Name: Manutenzione in laboratorio della mosca dei ditteri inferiori Bradysia (Sciara) coprophila: un nuovo/vecchio organismo modello emergente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 26 s
Description: Impara i protocolli di manutenzione in laboratorio di Bradysia coprophila per studiare dinamiche del fuso monopolare ed eliminazione cromosomica. Questo organismo modello emergente offre nuove prospettive per la biologia cellulare e dello sviluppo.

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Un ringraziamento speciale ai precedenti allevatori di B. coprophila (Jacob E. Bliss, Paula Bonazinga, Anne W. Kerrebrock, Ingrid M. Mercer, Heidi S. Smith) e al personale di ricerca (in particolare Robert Baird, Michael S. Foulk, Donna Kubai, John M. Urban, Yutaka Yamamoto) per aver messo a punto i protocolli di allevamento. Le istruzioni iniziali sulla cura di B. coprophila sono state fornite da Helen V. Crouse, Natalia Gabrusewycz-Garcia, Reba M. Goodman, Charles W. Metz ed Ellen Rasch. Con gratitudine a Yukiko Yamashita e Anne W. Kerrebrock per aver rilevato il centro di stoccaggio Bradysia (Sciara). Molto apprezzamento alle seguenti persone per la loro utile preparazione delle figure: Brian Wiegmann (Figura 1), John M. Urban (Figura 4 pannello superiore), Laura Ross (Figura 4 pannello inferiore), Yutaka Yamamoto (Figura 5 pannello di sinistra), Leo Kadota (Figura 7 e Figura 8). Ringraziamo Ava Filiss e il Brown University Multidisciplinary Laboratory per il loro aiuto nella fotografia e nelle riprese. Grazie a Robert Baird per i commenti su questo manoscritto. La nostra ricerca e il mantenimento di B. coprophila sono stati supportati da NIH e NSF, incluso il più recente supporto da NIH GM121455 a S.A.G. Ulteriori dettagli su B. coprophila sono disponibili sui siti web del Centro di Stoccaggio Bradysia (Sciara) (https://sites.brown.edu/sciara/ e https://sciara.wi.mit.edu) attualmente in fase di costruzione.

