettatrice per cervelli, taglia il cervello coronalmente in 12 fette, ciascuna spessa un millimetro. Trasferire ogni fetta nel pozzetto corrispondente della piastra a 24 pozzetti e conservare la piastra a quattro gradi Celsius per almeno due ore.

Quindi sostituire la soluzione con un tampone glicerolo fosfato al 50% e conservarla nuovamente a quattro gradi Celsius per almeno due ore. Infine, sostituire la soluzione con glicerolo al 100%. Per un'osservazione microscopica immediata, lasciare riposare le fette per almeno due ore a temperatura ambiente.

Aggiungere 500 microlitri di glicerolo sul fondo di un piatto di vetro da 35 millimetri. Trasferire la fetta di cervello nella soluzione di glicerolo e coprire la superficie con un bicchiere di copertura. Rimuovere il glicerolo in eccesso dal bordo del vetro di copertura.

Misurare l'intensità della fluorescenza della fetta al microscopio a fluorescenza. Dopo la misurazione microscopica, rimettere la fetta nel pozzetto della piastra. Aggiungere 500 microlitri di tampone fosfato a ciascun pozzetto e conservare la piastra a 24 pozzetti a quattro gradi Celsius per una notte.

Sostituire la soluzione con un tampone glicerolo fosfato al 30% e incubare la piastra a quattro gradi Celsius per almeno due ore prima di eseguire l'immunoistochimica L'etichettatura blu di Evans ha dimostrato che la barriera emato-encefalica o la rottura della BBB inizia entro sei ore dall'esposizione all'onda d'urto dell'esplosione e dura fino a sette giorni. Gli hotspot di fluorescenza variavano in dimensioni e intensità, con hotspot di solo blu di Evans che indicavano la rottura della BBB durante l'iniezione di blu di Evans e la riparazione dopo l'iniezione di FITC-destrano. I cluster di astrociti reattivi erano strettamente associati ai siti di degradazione della BBB confermati dall'immunoistochimica.

La microglia attivata e la microglia ameboide sono state osservate insieme agli astrociti reattivi tre giorni dopo l'esposizione all'onda d'urto dell'esplosione.