Name: Metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Scopri un metodo di bioprinting ad alta produttività per modellare la permeabilità vascolare in piastre a sei pozzetti. Questa tecnologia automatizzata migliora la riproducibilità dei modelli vascolari in vitro per lo sviluppo terapeutico.

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1. Generazione del G-code per il bioprinter
<ol><li>Per generare e visualizzare il percorso di stampa, visitare uno strumento di simulazione G-code online (ad esempio, NCviewer).</li>
	<li>Fare clic sull'icona Nuovo file sull'interfaccia per creare un nuovo file G-code.</li>
	<li>Genera un percorso di stampa scrivendo manualmente i comandi G-code per il canale sacrificale e la camera di silicio. Utilizzate le quote di una piastra standard a sei pozzetti come riferimento per la creazione della geometria. NOTA: Il codice G utilizzato qui si basa sul codice CNC (Computer Numerical Control). Le funzioni di ciascun comando sono fornite nella tabella supplementare S1. Il formato di piastra a sei pozzetti è stato scelto per la sua compatibilità con i lettori di micropiastre e le configurazioni di microscopia commerciali e per la sua capacità di ospitare volumi adeguati di terreno per supportare la maturazione dell'endotelio, riducendo così al minimo la necessità di frequenti cambi di terreno. Questo protocollo di fabbricazione può anche essere adattato per l'uso con altre piastre a pozzetti standard.</li>
	<li>Una volta completato il G-code, fai clic sull'icona Salva file sull'interfaccia per scaricare il file con estensione .nc. NOTA: Qualsiasi altro algoritmo di generazione di codice G disponibile può essere utilizzato per generare i percorsi di stampa. La geometria del canale vascolare può essere manipolata in questo codice G.</li>
</ol>2. Preparazione degli inchiostri sacrificali e della camera al silicone
NOTA: Le fonti di tutti i materiali utilizzati in questo protocollo sono elencate nella Tabella dei materiali.
<ol><li>Combina due tipi di polimeri siliconici, SE1700 e polidimetilsilossano (PDMS), in un rapporto 10:2. Aggiungere l'agente indurente di ciascun polimero in un rapporto di 10:1, polimero all'agente indurente.</li>
	<li>Utilizzare un miscelatore planetario per miscelare e degassare accuratamente la miscela di polimeri a 2.000 giri/min.</li>
	<li>Con una spatola, trasferire il polimero siliconico miscelato in una siringa monouso da 10 mL. Centrifugare la siringa caricata a 400 × g per 3 minuti a 5 °C per garantire una consistenza uniforme ed evitare bolle durante la stampa. NOTA: L'inchiostro della camera deve essere utilizzato entro 2 ore dall'aggiunta degli agenti indurenti per garantire una qualità di stampa ottimale. Conservare la siringa a 5 °C durante la preparazione per la stampa. Questo processo aiuta a rallentare l'indurimento dell'inchiostro, che altrimenti può alterare i parametri di stampa.</li>
	<li>Pesare Pluronic F-127 (PF127) per preparare una soluzione madre al 40% (p/v) di PF127 in acqua distillata.</li>
	<li>Miscelare la soluzione PF127 in planetaria per 3 min a 400 × g per ottenere omogeneità. Mantenere la miscela omogeneizzata a 4 °C per la completa dissoluzione di PF127.</li>
	<li>Preparare una soluzione madre di trombina di 1.000 unità/mL in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). NOTA: Conservare la soluzione madre di trombina in aliquote da 100 μL per evitare ripetuti cicli di gelo-scongelamento. Le aliquote devono essere conservate a -20 °C per non più di 6 mesi.</li>
	<li>Prima di stampare, preparare l'inchiostro sacrificale mescolando la trombina a una diluizione 1:10 con PF127 a una concentrazione di lavoro finale del 36% (p/v) per PF127 e di 100 unità/mL per la trombina. Per preparare 1 mL di inchiostro sacrificale, miscelare 100 μL di soluzione madre di trombina con 900 μL di soluzione madre PF127. NOTA: Quando si prepara l'inchiostro sacrificale per la stampa di una singola lastra, un volume totale di 1 ml è più che sufficiente.</li>
</ol>3. Processo di fabbricazione
<ol><li>Prima di iniziare il processo di fabbricazione, trattare una piastra a sei pozzetti con plasma di ossigeno (O2) a una potenza di 100 watt per 1 minuto.</li>