Bradysia coprophila Lab Protocols and Chromosomal Research

<ol><li>Lewin, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Earth+BioGenome+project%3A+Sequencing+life+for+the+future+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Earth BioGenome project: Sequencing life for the future of life.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (17), 4325-4333 (2018).</li>
<li>Wiegmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episodic+radiations+in+the+fly+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Episodic radiations in the fly tree of life.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 108 (14), 5690-5695 (2011).</li>
<li>Yeates, D. K., Wiegmann, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+Diptera%5BTitle%5D)+AND+%22Manual+of+Afrotropical+Diptera.Suricata%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of Diptera.</a> Manual of Afrotropical Diptera.Suricata. 3, 149-161 (2017).</li>
<li>Vilkamaa, P., Burdíková, N., Ševčík, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genus+Spinopygina+gen.+nov.+%28Diptera%2C+Sciaridae%29+from+Western+North+America%3A+Preliminary+molecular+phylogeny+and+description+of+seven+new+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">The genus Spinopygina gen. nov. (Diptera, Sciaridae) from Western North America: Preliminary molecular phylogeny and description of seven new species.</a> Insects. 14 (2), 173(2023).</li>
<li>Metz, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+behavior%2C+inheritance+and+sex+determination+in+Sciara%5BTitle%5D)+AND+%22Amer+Naturalist%22%5BJournal%5D)">Chromosome behavior, inheritance and sex determination in Sciara.</a> Amer Naturalist. 72 (743), 485-520 (1938).</li>
<li>Gerbi, S. A. Unusual chromosome movements in Sciarid flies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGerbi%2C+SA+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation.+Vol+13+Germ+Line+-+Soma+Differentiation%22">Results and Problems in Cell Differentiation. Vol 13 Germ Line - Soma Differentiation</a>. Hennig, N. 13, Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg. 71-104 (1986).</li>
<li>Gerbi, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-random+chromosome+segregation+and+chromosome+eliminations+in+the+fly+Bradysia+%28Sciara%29%5BTitle%5D)+AND+%2234%3BNon-Mendelian+Inheritance+and+Meiotic+Drive.%26%2334%3B%2C+Chromosome+Research.%28special+issue%29%22%5BJournal%5D)">Non-random chromosome segregation and chromosome eliminations in the fly Bradysia (Sciara).</a> 34;Non-Mendelian Inheritance and Meiotic Drive.&#34;, Chromosome Research.(special issue). Larracuente, A., Hanlon, S. 30, 273-288 (2022).</li>
<li>Steffan, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+revision+of+the+family+Sciaridae+%28Diptera%29+of+America+North+of+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22University+of+California+Publications+in+Entomology%22%5BJournal%5D)">A generic revision of the family Sciaridae (Diptera) of America North of Mexico.</a> University of California Publications in Entomology. 44, 1-77 (1966).</li>
<li>Shin, S., Jung, S., Menzel, F., Heller, K., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phylogeny+of+black+fungus+gnats+%28Diptera%3A+Sciaroidea%3A+Sciaridae%29+and+the+evolution+of+larval+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Molec+Phylogenetics+Evolution%22%5BJournal%5D)">Molecular phylogeny of black fungus gnats (Diptera: Sciaroidea: Sciaridae) and the evolution of larval habitats.</a> Molec Phylogenetics Evolution. 66 (3), 833-846 (2013).</li>
<li>Mohrig, W., Heller, K., Hippa, H., Vilkamaa, P., Menzel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revision+of+the+black+fungus+gnats+%28Diptera%3A+Sciaridae%29+of+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22Studia+Dipterologica%22%5BJournal%5D)">Revision of the black fungus gnats (Diptera: Sciaridae) of North America.</a> Studia Dipterologica. 19 (1-2), 141-286 (2013).</li>
<li>Ševčík, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phylogeny+of+the+megadiverse+insect+infraorder+Bibionomorpha+sensu+lato+%28Diptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Molecular phylogeny of the megadiverse insect infraorder Bibionomorpha sensu lato (Diptera).</a> PeerJ. 4, e2563(2016).</li>
<li>Menzel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudolycoriella+hygida+%28Sauaia+and+Alves%29-An+overview+of+a+model+organism+in+genetics%2C+with+new+aspects+in+morphology+and+systematics%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Pseudolycoriella hygida (Sauaia and Alves)-An overview of a model organism in genetics, with new aspects in morphology and systematics.</a> Insects. 15 (2), 118(2024).</li>
<li>Meigen, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeigen%2C+JW+%22Klassifikazion+und+Beschreibung+der+europ%C3%A4ischen+zweifl%C3%BCgligen+Insekten+%28Diptera+Linn%29%22">Klassifikazion und Beschreibung der europäischen zweiflügligen Insekten (Diptera Linn)</a>. 1 (1), Karl Reichard. Braunschweig. (1804).</li>
<li>Johannsen, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fungus+gnats+of+North+America+part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Maine+Agricultural+Experimental+Station+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The fungus gnats of North America part I.</a> Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 172, 209-276 (1909).</li>
<li>Johannsen, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycetophilidae+of+North+America%5BTitle%5D)+AND+%22Maine+Agricultural+Experimental+Station+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Mycetophilidae of North America.</a> Maine Agricultural Experimental Station Bulletin. 200, 57-146 (1912).</li>
<li>Urban, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradysia+%28Sciara%29+coprophila+larvae+up-regulate+DNA+repair+pathways+and+down-regulate+developmental+regulators+in+response+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Bradysia (Sciara) coprophila larvae up-regulate DNA repair pathways and down-regulate developmental regulators in response to ionizing radiation.</a> Genetics. (3), (2024).</li>
<li>Hodson, C. N., Jaron, K. S., Gerbi, S., Ross, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-rich+germline-restricted+chromosomes+in+black-winged+fungus+gnats+evolved+through+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene-rich germline-restricted chromosomes in black-winged fungus gnats evolved through hybridization.</a> PLoS Biology. 20 (2), e3001559(2021).</li>
<li>Urban, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+contiguity+de+novo+genome+assembly+and+DNA+modification+analyses+for+the+fungus+fly%2C+Sciara+coprophila%2C+using+single-molecule+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High contiguity de novo genome assembly and DNA modification analyses for the fungus fly, Sciara coprophila, using single-molecule sequencing.</a> BMC Genomics. 22, 643(2021).</li>
<li>Baird, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+evolution+of+a+maternally+acting+sex-determining+supergene+in+a+fly+with+single-sex+broods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Recent evolution of a maternally acting sex-determining supergene in a fly with single-sex broods.</a> Mol Biol Evol. 40 (7), (2023).</li>
<li>Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+ends+meet%3A+targeted+integration+of+DNA+fragments+by+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Making ends meet: targeted integration of DNA fragments by genome editing.</a> Chromosoma. 127 (4), 405-420 (2018).</li>
<li>Yamamoto, Y., Gerbi, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transformation+for+genome+editing+of+an+emerging+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Development of transformation for genome editing of an emerging model organism.</a> Genes. 13 (7), 1108-1124 (2022).</li>
<li>Metz, C. W., Smith, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+observation+on+the+nature+of+the+x-prime+%28X%27%29+chromosome+in+Sciara%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Further observation on the nature of the x-prime (X') chromosome in Sciara.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 17 (4), 195-198 (1931).</li>
<li>Crouse, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+induced+sex-linked+recessive+lethals+and+visibles+in+Sciara+coprophila%5BTitle%5D)+AND+%22Amer+Naturalist%22%5BJournal%5D)">X-ray induced sex-linked recessive lethals and visibles in Sciara coprophila.</a> Amer Naturalist. 95 (880), 21-26 (1961).</li>
<li>Metz, C. W., Ullian, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+the+sex+chromosomes+in+Sciara+%28Diptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of the sex chromosomes in Sciara (Diptera).</a> Proc Nat Acad Sci USA. 15 (2), 82-85 (1929).</li>
<li>Crouse, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+heterochromatin+subdivision+and+cytogenetic+analysis+in+Sciara+coprophila+%28Diptera%2C+Sciaridae%29.+I.+Centromere+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). I. Centromere localization.</a> Chromosoma. 63, 39-55 (1977).</li>
<li>Crouse, H. V., Gerbi, S. A., Liang, C. M., Magnus, L., Mercer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ribosomal+DNA+within+the+proximal+X+heterochromatin+of+Sciara+coprophila+%28Diptera%2C+Sciaridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Localization of ribosomal DNA within the proximal X heterochromatin of Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae).</a> Chromosoma. 64 (4), 305-318 (1977).</li>
<li>Crouse, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+heterochromatin+subdivision+and+cytogenetic+analysis+in+Sciara+coprophila+%28Diptera%2C+Sciaridae%29.+II.+The+controlling+element%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">X heterochromatin subdivision and cytogenetic analysis in Sciara coprophila (Diptera, Sciaridae). II. The controlling element.</a> Chromosoma. 74, 219-239 (1979).</li>
<li>Mok, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+the+DNA+puff+expanded+state+is+independent+of+active+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Maintenance of the DNA puff expanded state is independent of active replication and transcription.</a> Chromosoma. 110 (3), 186-196 (2001).</li>
<li>Smith-Stocking, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+on+selective+segregation+of+chromosomes+in+Sciara+coprophila+Lintner%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic studies on selective segregation of chromosomes in Sciara coprophila Lintner.</a> Genetics. 21 (4), 421-443 (1936).</li>
<li>Gabrusewycz-Garcia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+and+autoradiographic+studies+in+Sciara+coprophila+salivary+gland+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Cytological and autoradiographic studies in Sciara coprophila salivary gland chromosomes.</a> Chromosoma. 15, 312-344 (1964).</li>
<li>Wu, N., Liang, C., DiBartolomeis, S. M., Smith, H. S., Gerbi, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+progression+of+DNA+puffs+in+Sciara+coprophila%3A+amplification+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental progression of DNA puffs in Sciara coprophila: amplification and transcription.</a> Dev Biol. 160 (1), 73-84 (1993).</li>
<li>Yamamoto, Y., Gustafson, E. A., Foulk, M. S., Smith, H. S., Gerbi, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+evolution+of+a+DNA+replication+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Anatomy and evolution of a DNA replication origin.</a> Chromosoma. 130 (2-3), 199-214 (2021).</li>
<li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li>
<li>Bertone, M. A., Courtney, G. W., Wiegmann, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetics+and+temporal+diversification+of+the+earliest+true+flies+%28Insecta%3A+Diptera%29+based+on+multiple+nuclear+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Syst+Entomol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetics and temporal diversification of the earliest true flies (Insecta: Diptera) based on multiple nuclear genes.</a> Syst Entomol. 33, 668-687 (2008).</li>
<li>de Saint Phalle, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+sister+chromatid+separation+is+the+mechanism+of+programmed+chromosome+elimination+during+early+Sciara+coprophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Incomplete sister chromatid separation is the mechanism of programmed chromosome elimination during early Sciara coprophila embryogenesis.</a> Development. 122 (12), 3775-3784 (1996).</li>
<li>de Saint Phalle, B., Oldenbourg, R., Kubai, D., Salmon, E. D., Gerbi, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paternal+chromosome+elimination+and+X+non-disjunction+on+asymmetric+spindles+in+Sciara+male+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Paternal chromosome elimination and X non-disjunction on asymmetric spindles in Sciara male meiosis.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Bath, J. D., Sponsler, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+method+for+the+culture+of+Sciara+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An alternative method for the culture of Sciara larvae.</a> Science. 109 (2828), 255(1949).</li>
<li>Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crane+fly+spermatocytes+and+spermatids%3A+A+system+for+studying+cytoskeletal+components%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Crane fly spermatocytes and spermatids: A system for studying cytoskeletal components.</a> Methods Cell Biol. 25, Pt B 227-252 (1982).</li>
<li>Gillespie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+rearing+method+for+fungus+gnats+Corynoptera+sp.+%28Diptera%3A+Sciaridae%29+with+notes+on+life+history%5BTitle%5D)+AND+%22J+Entomol+Soc+Br+Colum%22%5BJournal%5D)">A simple rearing method for fungus gnats Corynoptera sp. (Diptera: Sciaridae) with notes on life history.</a> J Entomol Soc Br Colum. 83, 45-48 (1986).</li>
<li>Gardiner, R. B., Jarvis, W. R., Shipp, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+Pythium+spp.+by+larvae+of+the+fungus+gnat+Bradysia+impatiens+%28Diptera%3A+Sciaridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Appl+Biol%22%5BJournal%5D)">Ingestion of Pythium spp. by larvae of the fungus gnat Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae).</a> Ann Appl Biol. 116, 205-212 (1990).</li>
<li>Hungerford, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciara+maggots+injurious+to+potted+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Econ+Entomol%22%5BJournal%5D)">Sciara maggots injurious to potted plants.</a> J Econ Entomol. 9 (6), 538-549 (1916).</li>
<li>Thomas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rearing+mushroom+insects+and+mites%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+News%22%5BJournal%5D)">A method for rearing mushroom insects and mites.</a> Entomol News. 40, 222-225 (1929).</li>
<li>Austin, M. D., Pitcher, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+laboratory+method+for+rearing+Sciara+and+phorid+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Mon+Mag%22%5BJournal%5D)">A laboratory method for rearing Sciara and phorid flies.</a> Entomol Mon Mag. 72, No. 860 12-15 (1936).</li>
<li>Butt, F. H. Culture of Sciara. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButt%2C+FH+%22Culture+methods+for+invertebrate+animals%22">Culture methods for invertebrate animals</a>. Galtsoff, P. S., Lutz, F. E., Welch, P. S., Needham, J. G. , Comstock Publ. Co. Ithaca. 400-401 (1937).</li>
<li>Hudson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+greenhouse+sciarid+fly+populations+using+Tetradonema+plicans+%28Nematoda%3A+Mermithoidea%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invert+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regulation of greenhouse sciarid fly populations using Tetradonema plicans (Nematoda: Mermithoidea).</a> J Invert Pathol. 23 (1), 85-91 (1974).</li>
<li>Wilkinson, J. D., Daughterty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+development+of+Bradysia+impatiens+%28Diptera%3A+Sciaridae%29+under+constant+and+variable+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Entomol+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">Comparative development of Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae) under constant and variable temperatures.</a> Ann Entomol Soc Am. 63 (4), 1079-1083 (1970).</li>
</ol>

