Name: Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T13:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: Scopri la valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve. Questo metodo utilizza doppia marcatura fluorescente per analizzare la dinamica temporale della permeabilità cerebrale.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualizzazione basata su colorante fluorescente della rottura della barriera emato-encefalica nei topi

<ol><li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%3A+From+physiology+to+disease+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier: From physiology to disease and back.</a> Physiol Rev. 99 (1), 21-78 (2019).</li>
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<li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+antigen+retrieval+method+for+free-floating+and+slide-mounted+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections.</a> J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).</li>
<li>Nagaraja, T. N., Keenan, K. A., Fenstermacher, J. D., Knight, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+leakage+patterns+of+fluorescent+plasma+flow+markers+after+transient+focal+cerebral+ischemia+suggest+large+openings+in+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Acute leakage patterns of fluorescent plasma flow markers after transient focal cerebral ischemia suggest large openings in blood-brain barrier.</a> Microcirculation. 15 (1), 1-14 (2010).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+blood-brain-barrier+leakage+using+a+combination+of+Evans+blue+and+high+molecular+weight+fitc-dextran%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying blood-brain-barrier leakage using a combination of Evans blue and high molecular weight fitc-dextran.</a> J Neurosci Methods. 325, 108349(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Soluzione tampone neutra in formalina al 10%</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals</td><td>062-01661</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFAP, Coniglio</td><td>DAKO-Agilent</td><td>IR524</td><td></td></tr><tr><td>Anti Iba1, Coniglio</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Pollo anti-topo IgG (H+L) Anticorpo secondario adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Mount</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>33351</td><td>mezzo di congelamento dei tessuti</td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Orion Corporation</td><td></td><td>medetomidina</td></tr><tr><td>asino anti-coniglio IgG (H + L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare Falcon a fondo piatto trasparente in polistirene a 24 pozzetti, con coperchio, confezionata singolarmente, sterile, 50/caso</td><td>CORNING</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>isotiocianato di fluoresceina... destrano medio mol peso 40.000</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>FD40S</td><td>FITC-destrano</td></tr><tr><td>Piatto di base in vetro 27mm (n.1 vetro)</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>3910-035</td><td>Piatto con fondo in vetro da 35 mm</td></tr><tr><td>IX83 Microscopio invertito</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS Vetrini per microscopio ad adesione idrofila</td><td>Matsunami Glass</td><td>MAS-04</td><td></td></tr><tr><td>Matsunami&nbsp; Vetro di copertura (n. 1)&nbsp; 18 x 18mm</td><td>Matsunami Glass</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam Iniezione 10mg [SANDOZ]</td><td>Sandoz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide EMPROVE ESSENTIAL DAC</td><td>Merck Millipore</td><td>1.04005.1000</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>ATTO</td><td>SJ-1211 II-H</td><td></td></tr><tr><td>RODITORE CERVELLO MATRIX Topo adulto, 30 g, Affettatore cerebrale Coronal</td><td>ASI INSTRUMENTS</td><td>RBM-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Vetorphale</td><td>Meiji Animal Health</td><td>VETLI5</td><td>butorfanolo</td></tr></tbody></table>

valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

La Figura 1A mostra l'andamento temporale dell'iniezione del colorante in relazione all'inizio della BSW, con una sovrapressione di picco di 25 kPa. Nel protocollo "Post", la soluzione di blu di Evans è stata somministrata per via intravascolare 2 ore prima della perfusione FITC-destrano, che è stata condotta 6 ore, 1 giorno, 3 giorni e 7 giorni dopo l'esposizione alla BSW. Nel protocollo "Pre", la soluzione di blu di Evans è stata iniettata immediatamente prima dell'esposizione alla BSW. Nel protocollo 'Post', si prevede che la concentrazione di blu di Evans raggiunga il suo massimo circa 2 ore prima della fissazione della perfusione, mentre nel protocollo 'Pre', si prevede che raggiunga il suo massimo intorno al momento dell'esposizione alla BSW (Figura 1B). La concentrazione di FITC-destrano nei vasi sanguigni cerebrali è stata mantenuta costante per 2 minuti durante la perfusione.
L'etichettatura blu di Evans ha mostrato che la degradazione della BBB è iniziata entro 6 ore ed è continuata fino a 7 giorni dopo l'esposizione alla BSW (Figura 2A). In particolare, la degradazione della BBB non si è verificata immediatamente dopo l'esposizione alla BSW, poiché non vi è stata stravaso del colorante blu di Evans a 3 ore nel protocollo "Pre" (Figura 2B). Sorprendentemente, l'etichettatura a lungo termine con il blu di Evans ha indicato la sua natura cumulativa nel protocollo "Pre" (Figura 2B)7.
L'uso di due coloranti distinti, ciascuno introdotto a intervalli di 2 ore o più, ha permesso di esaminare le variazioni temporali dell'integrità della BBB confrontando la loro distribuzione. La Figura 3 mostra le immagini a fluorescenza delle fette che hanno mostrato una differenza significativa nella distribuzione del blu di Evans e del FITC-destrano.
Sono stati osservati numerosi hotspot di fluorescenza di varie dimensioni. Sebbene alcuni hotspot fossero abbastanza luminosi da classificarsi tra i primi 0,1% dei pixel, molti erano solo leggermente più luminosi dei tessuti circostanti. La discrepanza tra i coloranti suggerisce che i cambiamenti si sono verificati all'interno di questo intervallo. Gli hotspot che mostravano solo la fluorescenza del blu di Evans indicavano una rottura della BBB in corso al momento dell'iniezione di blu di Evans, che è stata successivamente riparata dall'iniezione di FITC-destrano. Al contrario, gli hotspot che mostravano solo la fluorescenza FITC-destrano suggerivano che l'interruzione della BBB si verificasse tra le due iniezioni di colorante. Infine, gli hotspot che mostravano fluorescenza da entrambi i coloranti indicavano una continua rottura della BBB durante l'intero periodo di iniezione.
La Figura 4A presenta il numero di hotspot positivi per il blu di Evans (inclusi gli hotspot doppi positivi solo blu di Evans e gli hotspot doppi positivi per il blu di Evans/destrano FITC), il destrano FITC (inclusi gli hotspot doppi positivi solo per il solo destronano e il blu di Evans/destrano FITC) o entrambi i coloranti (solo gli hotspot doppi positivi per il blu di Evans/destrano FITC). Nel protocollo 'Pre' a 3 ore, sono stati osservati numerosi hotspot solo FITC-destrano. A 6 ore e 1 giorno nel protocollo "Post", sono stati rilevati sia gli hotspot solo blu di Evans che quelli solo FITC destron. Tuttavia, a 3 giorni e 7 giorni nel protocollo "Post", gli hotspot erano prevalentemente positivi per entrambi i coloranti. Questi risultati suggeriscono che la degradazione della BBB si è verificata a 3 ore, è stata rimodellata di 1 giorno e persisteva fino a 7 giorni dopo l'esposizione alla BSW (Figura 4B). È importante sottolineare che l'entità del breakdown della BBB tendeva a diminuire di 7 giorni, come accennato in precedenza.
Dopo il completamento degli esperimenti di stravaso del colorante, è stata effettuata la colorazione immunoistochimica delle fette7. Le scansioni di immagini immunoistochimiche sono state costantemente confrontate con quelle degli stravasi di coloranti, confermando che l'effetto di trascinamento delle sostanze fluorescenti era praticamente trascurabile7. Come mostrato nella Figura 5, i cluster di astrociti reattivi erano strettamente associati ai siti di degradazione della BBB. Ulteriori osservazioni hanno rivelato che le microglia attivate e ameboidi erano presenti accanto agli astrociti reattivi 3 giorni dopo l'esposizione alla BSW.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig01.jpg"> 
Figura 1: Disegno sperimentale. (A) Andamento temporale dell'esperimento. La soluzione di blu di Evans è stata iniettata per via endovenosa dopo (protocollo 'Post') o immediatamente prima (protocollo 'Pre') dell'esposizione alla BSW, mentre il FITC-destrano è stato perfuso per via transcardica per 2 minuti prima della fissazione. (B) Concentrazioni attese di blu di Evans e FITC-destrano nei vasi sanguigni rispettivamente nei protocolli "Post" e "Pre". BSW, onde d'urto indotte da esplosioni; FITC, isotiocianato di fluoresceina. Questa figura è adattata da Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig02.jpg"> 