	<li>Seguire la procedura descritta nella sezione 2 per preparare sia gli inchiostri sacrificali che quelli al silicone, assicurandosi che gli inchiostri siano privi di bolle e miscelati in modo omogeneo per una stampa uniforme. Caricare con cautela gli inchiostri nella testina di stampa della biostampante. Impostare la temperatura della testina della biostampante a 37 °C per l'inchiostro sacrificale e a 5 °C per l'inchiostro siliconico.</li>
	<li>Collegare un ugello conico a doppia vite da 22 G alla siringa in silicone. Per l'inchiostro sacrificale, scegliere la dimensione dell'ugello in base al diametro del canale desiderato. NOTA: Qui abbiamo dimostrato tre dimensioni di ugelli: 18 G, 20 G e 22 G. I parametri di stampa ottimali, tra cui la pressione di stampa e la velocità della testina di stampa, sono descritti nella Tabella 1.</li>
	<li>Caricare il codice G desiderato e premere la funzione servo ready sull'interfaccia software della biostampante per 3 s. Posizionare la lastra sul tavolino al punto di partenza del codice G e fare clic su Avvia per avviare il processo di stampa. NOTA: Tipicamente, la fabbricazione di una lastra contenente sei camere richiede circa 1 ora e 10 minuti. La fase 3.4, che prevede il caricamento e l'esecuzione del codice G, è soggetta a variazioni a seconda della specifica biostampante utilizzata. Assicurarsi che vengano mantenute le condizioni di sterilità durante l'utilizzo della biostampante per evitare contaminazioni.</li>
	<li>Mettere un coperchio sopra la piastra e trasferire la piastra in un incubatore a CO2 umidificato a 37 °C per 72 ore per polimerizzare le camere di silicio. NOTA: Sebbene l'indurimento del silicio possa avvenire a una velocità inferiore all'interno dell'incubatore, la piastra non deve essere posizionata all'interno di un forno asciutto.</li>
</ol>4. Preparazione dell'idrogel e inclusione del canale
<ol><li>Preparare una provetta conica da 50 mL contenente 20 mL di 1x PBS. Introdurre 0,01 g di litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP) nella provetta conica per ottenere una soluzione LAP allo 0,05% (p/v). Agitare fino a quando la polvere non è completamente sciolta. NOTA: Avvolgere il tubo conico in un foglio per evitare l'esposizione alla luce. Conservare la soluzione madre LAP a 4 °C.</li>
	<li>Aggiungere 3 g di gelatina metacrilato (GelMA) e 0,2 g di fibrinogeno a 20 ml di soluzione LAP per ottenere una concentrazione finale del 15% di GelMA e dell'1% di fibrinogeno (indicato come GelFib). Porre la miscela in un bagnomaria a 37 °C e mescolare periodicamente a vortice fino a quando la soluzione non è completamente disciolta.</li>
	<li>Dopo la fabbricazione come descritto nella Sezione 3, aggiungere 300 μl di GelFib preriscaldato in ciascuna camera di idrogel per incorporare il modello sacrificale. Reticolare rapidamente il GelMA con la luce ultravioletta (UV) a una lunghezza d'onda di 405 nm con un'intensità di 85 mW/cm2 per 120 s. Ripetere questa procedura per tutti gli altri pozzetti. NOTA: Il fibrinogeno si lega rapidamente al contatto con il modello sacrificale contenente trombina. Si consiglia di aggiungere idrogel ed eseguire la reticolazione UV individualmente per ogni pozzetto per evitare la gelificazione indesiderata di GelMA a temperatura ambiente. Inoltre, è necessario mantenere le condizioni sterili per prevenire la contaminazione durante il processo di polimerizzazione UV.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di DPBS su ciascun lato del canale vascolare in ciascun pozzetto e mantenere la piastra a 4 °C per 15 minuti per liquefare il PF127.</li>
	<li>Dopo 15 minuti, aspirare il DPBS e ripetere il passaggio 4.5 3 volte per il lavaggio completo del PF127.</li>
	<li>Prima di introdurre le cellule nei canali, perfondere DMEM F12 contenente l'1% di Matrigel per 30 minuti attraverso i canali per migliorare l'adesione delle cellule.</li>
</ol>5. Cultura HUVEC
<ol><li>Preriscaldare il terreno di coltura delle cellule endoteliali (ECGM) in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti.</li>