L'autore non ha conflitti di interesse da dichiarare.

I protocolli qui presentati per l'allevamento di B. coprophila saranno utili per gli scienziati che desiderano allevare questo organismo nei loro laboratori per esperimenti che approfondiscano le sue caratteristiche biologiche uniche. La descrizione iniziale del metodo di alimentazione con lievito e polvere di funghi spruzzata su una base di agar per mantenere B. coprophila29 è stata utilizzata nel laboratorio di Metz per allevare 14 diverse speciedi mosche sciaridi. Successivamente, è stato osservato che l'aggiunta di ortica e/o polvere di spinaci aumentava ulteriormente la vitalità di B. coprophila (Gabrusewycz-Garcia, comunicazione personale). Questi metodi hanno avuto successo per il mantenimento di specie imparentate all'interno della famiglia degli Sciaridae, tra cui Bradysia impatiens e Lycoriella ingenua che sono attualmente in coltura (Robert Baird, comunicazione personale).
Altri metodi (come i metodi di alimentazione alternativi descritti di seguito) sono stati provati per allevare B. coprophila, ma i protocolli qui descritti sono stati ottimizzati per avere il rapporto più favorevole di larve per superficie di agar per ottenere gli adulti grassi più fertili e ridurre al minimo la crescita di muffe. Per aumentare, l'accoppiamento di massa può essere effettuato in fiale di vetro come descritto nel protocollo 2 di cui sopra. In alternativa, alcune (2-4) femmine adulte possono essere messe insieme al doppio dei maschi adulti in una fiaschetta come quella usata per allevare la Drosophila (usa e getta 6 once = 177,4 ml di bottiglia di polipropilene Drosophila a fondo quadrato). In entrambi i casi, il ricercatore deve essere pienamente sicuro che il pallone contenga solo tutte le madri produttrici o tutte le madri produttrici maschili.
Nutri solo le larve poiché le pupe e gli adulti non mangiano. Non somministrare la fiala se le larve si sono trasformate in pupe (un segno di ciò è quando compaiono le prime mosche adulte ad emergere precocemente). Una volta che gli adulti si sono chiusi, mettere le fiale in un'incubatrice più fredda (ad es. 16 °C), se disponibile, in quanto ciò consentirà agli adulti di vivere più a lungo. Somministrare tre volte alla settimana (ad esempio, lunedì, mercoledì, venerdì), aumentando la quantità di cibo somministrata per fiala man mano che le larve invecchiano. Nutri generosamente e sarai ricompensato con adulti fertili e grassi. Tuttavia, se dai troppa poppa alla grande, apparirà della muffa bianca e questo è un segno per ridurre la quantità di cibo che stai depositando in una fiala. Inoltre, se si alimenta troppo, si svilupperà un denso cuscinetto di cibo sopra l'agar e renderà più difficile l'emergere degli adulti (è possibile rimuovere il cuscinetto con una pinza, ma fare attenzione a non estrarre le larve con il tampone: è meglio non doverlo fare affatto). Le fiale con poche larve (contrassegnate con "poche") hanno bisogno di meno cibo. Se ti nutri troppo poco, le larve si arrampicheranno sulle pareti della fiala in cerca di cibo. Le larve denutrite danno luogo a piccoli adulti meno fertili.
Metodi di alimentazione alternativi È stata tentata una varietà di metodi per nutrire le larve solo una volta durante lo stadio larvale piuttosto che 3 volte a settimana. B. coprophila non crescerà su cibo in stile Drosophila . John Urban (comunicazione personale) ha provato a mescolare il cibo di B. coprophila con l'agar, ma è cresciuta troppa muffa. Ha scoperto che l'aggiunta di due inibitori della muffa (tegosept e acido propionico) in combinazione e separatamente, provando diverse concentrazioni, erano tutti tossici per B. coprophila a livelli che inibiscono la muffa. L'agar deve avere un pH compreso tra 6 e 7 (neutro) poiché B. coprophila si ammala a pH acido (come con l'acido propianico). In alternativa, per ovviare all'alimentazione tre volte alla settimana, ha provato a usare una spatola o una siringa senza ago per erogare una densa pasta di lievito (lievito secco attivo Red Star mescolato con un po' di acqua distillata per inumidirlo) come una cucchiaiata sopra l'agar in ogni fiala una settimana dopo l'accoppiamento (cioè, circa nel momento in cui le larve inizieranno ad emergere).
Un altro metodo per evitare l'alimentazione tre volte alla settimana è aggiungere una coltura vivente di funghi a ciascuna fiala. Bath e Sponsler37 hanno riportato che una superficie inclinata di agar con il terreno di Sabouraud dovrebbe essere striata con una coltura fungina dei generi Chaetoconidia (migliore) o altrimenti Baplosporangia o Xllescheria. Il fungo è stato coltivato da diversi giorni a una settimana prima dell'introduzione di B. coprophila . Dopo questo non è stato necessario nutrire. Una variante di questo metodo è stata impiegata anche da Ellen Rasch (comunicazione personale). Nelle nostre mani, le fiale erano troppo bagnate con questo metodo e le larve sono annegate, ma si potrebbe riprovare per ottimizzare il numero di larve rispetto alle fiale con funghi vivi.
Arthur Forer (comunicazione personale) ha avuto un certo successo nell'allevamento di B. coprophila allo stesso modo delle mosche della gru38. Con questo approccio, le pupe venivano allevate su cartapesta umida. Successivamente, gli adulti venivano accoppiati e le uova venivano depositate su cartapesta fresca e umida. Le larve risultanti sono state mantenute in cartapesta in piastre di Petri e nutrite con foglie di ortica in polvere due volte a settimana. Le pupe venivano messe in una gabbia per ripetere il ciclo.
Yukiko Yamashita (comunicazione personale) ha cercato senza successo di allevare B. coprophila sul terreno, imitando le condizioni in cui si trovano in natura nelle piante in vaso e nelle serre con elevata umidità. Tuttavia, la muffa può diventare un problema quando il livello di umidità aumenta. Ciononostante, il terreno umido è stato utilizzato con successo per allevare larve di Pseudolycoriella (precedentemente Bradysia) hygida in scatole di plastica con terreno umido; vengono nutriti con foglie decomposte di Ilex paraguariensis, integrate nella tarda vita larvale con estratto di lievito all'1,2%, amido di mais all'1,4%, farina d'avena allo 0,8%, agar12 all'1,2%. Allo stesso modo, il terreno umido può essere sostituito da muschio di torba umido con fagioli frantumati per allevare mosche sciaridie39,40.
Altri metodi ancora sono stati impiegati per mantenere le colture di laboratorio di Bradisia: (i) patata autoclavata a cui vengono aggiunti lievito e fertilizzante ematico essiccato41; ii) letame 42,43,44 a cui può essere aggiunto sangue secco 45; iii) contenitori di plastica con dischetti di cotone e tovaglioli di carta inumiditi con semi di soia macinati46.
Acari Gli acari possono essere trasferiti da Drosophila a B. coprophila. Per ridurre al minimo questo problema, è meglio tenere B. coprophila in un'incubatrice o in una stanza separata, non vicino alle scorte di Drosophila. Inoltre, eseguire qualsiasi lavoro di manutenzione di B. coprophila all'inizio della giornata prima di maneggiare Drosophila. Gli acari possono anche essere trasferiti a B. coprophila dalle piante d'appartamento, quindi non tenere le piante nella stessa stanza di B. coprophila. Se gli acari invadono le fiale, possono essere visti come piccoli organismi sferici bianchi che strisciano sul corpo di B. coprophila. I trattamenti chimici che lavorano per distruggere gli acari in Drosophila non possono essere utilizzati per B. coprophila poiché le sostanze chimiche uccidono B. coprophila (B. coprophila è anche sensibile ai fumi organici come il fenolo). L'unico trattamento per liberare le scorte di B. coprophila dagli acari è quello di raccogliere manualmente gli embrioni su una piastra di acar, esaminare ciascuno per l'assenza di acari e quindi trasferirli in fiale di agar fresche usando un pennello fine. I tappi di garza riempiti di cotone e i flugs in schiuma di acetato di cellulosa (come quelli utilizzati per le fiale di polipropilene Drosophila) aiutano entrambi a prevenire l'ingresso di acari nelle fiale.
Utilità dei protocolli di allevamento I protocolli qui descritti consentiranno alla crescente comunità di scienziati di allevare B. coprophila come un nuovo/vecchio organismo modello emergente per studiare le sue caratteristiche biologiche uniche. Nuovi gruppi di laboratorio sono incoraggiati a unirsi alla comunità in crescita per mantenere e studiare le caratteristiche biologiche uniche della Bradisia (Sciara).