Figura 2: Confronto dell'intensità della fluorescenza nelle fette di cervello. L'intensità della fluorescenza dello 0,1% più luminoso dei pixel nel cervello è stata valutata in tutte le 12 sezioni e confrontata tra le condizioni "Post" (A) e "Pre" (B). Sono indicate la variabilità e la significatività delle differenze. xxx indica p &lt; 0,001; xxxx indica p &lt; 0,0001 (valori p dal test F). *p &lt; 0,05; p &lt; 0,0001 (analisi della varianza con i confronti multipli di Dunnett test post hoc). Questa figura è adattata da Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig03.jpg"> 
Figura 3: Degradazione della BBB osservata in vari punti temporali utilizzando la doppia marcatura con blu di Evans e FITC-destrano. Vengono mostrate le immagini blu di Evans (magenta), FITC-destrano (verde) e unite. I protocolli di iniezione del colorante sono presentati sul lato sinistro. Alcuni hotspot hanno mostrato una fluorescenza predominante del blu di Evans (freccia) o del FITC-destrano (punte di freccia). Gli asterischi indicano il plesso coroideo e i vasi correlati. BBB, barriera emato-encefalica; FITC, isotiocianato di fluoresceina; CVO, organi circumventricolari del terzo ventricolo. Barra della scala: 1 mm. Questa figura è adattata da Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig04.jpg"> 
Figura 4: Quantificazione degli hotspot di fluorescenza. (A) Numero dei punti caldi positivi per il blu di Evans (magenta), il destrano FITC (verde) ed entrambi i coloranti (grigio). Sono stati raccolti dalle immagini ottenute a 3 ore nel protocollo "Pre" e dalle immagini ottenute a 6 ore, 1 giorno, 3 giorni e 7 giorni nel protocollo "Post". Da 3 ore a 1 giorno, una parte significativa degli hotspot di fluorescenza ha mostrato una discrepanza tra i coloranti, mentre, da 3 giorni a 7 giorni, tale discrepanza è stata difficilmente osservata. (B) Schema che riassume l'andamento temporale della degradazione della BBB. L'asse verticale rappresenta concettualmente l'intensità della perdita di colorante dovuta alla rottura della BBB. Il modello a zigzag da 3 ore a 1 giorno indica che la posizione e l'intensità della perdita di colorante sono instabili durante questo periodo. FITC, isotiocianato di fluoresceina; BBB, barriera emato-encefalica; BSW, onde d'urto indotte da esplosioni. Questa figura è adattata da Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66653/66653fig05.jpg"> 
Figura 5: Espressione di GFAP e Iba1 come marcatori rispettivamente per astrociti e microglia. Ogni colonna della figura contiene immagini a fluorescenza dello stravaso di colorante con blu di Evans o FITC-destrano, insieme a immagini immunoistochimiche GFAP o Iba1. La barra dei colori indica le intensità di fluorescenza normalizzate del blu di Evans e del FITC-destrano utilizzando quelle all'interno di GRN. I protocolli di iniezione del colorante sono presentati sul lato sinistro. La fetta di 1 giorno nel protocollo 'Pre' mostra la fluorescenza sia del blu di Evans che del FITC-destrano, mentre la fetta di 3 giorni nel protocollo 'Pre' mostra solo la fluorescenza del blu di Evans (frecce). Le regioni indicate dalle frecce nelle immagini di stravaso del colorante si allineano con le immagini immunoistochimiche. Le punte di freccia indicano gruppi di astrociti reattivi. L'anticorpo policlonale GFAP ha marcato gli astrociti all'interno e intorno alla sostanza bianca, nonché nel tessuto nervoso adiacente alla pia madre. Di conseguenza, gli astrociti all'interno e vicino alla dcw sono marcati in questa figura. Le immagini ingrandite corrispondenti alla cornice o alla freccia nella colonna Iba1 sono rappresentate nei riquadri. Barre di scala: 1 mm e 200 μm rispettivamente per lo stravaso del colorante e le immagini immunoistochimiche. GFAP, proteina acida fibrillare gliale; Iba1, molecola adattatrice ionizzata che lega il calcio 1; FITC, isotiocianato di fluoresceina; BSW, onde d'urto indotte da esplosioni; DCW, sostanza bianca cerebrale profonda. Questa figura è adattata da Nishii et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66653/66653fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

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I modelli semplificati di lesione cerebrale traumatica (TBI) hanno facilitato lo sviluppo di approcci terapeutici. Questo protocollo delinea la creazione di una corteccia di topo con l'uso di aghi, che consente l'analisi di emorragie e infiammazioni. Il modello di topo TBI a pugnalata offre il vantaggio di essere eseguito senza richiedere attrezzature specializzate.

Modello murino con ferita da taglio per lo studio dell'emorragia e dell'infiammazione nella lesione cerebrale traumatica

Scopri la valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve. Questo metodo utilizza doppia marcatura fluorescente per analizzare la dinamica temporale della permeabilità cerebrale.

Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

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