	<li>Nel frattempo, recupera una fiala di HUVEC crioconservati dal serbatoio dell'azoto, allenta delicatamente il tappo della fiala e poi stringila nuovamente per rilasciare l'azoto dai fili. Scongelare immediatamente le cellule immergendo il flaconcino in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 minuti, assicurandosi che all'interno del flaconcino rimanga una piccola quantità di ghiaccio. Sciacquare la fiala con etanolo al 70% per evitare contaminazioni. NOTA: Indossare occhiali di sicurezza quando si prelevano le cellule dal serbatoio dell'azoto. Durante questo processo, il tappo del flaconcino deve essere tenuto al di sopra del livello dell'acqua.</li>
	<li>Preparare una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di ECGM preriscaldato. Con una micropipetta, trasferire con cura le cellule scongelate dalla fiala alla provetta conica. Per assicurarsi che non rimangano cellule, aggiungere 1 mL di terreno fresco preriscaldato al crioviale, sciacquare l'interno e trasferire le cellule rimanenti nella provetta conica.</li>
	<li>Centrifugare la provetta conica a 200 × g per 3 minuti per ottenere un pellet cellulare. Scartare il surnatante, risospendere le cellule in 10 mL di terreno fresco, trasferire le cellule in un pallone T75 e collocare il pallone in un incubatore di CO2 umidificato a 37 °C. NOTA: Questo passaggio è importante per rimuovere il dimetilsolfossido presente nel mezzo di congelamento nel crioviale attraverso la centrifugazione.</li>
	<li>Rinfrescare il terreno a giorni alterni fino a quando le celle raggiungono l'80-90% di confluenza.</li>
</ol>6. Endotelizzazione dei canali
<ol><li>Preriscaldare ECGM, DPBS, soluzione neutralizzante della tripsina e acido etilendiamminotetraacetico (TE) di tripsina in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti.</li>
	<li>Alla confluenza del 90%, sciacquare le cellule in un pallone T75 con 10 mL di DPBS, aggiungere 1 mL di TE allo 0,25% al pallone e incubarlo per 3 minuti.</li>
	<li>Picchiettare delicatamente i lati del pallone e aggiungere 5 mL di soluzione neutralizzante della tripsina per neutralizzare il TE. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL. Utilizzare 5 ml di ECGM fresco per raccogliere le cellule rimanenti e aggiungerle al tubo conico.</li>
	<li>Centrifugare la provetta conica a 250 × g per 3 minuti per raccogliere il pellet della cella.</li>
	<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di ECGM fresco. Contare le cellule con un emocitometro e ripetere il passaggio 6.4 per ottenere un pellet cellulare. Risospendere 3 milioni di cellule in 90 μL di ECGM fresco.</li>
	<li>Prima di introdurre la sospensione cellulare nel canale, aspirare brevemente il canale con il vuoto per liberare il lume. NOTA: Evitare l'aspirazione prolungata del canale per evitare di danneggiarne l'integrità.</li>
	<li>Caricare delicatamente il canale con una sospensione cellulare a una densità di semina di 0,5 milioni di cellule per pozzetto. Utilizzare una micropipetta per aggiungere ~15 μl di questa sospensione per riempire il canale. NOTA: La densità di semina può variare a seconda delle dimensioni del canale. Questa densità è ottimizzata per un canale stampato con un ugello da 20 G e un diametro interno di circa 900 μm.</li>
	<li>Posizionare la piastra in piano all'interno dell'incubatrice per 2 ore. Successivamente, capovolgere la piastra a 180°, mantenendola in posizione piana per le successive 2 ore.</li>
	<li>Dopo 4 ore, lavare il canale con DPBS per rimuovere le cellule non aderenti e morte. Aggiungere 2 mL di ECGM fresco a ciascun pozzetto (1 mL su ciascun lato del canale). Avvia la coltura dinamica su un bilanciere con un angolo di inclinazione di 10° e 5 giri/min posizionando la piastra sul bilanciere con i canali paralleli alla direzione di oscillazione. Rinfrescare il terreno di coltura a giorni alterni. NOTA: La coltura dinamica migliora lo scambio del terreno tra i serbatoi e i canali e aiuta le cellule a proliferare durante la notte.</li>
</ol>7. Valutazione della maturazione dell'endotelio