Una comprensione completa dei principi biologici richiede lo studio di molti organismi diversi che abbracciano l'Albero della Vita. Sebbene una vasta gamma di organismi sia stata descritta fino alla fine delXIX secolo, dalla metà del XXsecolo gli studi sperimentali si sono limitati a una manciata di meno di una dozzina di organismi modello. Con l'avvento dell'era genomica e l'obiettivo di sequenziare i genomi di tutte le specie nell'Albero della Vita1, siamo ora in grado di espandere i tipi di organismi utilizzati per esperimenti di laboratorio e di sfruttare la loro diversità. Tale espansione di organismi modello emergenti per gli esperimenti ha un prerequisito per essere in grado di mantenerli in laboratorio. Qui, vengono descritti i protocolli per l'allevamento di uno di questi organismi modello emergenti, nuovo/vecchio.
La maggior parte della vita animale sulla Terra è rappresentata da quattro super-radiazioni di Insetti2. All'interno degli Insetti sono presenti circa 158.000 specie di Ditteri (mosche vere)3, con circa 3000 specie della famiglia degli Sciaridae (moscerini dei funghi neri)4. La mosca della frutta Drosophila è la più studiata delle mosche dei Ditteri. La mosca dei Ditteri inferiori (Nematocera), Bradysia (precedentemente chiamata Sciara) coprophila, si è separata 200 milioni di anni fa da Drosophila, che è una mosca "Dittera superiore" (Brachycera). Pertanto, B. coprophila si trova in una posizione tassonomica favorevole per gli studi comparativi con D. melanogaster (Figura 1). Inoltre, B. coprophila ha molte caratteristiche biologiche uniche che meritano di essere studiate a sé 5,6,7. Molte di queste caratteristiche disobbediscono alla regola della costanza del DNA in cui tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso contenuto di DNA. In B. coprophila, (i) il genoma paterno viene eliminato su un fuso monopolare nella meiosi maschile I; (ii) vi è una non disgiunzione della diade X nella meiosi maschile II; (iii) i cromosomi (L) limitati alla linea germinale sono eliminati dal soma; e (iv) uno o due cromosomi X vengono eliminati nell'embrione precoce a seconda del sesso dell'individuo. L'imprinting cromosomico per distinguere gli omologhi materni da quelli paterni è stato scoperto per la prima volta in B. coprophila ed è in gioco per molti di questi eventi di eliminazione cromosomica. Oltre all'eliminazione dei cromosomi, un altro bypass della costanza del DNA si verifica attraverso l'amplificazione del DNA locus-specifica regolata dallo sviluppo nei loci del soffio del DNA nei cromosomi politenici delle ghiandole salivari larvali. Gli studi su queste caratteristiche uniche richiedono il mantenimento in laboratorio di B.coprophila; I dettagli del suo allevamento sono presentati qui per facilitare tali studi.
<img alt="Diagramma filogenetico degli insetti, relazione tra Ditteri e Imenotteri, tassonomia evolutiva." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig01v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Filogenesi della bradisia (Sciara) coprophila. Gli organismi modello più diffusi sono indicati in carattere blu e il loro ordine tassonomico in carattere rosso. La bradisia e altri moscerini dei funghi sciaridi, così come le zanzare, sono mosche dei ditteri inferiori (in precedenza, sottordine Nematocera), mentre le specie di Drosophila sono mosche dei ditteri superiori (sottordine: Brachysera). Le informazioni sul lato sinistro della figura provengono da Misof et al.33; le informazioni sul lato destro provengono da Bertone et al.34 e Wiegmann et al.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In precedenza, il genere Sciara aveva il maggior numero (700) di specie per qualsiasi eucariote, spingendo Steffan a suddividerlein 8. Successivamente, Shin propose che la famiglia Sciaridae fosse suddivisa nella sottofamiglia Sciarinae (con sei generi tra cui Sciara, Trichosia e Leptosciarella), nella sottofamiglia Megalosphyinae (incluso il genere Bradysia) e in altri tre gruppi (tra cui Pseudolycoriella)9. La filogenesi degli Sciaridae è stata ulteriormente studiata da diversi gruppi negli ultimi anni 9,10,11. Negli ultimi decenni, i nomi di molti organismi della famiglia Sciaridae sono cambiati12. Sebbene la maggior parte della letteratura che copre più di un secolo si riferisca all'organismo che studiamo come Sciara coprophila, il suo attuale nome tassonomico è ora Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola e altri sinonimi)10. Si trovano in tutto il mondo e sono comunemente conosciuti come moscerini dei funghi poiché mangiano funghi e altri funghi. Furono descritti per la prima volta nel 1804 da Meigen13 in Europa e successivamente da Johannsen 14,15 in Nord America. B. coprophila è stato raccolto al Cold Spring Harbor Laboratory e le scorte di laboratorio sono state create da Charles Metz nei primi anni del 1900, quando era uno studente laureato alla Columbia University con Thomas Hunt Morgan. Pertanto, gli stock attuali riflettono un secolo di consanguineità. Allo stesso modo, la biologia di B. coprophila è stata ulteriormente chiarita da decenni di studi citogenetici di Helen Crouse (che ha svolto il suo dottorato di ricerca con Barbara McClintock).
Negli anni '30, la Bradysia (Sciara) entrò in competizione con la Drosophila melanogaster come sistema modello per gli studi genetici. Nonostante le sue numerose caratteristiche biologiche uniche, B. coprophila è stato eclissato da D. melanogaster come organismo modello popolare poiché le mutazioni fenotipiche indotte dalle radiazioni erano necessarie per gli studi genetici ed erano più facili da ottenere in quest'ultimo, anche se B. coprophila è solo leggermente più resistente all'irradiazione gamma rispetto a D. melanogaster16. Nell'era moderna della genomica, questo non è più un problema. Dal momento che la sequenza del genoma 17,18,19 (Urban, Gerbi e Spradling, dati non mostrati) e i metodi per la trasformazione 20,21 (Yamamoto e Gerbi, dati non mostrati) per B. coprophila sono diventati recentemente disponibili, i tempi sono ora maturi per utilizzarlo come un nuovo/vecchio sistema modello emergente, come visto dalla crescente comunità di scienziati che lo hanno adottato per le loro ricerche. Questo articolo descrive le procedure per la manutenzione del laboratorio.
B. coprophila manca di un cromosoma Y e il sesso della prole è determinato dalla madre. Le femmine che hanno il cromosoma X' ("X-prime") con una lunga inversione paracentrica avranno solo figlie femmine, mentre le femmine che sono omozigoti per il cromosoma X standard (non invertito) avranno solo figli maschi5 (Figura 2). Le informazioni sulla sequenza sono disponibili per il cromosoma X'19, ma il meccanismo molecolare rimane da chiarire su come il cromosoma X' determini che la prole sarà femmina. I maschi non hanno mai il cromosoma X' e, dopo la fecondazione, le femmine sono X'X (eterozigoti per X') o XX. Le femmine adulte di X'X possono essere distinte dalle femmine XX per i marcatori fenotipici sull'ala (Figura 3). Le femmine X'X (che avranno solo figlie femmine) possono essere riconosciute dal marcatore dominante dell'ala ondulata (W) sulla X' (come nel ceppo HoLo2)22. In alternativa, le femmine XX (che avranno solo figli maschi) possono essere riconosciute dall'indicatore recessivo dell'ala minuscola (p) sulla X come nel 91S stock23. In questo caso, le femmine X'Xp avranno ali a tutta lunghezza (non piccole) e avranno solo figlie. Il 6980 di serie porta un marcatore recessivo sul cromosoma X per le vene gonfie (sw)24, così come il marcatore dominante Wavy sulla X', che consente due marcatori per la selezione per le croci. Il grado di espressione di Wavy può variare e sembra più debole in fiale sovraffollate dove il cibo è limitato o se la temperatura diventa troppo calda. Il fenotipo dell'ala ondulata è eccezionalmente forte se le larve vengono tenute in cella frigorifera (4°-8 °C) invece dei soliti 21 °C. Sebbene il marcatore recessivo dell'ala piccola non sia variabile e sia molto facile da identificare, i calci 91S vengono utilizzati meno frequentemente poiché sono meno sani del calcio HoLo2. Gli schemi di accoppiamento di B. coprophila sono presentati qui (Figura 2) e descritti in dettaglio per gli stock HoLo2, 7298 e W14 (Supplemental File 1), gli stock 91S (Supplemental File 1), gli stock 6980 (Supplemental File 1) e gli stock di traslocazione (Supplemental File 1). Gli stock di traslocazione non sono più esistenti; erano traslocazioni reciproche di eterocromomeri (H1, H2 e H3) sul braccio corto dell'X che contiene i geni dell'RNA ribosomiale 25,26,27.
<img alt="Diagramma di determinazione del sesso con incroci genetici; Combinazioni XX e XY; processo di formazione dello zigote." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Schema di accoppiamento per B. coprophila. Questo organismo non ha il cromosoma Y (il soma maschile ha una sola X); Le madri determinano il sesso della loro prole. Le madri XX hanno solo figli maschi e le femmine X'X hanno solo figlie femmine. Il cromosoma X' ha una lunga inversione paracentrica rispetto al cromosoma X. La linea paterna o materna del cromosoma X (o X') è indicata rispettivamente con il blu o il rosso, in questa figura. Gli spermatozoi sono aploidi per gli autosomi, ma hanno due copie del cromosoma X a causa della non disgiunzione nella meiosi II. La linea somatica degli embrioni precoci elimina una o due copie dell'X di derivazione paterna se saranno rispettivamente femmina o maschio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Studio della morfologia degli insetti, immagini al microscopio che mostrano le strutture delle ali e del corpo, etichettate A-G per l'analisi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Fenotipi alari di B. coprophila. Le mosche femmine adulte sono mostrate con vari fenotipi di ali: (A) ala dritta (XX), (B) ala ondulata (X'WX), (C) fenotipo di ala ondulata estrema (X'WX) che ha un aspetto raggrinzito dopo aver immagazzinato le larve nel roo m freddo, (D) ala piccola (XpXp) che è vestigiale, (E) ala dritta con tipo selvatico (XX) e vene non gonfie, (F) ala diritta con vene gonfie (XswXsw) dove compaiono piccole bolle (frecce nere) sul bordo superiore dell'ala e/o vicino alla punta di entrambe le ali, (G) esempio estremo di rigonfiamento dove una vescica (freccia bianca) si verifica su una o entrambe le ali. I maschi mancano del cromosoma X' e quindi non avranno mai ali ondulate, ma hanno ali piccole o gonfie rispettivamente nel ceppo 91S o 6980. Barra della scala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'obiettivo nel mantenimento del bestiame è quello di eseguire incroci in cui metà degli incroci provengono da madri che producono femmine e metà gli incroci da madri che producono maschi per avere un numero uguale di adulti femmine e maschi nella generazione successiva per gli incroci successivi. Tuttavia, ciò comporta anche la pianificazione, poiché il ciclo di vita dei maschi è più breve rispetto a quello delle femmine e i maschi adulti emergono fino a una settimana prima delle femmine adulte. La natura accoglie questa asincronia tra i sessi facendo emergere gli embrioni maschili come larve 1-2 giorni dopo le larve femminili da un incrocio nella stessa data. Tuttavia, per garantire che maschi e femmine adulti siano disponibili contemporaneamente per le croci di laboratorio, lo sviluppo delle femmine può essere in qualche modo accelerato lasciando fiale con larve femmine a temperatura ambiente piuttosto che a 21 °C o posizionando fiale con larve maschili a temperature leggermente più fresche (ad esempio, 16 °C). Un altro percorso più infallibile è quello di fare incroci con madri produttrici il lunedì e incroci con madri produttrici il venerdì della stessa settimana. Il percorso più semplice, che è quello che utilizziamo, è quello di eseguire incroci con madri produttrici e produttrici lo stesso giorno ogni settimana ed eseguire incroci in quel giorno in ogni settimana consecutiva. In questo approccio, le femmine adulte di un incrocio alla settimana 1 possono essere accoppiate con maschi adulti emersi da un incrocio alla settimana 2.
Il ciclo di vita della femmina di B. coprophila è di 5 settimane se allevata a 21 °C (Tabella 1). La durata del loro ciclo di vita è un po' più lunga a temperature più basse o se sono denutriti. Il ciclo di vita del maschio di B. coprophila è di ~4-4,5 settimane poiché si impupano 0,5-1 settimana prima delle femmine. La fine di ogni stadio larvale è contrassegnata dalla perdita della cuticola, che è innescata da un'esplosione del livello dell'ormone steroideo ecdisone. A differenza di D. melanogaster, che ha tre stadi larvali, B. coprophila ha quattro stadi larvali.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fase di sviluppo</td>
			<td>Giorni dopo l'accoppiamento (dpm)</td>
			<td>Durata della tappa (giorni)</td>
		</tr><tr><td>Deposto l'uovo</td>
			<td>1-2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Embrione</td>
			<td>Da 1-2 a 7-8</td>
			<td>~7 giorni</td>
		</tr><tr><td>Larva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Gli stadi larvali 1, 2 e 3</td>
			<td>dal 7-8 al 16-19</td>
			<td>~10</td>
		</tr><tr><td>4° stadio larvale pre-macchia oculare</td>
			<td>dalle 16-19 alle 21-24</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>4° stadio larvale della macchia oculare</td>
			<td>dal 21-24 al 25-28</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>Pupa</td>
			<td>da 25-28 a 30-33</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Adulto</td>
			<td colspan="2">vive 1-2 giorni a 21 °C se accoppiato o vive 2-3 settimane a 16 °C se non accoppiato.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Ciclo vitale della femmina di B. coprophila a 21 °C.
B. coprophila può essere allevato ovunque nell'intervallo 15 °C-25 °C, con uno sviluppo che progredisce più lentamente a temperature più fresche. Questo insetto predilige un ambiente umido (trovandosi nel terreno di piante d'appartamento o aiuole di funghi), quindi teniamo un bicchiere con acqua deionizzata nell'incubatrice. La B. coprophila può essere conservata a temperatura ambiente in una scatola per il pane di metallo con un coperchio largo e contenente un bicchiere d'acqua, ma va in shock termico a 37 °C28, che è un pericolo nei climi caldi. Michael Ashburner e altri hanno cercato con scarso successo di conservare D . melanogaster al freddo per ridurre il tempo necessario per la conservazione delle scorte. Al contrario, uno dei principali vantaggi di B. coprophila è che le fiale con larve allo stadio intermedio possono essere conservate fino a 3 mesi su uno scaffale aperto nella cella frigorifera (4-8 °C) con una cura minima di somministrare solo una volta al mese. Si sviluppano molto lentamente al freddo fino allo stadio di pupa e riemergeranno come adulti fertili quando le fiale saranno riportate a 21 °C. Presumibilmente, questo imita il loro svernamento in natura. Questo stallo dello sviluppo indotto dal freddo potrebbe essere paragonabile a quello osservato dopo l'irradiazione gamma delle larve di B. coprophila allo stadio intermedio16, ma lo stallo dello sviluppo non si osserva nelle larve in stadio avanzato che hanno superato il punto di non ritorno per la loro normale progressione dello sviluppo.