<ol><li>Preriscaldare ECGM e DPBS in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti e il reagente Cell Counting Kit-8 (CCK8) a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare una soluzione di lavoro di CCK8 mescolando 100 μL di reagente CCK8 con 1 mL di ECGM fresco per ogni pozzetto. Mentre si lavora per una piastra/6 canali, preparare 600 μL di reagente CCK8 combinandolo con 6 mL di ECGM fresco.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura mediante aspirazione e sciacquare i canali con DPBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro CCK8 a ciascun pozzetto e lasciare che la piastra rimanga piatta all'interno dell'incubatore per 30 minuti. Successivamente, avvia la coltura dinamica su un bilanciere come descritto nel passaggio 6.9 e continua questo processo per le prossime 3 ore.</li>
	<li>Dopo 3 ore, rimuovere il contenuto da ciascun pozzetto inclinando la piastra su un lato e trasferirlo in una nuova piastra a sei pozzetti. Sciacquare i canali con DPBS e aggiungere terreno fresco. NOTA: Coprire la piastra con un foglio di alluminio fino alla misurazione dell'assorbanza. Mantenere un volume di reagente costante in tutti i pozzetti per garantire letture uniformi. Durante il pipettaggio, evitare accuratamente l'introduzione di bolle d'aria, che possono compromettere l'accuratezza delle letture della densità ottica.</li>
	<li>Dopo aver agitato delicatamente la lastra per 15 s per garantire una miscelazione uniforme dei colori, utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 450 nm.</li>
	<li>Ripetere questa procedura a intervalli di tempo predefiniti. Calcola la densità ottica media per ogni punto temporale e traccia una curva di crescita nel software grafico. Questa curva indica la maturazione relativa dell'endotelio nel tempo.</li>
</ol>8. Saggio di permeabilità
<ol><li>Rimuovi il terreno da un pozzo di interesse. NOTA: Per il test di permeabilità, si consiglia di trattare ciascun pozzetto separatamente per evitare che altri canali si secchino, il che potrebbe alterare la loro permeabilità vascolare.</li>
	<li>Preparare 6 mL di soluzione 0,1 mg/mL di destrano coniugato FITC sciogliendo destrano FITC 70 kDa in DPBS. NOTA: Preparare una soluzione madre da 20 mg/mL di destrano FITC sciogliendo 100 mg di destrano FITC in 5 mL di DPBS. Dopo aver agitato delicatamente la soluzione, aliquotare 500 μl in provette da 1,5 mL per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. Queste aliquote possono essere conservate a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Prima di eseguire il test, diluire la soluzione madre a una concentrazione di lavoro di 0,1 mg/mL.</li>
	<li>Posizionare saldamente la piastra sul tavolino del microscopio e regolare l'ingrandimento dell'obiettivo in modalità contrasto di fase per garantire una chiara visibilità della parete del canale nella regione di interesse, insieme al gel situato nelle vicinanze, all'interno del campo visivo. NOTA: Per un'efficace valutazione della permeabilità, cercare di massimizzare l'area del gel che circonda la regione di interesse nel campo visivo; Questo aspetto è fondamentale per un monitoraggio accurato del trasporto del destrano.</li>
	<li>Dopo aver messo a fuoco l'area desiderata, passare dalla modalità a contrasto di fase a quella a fluorescenza. Nella scheda di acquisizione dell'immagine , aggiungere FITC nel canale widefield e acquisire un'immagine prima di aggiungere la soluzione di destrano, per calcolare l'intensità della fluorescenza di fondo. Quindi, aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro di destrano FITC su un lato del canale e lasciare che la soluzione fluisca verso l'altro lato del pozzetto, spinta dalla differenza di pressione idrostatica.</li>
	<li>Acquisisci immagini a intervalli di tempo predeterminati, più frequentemente per i canali con elevata permeabilità e meno frequentemente per quelli con minore permeabilità.</li>
</ol>9. Misura dell'intensità della fluorescenza in ImageJ
<ol><li>Nel software di analisi delle immagini ImageJ, misurare l'intensità al punto temporale iniziale (It1), l'intensità media osservata al punto temporale successivo (It2) e l'intensità dovuta al rumore di fondo (Ib), come descritto di seguito. Utilizzare l'equazione (1) per calcolare il coefficiente di permeabilità (Pd). T1 e T2 si riferiscono ai punti temporali iniziale e successivo dell'acquisizione dell'immagine. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66676/66676eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)<ol><li>Avviare ImageJ e aprire l'immagine acquisita nel punto temporale iniziale.</li>