<table><tbody><tr><td>Agar (batteriologico)</td><td>U.S. Biological</td><td>A0930</td><td>https://www.usbio.net; &nbsp;</td></tr><tr><td>CO2 FlyStuff Pedale</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-121</td><td></td></tr><tr><td>CO2 FlyStuff Pistola ad aria compressa</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104</td><td></td></tr><tr><td>CO2 FlyStuff UltimaterFlypad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-172</td><td>https://www.geneseesci.com</td></tr><tr><td>Cappa a etere</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>3955220</td><td>Si siede sopra il banco del laboratorio</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Filtro di ricambio&nbsp; cat # 6961300</td></tr><tr><td>Cucina: Birraio s Lievito in polvere</td><td>Solgar</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Ottieni da Amazon o da un negozio di alimenti naturali</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>https://www.solgar.com;</td></tr><tr><td>Cibo: Ortica in polvere&nbsp; (senza pesticidi)</td><td>Starwest Botanicals</td><td>209460-51</td><td></td></tr><tr><td>Cibo: Funghi Shitake (senza pesticidi)</td><td>Starwest Botanicals</td><td>202127-5</td><td>https://www.starwest-botanicals.com;</td></tr><tr><td>Cibo: Spinaci in polvere (senza pesticidi)</td><td>Starwest Botanicals</td><td>209583-5</td><td></td></tr><tr><td>Cibo: Paglia (senza pesticidi)</td><td>Starwest Botanicals</td><td>209465-3</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo: vetro trasparente, coperchio in polipropilene</td><td>Fisher Scientific:</td><td>FB02911765</td><td>73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) https://www.fishersci.com;</td></tr><tr><td>Sonda ad ago, manico in legno</td><td>US Geo Supply Inc</td><td>SKU: 4190</td><td>Sonda lunga da 5,75 pollici, ago in acciaio inossidabile https://usgeosupply.com; (970)-434-3708</td></tr><tr><td>Fiale: vetro, preferito:</td> <td>Wilmad LabGlass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wilmad-glass fiale</td><td></td><td></td> personalizzate <td>28-33 mm diametro interno, 33 mm diametro esterno, 9,5 cm ht Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com</td></tr><tr><td>Fiale: vetro (più economico e ok)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-26H</td><td>diametro esterno 29 mm, 9,5 cm h &nbsp; https://www.fishersci.com; &nbsp;</td></tr><tr><td>Fiale: vetro (un po' stretto)&nbsp;</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>32-201</td><td>Diametro esterno 24,5 mm, 9,5 cm h thttps://www.geneseesci.com</td></tr><tr><td>Fiale: polipropilene&nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-114</td><td>28,5 mm diametro esterno, 9,5 cm ht</td></tr><tr><td>Tappi per fiale</td> rotolo di cotone non assorbente <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>22-456881</td><td></td></tr><tr><td>garza</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-055053</td><td>https://www.fishersci.com;</td></tr></tbody></table>