		<li>Impostare la scala in ImageJ. Passare ad Analizza | Imposta scala. Inserire la scala e l'unità di misura note.</li>
		<li>Seleziona lo strumento rettangolo e disegna un rettangolo sull'area del gel in cui è richiesta la misurazione dell'intensità della fluorescenza.</li>
		<li>Passare ad Analizza | Impostare le misure e assicurarsi che il valore medio del grigio sia selezionato. NOTA: Questa opzione misura l'intensità media all'interno dell'area selezionata. Altri parametri possono essere selezionati in base alle esigenze per l'analisi data.</li>
		<li>Con l'area ancora selezionata, vai su Analizza | Misura o semplicemente premi M. Attendi che si apra una finestra dei risultati , che mostri l'intensità media della fluorescenza e tutti gli altri parametri selezionati.</li>
		<li>Effettua tre misurazioni e calcola il valore medio dell'intensità della fluorescenza in un foglio di calcolo.</li>
		<li>Ripetere questa procedura per le immagini acquisite al successivo punto temporale t2, nonché per quelle acquisite prima dell'aggiunta della soluzione di destrano per il calcolo dell'intensità della fluorescenza al punto temporale successivo, per determinare la fluorescenza di fondo.</li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Bioprinting 3D per la fabbricazione rapida di reti vascolari utilizzando vasi su piastra

<table><tbody><tr><td>Pipetta sierologica da 10 mL</td><td>SPL SPL</td><td>91010</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 mL&nbsp;</td><td>Shinchang Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL provetta conica</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Bioprinter 3D&nbsp;</td><td>T& R Biofab</td><td>3DX-Printer</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti&nbsp;</td><td>SPL</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Cabine di sicurezza biologica</td><td>CHC LAB</td><td>PCHC-777A2-04,&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscopi invertiti in campo chiaro Kit</td> per il conteggio delle cellule <td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>(CCK8)</td>Kit per il conteggio delle cellule <td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>(CCK8)</td><td>Pallone per colture cellulari GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>75T</td><td>SPL</td><td>70075</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrice a membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR), senza LDEV, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td><td></td>distillata</tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, grado di coltura cellulare</td><td>Sigma aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kit</td><td>DOW</td><td>DC-184</td><td></td></tr><tr><td>DOWSIL SE 1700 trasparente con C 1,1 KG Kit.</td><td>DOW</td><td>2924404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS - 1x</td><td>Welgene</td><td>LB001-01</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule endoteliali MV 2 (Pronto all'uso)</td><td>Promocell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Micro pipetta(1000,200,100,20,10)</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico 99,9%</td><td>Duksan</td><td>D5</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeno da plasma bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-1G</td><td></td></tr><tr><td>FITC destrano 70 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Perle fluorescenti (1.0 &mu; m, verde)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1030-1ML</td><td></td></tr><tr><td>GelMA-polvere (Gelatina metacrilato) 50 g</td><td>Materiali 3D&nbsp;</td><td>20JT29</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, Terreno di congelamento per colture cellulari di recupero, 50 mL</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells)</td><td>Software Promocell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td> Incubatore <td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>SCIENTIFIC</td><td>Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubatore</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Kit di vitalità/citotossicità vivo/morto (per cellule di mammifero)</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Litio fenile (2,4,6-trimetilbenzoil) fosfato in polvere&nbsp;</td><td>Tokoyo Chemical Industry CO.</td><td>85073-19-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, coperchio della camera di conteggio</td><td>Marienfeld Superior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, emocitometro, camera di conteggio delle cellule</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-0650030</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>eppendorf</td><td>Centrifuge 5920 R</td><td></td></tr><tr><td>NCViewer.com</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di azoto</td><td>WORTHINGTON INDUSTRIES</td><td>LS750</td><td></td></tr><tr><td>Laser UV Omnicure</td><td>EXCELITAS</td><td>SERIES 1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina (100x)</td><td>GenDEPOT</td><td>CA005-010</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore planetario</td><td>THINKY CORPORATION, giappone</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per il trattamento al plasma</td><td>FEMTO SCIENCE</td><td>CUTE-1MPR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tampone preconfezionato, (P2007-1) 10x PBS</td><td>Biosesang</td><td>PR4007-100-00</td><td></td></tr><tr><td>Armadio per la conservazione dei reagenti</td><td>ZIO FILTER TECH</td><td>SC2-30F-1306D1-BC</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per imaging di cellule vive in tempo reale</td> Frigorifero <td>Carl ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>SAMSUNG</td><td>RT50K6035SL</td><td></td></tr><tr><td>ROCKER 2D digitale</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>Scoop-Spatola</td><td>CacheBy</td><td>SL-SCO7001-EA</td><td></td></tr><tr><td>sigma, tripsina-EDTA solizione, 0,25%</td> <td>Sigma aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato (SDS)</td> <td>Thermo Fisher scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Cilindro Punta Tappo</td><td>FISNAR</td><td>3051806</td><td></td></tr><tr><td>Tally</td><td>Counter Control Company</td><td>&nbsp; C23-147-050</td><td></td></tr><tr><td>Ugello conico (18 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-18G-U</td><td></td></tr><tr><td>Ugello conico (22 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-22G-U</td><td></td></tr><tr><td>Ugello conico 20 G</td><td>Musashi</td><td>TPND-20G-U</td><td></td></tr><tr><td>Trombina da plasma bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7326-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Timer, ETL SL a 4 canali</td><td></td><td>. Tim3005</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Trypan Blue 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione neutralizzante della tripsina</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td></td></tr><tr><td>UG Barattolo di unguento UG da 24 mL</td><td>Yamayu</td><td>No. 3-53</td><td></td></tr><tr><td>UG 58 mL Barattolo di unguento UG</td><td>Yamayu</td><td>No. 3-55</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WB-11</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per pesi</td><td>Sartorius</td><td>bce2241-1skr</td><td></td></tr></tbody></table>

metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

La piattaforma VOP, caratterizzata da flessibilità nelle dimensioni e nel modello, è stata realizzata con un sistema di bioprinting multi-testa. I canali, sia cavi che in grado di perfondere, sono stati seminati con HUVEC per facilitare l'endotelizzazione e sono stati successivamente valutati con un test di permeabilità (Figura 1A). Per dimostrare la capacità di produzione multiscala di questo metodo, abbiamo stampato tre configurazioni distinte: diritta, biforcata e contorta (Figura 1B). Attraverso un approccio di fabbricazione semplice, è possibile produrre sei canali vascolari cavi e perfusibili incorporati all'interno di una matrice di idrogel all'interno di una piastra standard a sei pozzetti. Questi canali possono quindi essere endotelializzati con HUVEC (Figura 2A). Le cellule si attaccano e proliferano rapidamente per coprire la superficie luminale del canale vascolare (Figura 2B). Le cellule che aderiscono sia alla superficie luminale inferiore che a quella superiore mostrano una distribuzione uniforme all'interno del lume (Figura supplementare S1).