manutenzione in laboratorio della mosca dei ditteri inferiori bradysia (sciara) coprophila: un nuovo/vecchio organismo modello emergente

Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism

Le scorte di laboratorio della mosca dittera inferiore, Bradysia (Sciara) coprophila, sono state mantenute per oltre un secolo. I protocolli per il mantenimento in laboratorio di B. coprophila sono presentati qui. Questi protocolli saranno utili per il numero in rapida crescita di laboratori che studiano B. coprophila per trarre vantaggio dalle sue caratteristiche biologiche uniche, che includono (1) un fuso monopolare nella meiosi maschile I; (2) non disgiunzione della diade X nella meiosi maschile II; (3) imprinting cromosomico per distinguere gli omologhi materni da quelli paterni; (4) cromosomi a linea germinale limitata (L); (5) eliminazione cromosomica (cromosomi paterni nella meiosi maschile I; uno o due cromosomi X negli embrioni precoci; cromosomi L dal soma negli embrioni precoci); (6) determinazione del sesso da parte della madre (non c'è il cromosoma Y); e (7) amplificazione del DNA regolata dallo sviluppo nei loci del soffio del DNA nei cromosomi politenici delle ghiandole salivari larvali. 
È ora possibile esplorare queste numerose caratteristiche uniche della meccanica cromosomica utilizzando i recenti progressi nel sequenziamento e nell'assemblaggio del genoma di B. coprophila e lo sviluppo di una metodologia di trasformazione per l'ingegneria genomica. La crescente comunità scientifica che utilizza B. coprophila per la ricerca trarrà beneficio dai protocolli qui descritti per l'accoppiamento delle mosche (marcatori fenotipici per le madri che avranno solo figli maschi o solo figlie; dettagli sull'accoppiamento di massa per esperimenti biochimici), il controllo della schiusa degli embrioni, l'alimentazione delle larve e altri commenti sul suo allevamento.