La lastra è stata posta in un incubatore umidificato per 3 giorni per consentire all'inchiostro siliconico di polimerizzare, assicurando al contempo che il modello sacrificale rimanesse privo di essiccazione (Figura 3A). Per valutare il flusso attraverso questi canali, sono state introdotte microsfere verdi, dimostrando che i canali sono effettivamente perfusibili (Video supplementare S1). Il diametro dei canali è stato variato da 558 ± 38 μm a 1094 ± 45 μm modificando la dimensione dell'ugello da 22 G a 18 G durante la stampa del modello sacrificale. Inoltre, la configurazione geometrica dei canali è stata manipolata modificando il codice G del bioprinter (File supplementare 1) per consentire la stampa di modelli contorti e biforcati (Figura 3B).
La durata della reticolazione con UV è stata ottimizzata a 120 s, il che supporta un'efficace proliferazione cellulare (Figura S2 supplementare). Questa durata della reticolazione ha portato a un ambiente fisiologicamente più rilevante che promuove la proliferazione delle cellule endoteliali, probabilmente a causa delle proprietà meccaniche bilanciate e della porosità dell'idrogel, facilitando un migliore legame cellulare e la successiva proliferazione. Gli HUVEC hanno proliferato efficacemente sulla superficie luminale e hanno mostrato una morfologia simile a un ciottolo entro il giorno 5 dopo la semina. La maturazione dell'endotelio è stata valutata con il test CCK8 condotto nei giorni 1, 3 e 5 (Figura 4A, B). La maturazione dell'endotelio è stata verificata mediante immunocolorazione per CD31 5 giorni dopo la semina cellulare, che ha dimostrato la localizzazione di CD31 nelle giunzioni strette (Figura 4D).
Per valutare la funzione barriera dell'endotelio, abbiamo perfuso una soluzione di destrano 70 kDa attraverso i canali il giorno 5 di maturazione. Per il confronto, è stato selezionato un canale di controllo senza endotelio (nudo). Il canale endotelizzato ha mostrato cambiamenti minimi nella fluorescenza all'interno della regione del gel perivascolare nel tempo, suggerendo così che l'endotelio ha mantenuto efficacemente la sua funzione di barriera. Tuttavia, i canali nudi hanno mostrato un aumento della fluorescenza nella regione del gel perivascolare, indicando così una maggiore permeabilità dovuta all'assenza di endotelio (Figura 4C e Figura 4E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig01.jpg"> Figura 1: Preparazione dei canali vascolari stampati e loro configurazioni. (A) Schema di fabbricazione, endotelizzazione e saggio di permeabilità dei canali vascolari stampati. (B) Schema delle tre configurazioni dimostrate in questo metodo: diritta, biforcata e contorta. Abbreviazione: VOPs = recipienti su un piatto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig02.jpg"> Figura 2: Cronologia di fabbricazione per la stampa del modello sacrificale e della camera di silicio, nonché l'endotelizzazione del canale vascolare. (A) L'illustrazione rappresenta un singolo pozzetto della piastra del pozzetto e AA' si riferisce alla vista lungo il piano della sezione trasversale. (B) Immagini rappresentative delle fasi coinvolte nel processo di fabbricazione. Barre della scala = 5 mm (B1), 200 μm (B2-4). Abbreviazioni: GelFib = 15% di metacrilato di gelatina e 1% di fibrinogeno in soluzione di fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato allo 0,05% p/v; HUVEC = Cellule endoteliali della vena ombelicale umana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig03.jpg"> Figura 3: Recipienti su una lastra. (A) Immagine grossolana di recipienti su una lastra dopo la stampa del modello sacrificale e della camera di silicone. (B) Dimostrazione della fabbricazione multiscala di canali vascolari con una varietà di configurazioni e dimensioni, perfusi con microsfere verdi. Barre di scala = 200 μm (canali rettilinei), 1.000 μm (canali contorti e biforcati). Abbreviazioni: ID = diametro interno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig04.jpg"> Figura 4: Canali vascolari e loro maturazione e permeabilità endoteliale. (A) Immagini al microscopio a fluorescenza dei canali vascolari ai giorni 1, 3 e 5 dopo la semina con HUVEC marcati con proteine fluorescenti verdi, che mostrano la proliferazione e la morfologia dei ciottoli degli HUVEC al giorno 5. (B) La maturazione endoteliale è stata valutata con il test CCK-8 ai giorni 1, 3 e 5 dopo la semina cellulare. (C) Saggio di permeabilità dei canali vascolari endotelializzati (endotelio +) e nudi (endotelio -). (D) Immagini rappresentative della colorazione di CD31 illustrano la localizzazione di CD31 in corrispondenza di giunzioni strette il giorno 5. (E) Quantificazione della permeabilità diffusionale. Barre di scala = 200 μm (A, C, D). Abbreviazioni: HUVECs = Cellule endoteliali della vena ombelicale umana; GFP = proteina fluorescente verde; GFP HUVEC = HUVEC con tag GFP; CCK-8 = kit conteggio cellule 8; DAPI = 4'6-diamidino-2-fenilindolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Inchiostro da stampa</td>
			<td colspan="2">Parametri di stampa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Calibro dell'ugello</td>
			<td>Temperatura (°C)</td>
			<td>Pressione atmosferica (kPa)</td>
			<td>Velocità della testa (mm/min)</td>
		</tr><tr><td>Inchiostro sacrificale</td>
			<td>18</td>
			<td>37</td>
			<td>40-48</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Inchiostro siliconico</td>
			<td>22</td>
			<td>5</td>
			<td>100</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Parametri di stampa per gli inchiostri sacrificali e siliconici.
File supplementare 1: script G-Code contenente i comandi per la stampa 3D del modello sacrificale e della camera di silicio all'interno di una piastra a sei pozzetti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_GCode%20File_Jove.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura S1 supplementare: Immagini rappresentative della superficie luminale inferiore e superiore dopo la semina cellulare che mostrano l'attacco GFP-HUVEC sia sul piano focale inferiore che su quello superiore. Barre di scala = 200 μm. Abbreviazioni: UU' = piano focale superiore; LL' = piano focale inferiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S1%20rev.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare S2: Proliferazione di GFP-HUVEC in diverse durate di reticolazione con UV (405 nm). Barre di scala = 200 μm. Abbreviazioni: HUVECs = Cellule endoteliali della vena ombelicale umana; GFP = proteina fluorescente verde; GFP HUVEC = HUVEC con tag GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S2%20rev.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Video supplementare S1: Perfusione con microsfere verdi che mostrano l'effettiva perfusione attraverso i canali rettilinei, contorti e biforcati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/Channels%20Perfusion.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare S1: Funzioni dei comandi G-code e M-code. NOTA: Nel codice G, X, Y e Z indicano le coordinate per il movimento lungo l'asse X, l'asse Y e l'asse Z, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in ...

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Metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli (Video) | JoVE Journal

Metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli

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