I protocolli qui descritti hanno portato a un comprovato successo nell'allevamento di B. coprophila. Quando gli adulti grassi recentemente chiusi vengono scelti per l'accoppiamento (Figura 4), oltre il 90% degli incroci può essere fertile e produrre prole. Il successo della fertilità varia a seconda dei ceppi (Tabella 2). Lo stock 7298 (cromosoma X' con marcatore ondulato) era il più sano degli stock, ma ha attraversato un periodo di declino, apparentemente a causa dell'attivazione di elementi mobili del DNA che creano riarrangiamenti del genoma32. Il ceppo HoLo2 rappresenta un ceppo sano derivato dal 7298, dove apparentemente i riarrangiamenti del genoma si sono stabilizzati, e ha sostituito il ceppo parentale 7298 nel centro di allevamento. Il ceppo HoLo2 è quello che è stato utilizzato per sequenziare il genoma di B. coprophila ed è quello più utilizzato da vari gruppi di laboratorio. Recentemente, la mutagenesi CRISPR delle mosche HoLo2 è stata utilizzata per creare il ceppo W14 con un fenotipo di occhio bianco da utilizzare per la trasformazione con marcatori oculari fluorescenti (Yamamoto e Gerbi, dati non mostrati). La varietà W14 è eccezionalmente robusta. Il calcio 6980 (ala ondulata e marcatori di vene gonfie) è un po' meno robusto e il calcio 91S (marcatore ad ala piccola) è ancora meno robusto.
Gli incroci riusciti danno origine a embrioni (Figura 5). Gli embrioni subiscono l'eliminazione dei cromosomi X paterni impressi dalla 7aalla 9a divisione di scissione. Inoltre, i cromosomi L limitati alla linea germinale vengono eliminati dalla linea somatica negli embrioni dalla 5aalla 6a divisionedi scissione . Gli embrioni emergono come larve, che non devono essere confuse con la muffa che può essere presente (Figura 6). Le macchie oculari (dall'anca agli occhi adulti) compaiono nella seconda metà del 4°stadio larvale (Figura 7). La dimensione delle macchie oculari fornisce un comodo marcatore fenotipico per l'insorgenza e la progressione dell'amplificazione del DNA puff, che è uno degli unici due esempi noti di amplificazione del DNA intracromosomico sito-specifico regolata dallo sviluppo naturale (gene). Successivamente, le pupe si sviluppano e la quantità di pigmento che riempie i loro occhi può fungere da marcatore di sviluppo per la meiosi I e II nella spermatogenesi (Figura 8) con i suoi comportamenti cromosomici unici in queste divisioni.
<img alt="Confronto tra la determinazione del sesso degli insetti; XwX femmina, XX femmina, XO maschio; diagramma di studio genetico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Accoppiamento di mosche adulte di B. coprophila . Il pannello superiore mostra i tre tipi di mosche adulte presenti nel ceppo HoLo2: madri che producono femmine con ali ondulate (X'WX femmine adulte), madri che producono maschi con ali dritte (XX femmine adulte) e maschi con ali dritte (X0 maschi adulti). Si noti l'ovopositore appuntito all'estremità posteriore delle mosche femmine e il clasper a forma di uncino all'estremità posteriore delle mosche maschili. Il pannello inferiore mostra un accoppiamento tra maschio e femmina, in cui il maschio ha afferrato l'ovopositore della femmina. Lo sperma verrà immagazzinato nella spermateca della femmina e feconderà gli ovuli man mano che vengono scaricati all'esterno. La lunghezza degli adulti è di 2,0 mm (maschi), 2,5 mm (femmine). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Embriogenesi di Drosophila, microscopia a fluorescenza, cicli embrionali, tabella cronologica della divisione cellulare." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Embrioni di B. coprophila. Il pannello in alto a sinistra è una vista degli embrioni utilizzando la luce standard in un microscopio da dissezione; I nuclei nel citoplasma sinciziale appaiono come punti neri. Il pannello a destra utilizza la microscopia a fluorescenza per visualizzare i nuclei colorati con ioduro di propidio degli embrioni. Gli embrioni hanno una lunghezza media di 200 micron e una larghezza media di 150 micron. I nuclei delle cellule germinali si raggruppano al polo posteriore dell'embrione, come si vede per i cicli 6 (embrione inclinato in avanti) e 7-9, dopo di che sono intervallati da nuclei somatici. L'eliminazione del cromosoma L nella linea somatica avviene nella divisione di scissione 5 o 6; L'eliminazione del cromosoma X nella linea somatica avviene nella7a, 8a o 9a divisionedi scissione. La cellularizzazione avviene durante l'interfase del ciclo 11. La tabella a sinistra mostra la durata media di ogni ciclo di divisione a 22 °C. Il tavolo a sinistra e il pannello a destra sono stati adattati con il permesso di de Saint Phalle e Sullivan35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Interazione insetto-funghi; immagine al microscopio; crescita del micelio; studio dei parassiti; funghi entomopatogeni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: Gli embrioni di B. coprophila emergono come larve. Un grappolo di embrioni (freccia spessa blu) è visibile vicino all'ovopositore della femmina adulta morta dopo la deposizione delle uova. Una settimana dopo la deposizione delle uova, gli embrioni diventano giovani larve, molte delle quali sono indicate dalle frecce nere. Le larve appena emerse hanno una mascella nera all'estremità anteriore e un corpo traslucido. Si muovono sopra la superficie dell'agar e non devono essere confusi con la muffa che non si muove. L'inserto mostra una muffa, con un filamento bianco (freccia rossa) e una spora nera sulla punta (freccia verde), ed è leggermente più piccolo delle larve appena emerse. Barra della scala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Fasi di sviluppo delle larve, formazione precoce delle macchie oculari, immagini al microscopio, analisi della crescita biologica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figura 7: Stadi della macchia oculare delle larve di B. coprophila . Le macchie oculari si formano nella parte anteriore della larva, appena dietro la mascella, e sono composte da granuli di pigmento che aumentano di numero. Le macchie oculari sono l'anlage dell'occhio adulto. Il pannello superiore mostra le larve che sono state visualizzate con un microscopio da dissezione; Il pannello inferiore è una vista ingrandita delle macchie oculari utilizzando un microscopio a contrasto di fase per visualizzare una larva su un vetrino da microscopio con una goccia di acqua distillata e un vetrino coprioggetti che galleggia leggermente sulla parte superiore. La nomenclatura degli stadi della macchia oculare è secondo Gabrusewycz-Garcia30 dove il numero di granuli è contato nella fila più lunga (ad esempio, 12) e viene annotato il numero di righe aggiuntive escludendo la riga più lunga (ad esempio, 6 per lo stadio della macchia oculare 12x6). L'inizio dell'amplificazione del DNA sito-specifico nei cromosomi politenici delle ghiandole salivari inizia allo stadio 10x5 della macchia oculare e si completa a 14x7 quando c'è un'esplosione di trascrizione al locus e l'espansione dei sbuffi di DNA31. Nella successiva fase di edge-eye/mascella abbassata, i granuli della macchia oculare iniziano a fondersi e si allontanano lateralmente dalla linea mediana; La lunghezza del corpo larvale si accorcia. Inoltre, i soffi di DNA si condensano in questa fase. Ci vuole circa un giorno a 21 °C per attraversare ogni stadio della macchia oculare. Barra della scala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Fasi di metamorfosi degli insetti; sviluppo della pupa; serie di immagini; trasformazione da larve ad adulto." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> Figura 8: Sviluppo delle pupe di B. coprophila . Durante l'impupamento, tutti i tessuti larvali si istolizzano ad eccezione del sistema nervoso e vengono sostituiti da tessuti adulti che originano dalle divisioni cellulari dei dischi immaginali. Il colore della carrozzeria cambia dal bianco all'abbronzatura, dal marrone al nero. Il pigmento si riempie gradualmente nell'occhio della pupa; la meiosi I e II si verifica nelle pupe maschili con occhi che sono da 1/4 a 1/2 riempiti di pigmento36. Barra della scala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome di magazzino</td>
			<td>Marcatori</td>
			<td>Tasso di fertilità</td>
			<td>Commenti</td>
		</tr><tr><td>7298</td>
			<td>Ala ondulata (W)</td>
			<td>~75%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HoLo2</td>
			<td>Ala ondulata (W)</td>
			<td>~90%</td>
			<td>derivato da 7298</td>
		</tr><tr><td>W14</td>
			<td>Ala ondulata (W); Occhi bianchi</td>
			<td>~95%</td>
			<td>derivato da HoLo2</td>
		</tr><tr><td>6980</td>
			<td>Ala ondulata (W); vene gonfie (SW)</td>
			<td>~65%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>91S</td>
			<td>ala ondulata debole (W); Ali piccole (P)</td>
			<td>~50%</td>
			<td>il marcatore Wavy è stato introdotto in una croce per salvare la 91S</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Stock di bradisia (Sciara) coprophila. La Tabella 1 di Gerbi6 elenca questi marcatori e altri che non sono più esistenti. Cinque traslocazioni (T1, T23, T29, T32, T70) all'estremità del centromero dell'X27 sono riassunte nella Figura 8 di Gerbi6 ma non sono più esistenti.
File supplementare 1: Incroci HoLo2 (e 7298 e W14), incroci 91S e salvataggio, incroci 6980, incroci di traslocazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/Supplemental%20Materials.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Questo articolo descrive il mantenimento in laboratorio (compreso l'accoppiamento e l'alimentazione) della mosca dittera inferiore Bradysia (Sciara) coprophila.

Manutenzione in laboratorio della mosca dei ditteri inferiori Bradysia (Sciara) coprophila: un nuovo/vecchio organismo modello emergente

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. ...

Manteniamo la mosca del dittero inferiore, Bradisia, nota anche come Sciara coprophila per studiare alcune delle sue proprietà biologiche uniche che includono un fuso monopolare e la non disgiunzione della diade x nella meiosi, l'imprinting cromosomico, i cromosomi specifici della linea germinale, l'eliminazione dei cromosomi, la determinazione del sesso materno e l'amplificazione del DNA nei sbuffi di DNA cromosomico inquinanti. Nel nostro laboratorio, Yutaka Yamamoto ha sviluppato una metodologia per la trasformazione genomica della coprofilia di Bradisia. Inoltre, il trascrittoma di questo organismo è stato reso disponibile e il suo genoma è stato sequenziato e assemblato da John Urban.Queste scoperte consentono l'esplorazione della biologia unica della bradìsia coprophila. Ti invitiamo a unirti alla crescente comunità di scienziati per affrontare le proprietà uniche della bradìsia coprophila. I risultati chiariranno meccanismi molecolari di fondamentale importanza per la biologia cellulare e dello sviluppo.I protocolli di allevamento qui presentati serviranno come tutorial per mantenere la bradisia coprophila nel proprio laboratorio.

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Manutenzione in laboratorio della mosca dei ditteri inferiori Bradysia (Sciara) coprophila: un nuovo/vecchio organismo modello emergente (Video) | JoVE Journal

Manutenzione in laboratorio della mosca dei ditteri inferiori Bradysia (Sciara) coprophila: un nuovo/vecchio organismo modello emergente

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