Preparazione di un modello murino di pancreatite acuta grave tramite una combinazione di iniezione intraperitoneale di ceruleina e lipopolisaccaride

Il trattamento della pancreatite acuta grave è difficile a causa degli alti tassi di mortalità utilizzando modelli animali, in particolare topi con background selezionato C57BL/6J. Stiamo studiando SAP come patologico per identificare bersagli terapeutici e sviluppare nuovi trattamenti, fornendo il metodo polimice all'unico SAP research.

Questa ricerca ha scoperto un'elevata espressione dei geni HMGB1 che danneggiano la pancreatite, suggerendo la sua associazione con il calcolo infiammatorio della pancreatite acuta grave. Il nostro protocollo prevede che la ceruleina induca la contrazione della cistifellea e interrompa il digiuno nei topi, causando danni al tessuto pancreatico bloccando la secrezione di liquidi digestivi. In combinazione con l'iniezione di LPS, abbiamo indotto una grave pancreatite con insufficienza d'organo nei topi. Questo approccio non è invasivo e facile da implementare con cicli brevi e un'elevata ripetibilità.

[Dimostratore] Per iniziare, misurare e registrare il peso del topo sperimentale. Per l'iniezione intraperitoneale di Caeruleina, afferrare e tenere premuto il topo con la pancia rivolta verso l'alto e la testa posizionata più in basso della coda. Tenere la siringa nella mano destra e inserire l'ago nella cute sottocutanea sul lato sinistro della linea bianca addominale. Spostare l'ago in avanti di circa 3-5 millimetri e inserirlo nella cavità addominale con un angolo di 45 gradi. Tenere fermo l'ago e iniettare lentamente la Caeruleina. Estrarre l'ago, quindi massaggiare delicatamente e premere il sito di iniezione con un batuffolo di cotone sterile per diffondere completamente il farmaco nella cavità addominale. 12 ore dopo l'iniezione, posizionare il topo al centro della griglia nella scatola sperimentale rivolta lontano dallo sperimentatore. Attiva il software di tracciamento video e imposta il monitoraggio per quattro campi visivi simultanei. Segna la lunghezza e la larghezza dell'oggetto sperimentale che può muoversi all'interno della scatola nella schermata di monitoraggio in tempo reale. Registra l'attività del mouse per 15 minuti. I cambiamenti macroscopici misurati nel modello di topi con lesione pancreatica durante i cinque cicli hanno dimostrato che i topi nel gruppo di lesione pancreatica 5 hanno mantenuto un basso livello di distanza di movimento entro tre minuti, mentre il rapporto di immobilità entro tre minuti è aumentato con ogni ciclo successivo. Il gruppo di lesioni pancreatiche 5 ha mostrato la distanza di movimento totale più piccola rispetto agli altri gruppi sperimentali e la differenza era statisticamente significativa. Ad eccezione del gruppo di controllo e del gruppo di lesioni pancreatiche 1, tutti i gruppi hanno mostrato una crescita di peso negativa del valore D, con il gruppo di lesioni pancreatiche 5 che ha mostrato la variazione maggiore. L'analisi del tasso di sopravvivenza ha indicato un tasso di mortalità dell'80% nel gruppo di lesioni pancreatiche 5 entro il quinto giorno, a differenza degli altri gruppi che non hanno mostrato differenze significative rispetto al controllo. Dopo 36 ore dall'iniezione intraperitoneale di Caeruleina, sopprimere e fissare il topo in posizione supina su una piastra di schiuma. Praticare un'incisione mediana addominale e capovolgere il tubo dell'intestino tenue verso destra per esporre il pancreas. Scollegare il duodeno e il dotto pilorico. Localizzare l'intestino tenue sotto il pancreas, quindi liberare completamente il tessuto pancreatico lungo il dotto intestinale. Usando una pinza senza denti, bloccare la milza e tirare delicatamente verso l'alto. Sezionare bruscamente il tessuto del legamento pancreatico posteriore fino alla testa del pancreas. Quindi scollegare il dotto biliare e i vasi sanguigni. Rimuovere il tessuto pancreatico dalla cavità addominale e asciugare tamponando l'umidità superficiale con carta assorbente. Misurare e registrare il peso del tessuto pancreatico. Dopo aver preparato le sezioni di paraffina, decerare i tessuti pancreatici due volte in xilene per cinque minuti ciascuno. Trattare ogni sezione con 100 microlitri di proteinasi K e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Aggiungere la quantità necessaria di perossido di idrogeno al 3% al tessuto e incubare per 20 minuti per infiltrarlo completamente. Coprire l'intera area del campione con 50 microlitri di tampone di equilibrio e incubare per 10 minuti. Quindi aggiungere 56 microlitri di tampone di incubazione TDT a ciascun campione di tessuto e incubare per un'ora. Lavare le sezioni di tessuto quattro volte con PBS per cinque minuti ciascuna prima di incubare per 30 minuti in 100 microlitri di soluzione di reazione Streptavidina-HRP. Per la colorazione DAB, aggiungere 50 microlitri di DAB a ciascuna sezione di tessuto. Immergere le sezioni in una soluzione colorante di ematossilina per tre-cinque minuti prima di risciacquare con acqua pura. Disidratare i campioni con quattro cicli di etanolo anidro fresco per cinque minuti ciascuno. Eseguire un esame istologico al microscopio a luce bianca. La colorazione TUNEL sui tessuti pancreatici dei topi ha rivelato un aumento della necrosi cellulare nel gruppo di lesioni pancreatiche 5, con valori della scala di grigi significativamente più elevati e tassi di necrosi positivi rispetto ad altri gruppi. L'immunoblotting proteico ha valutato l'espressione della caspasi-3, un marcatore di necrosi cellulare, e ha mostrato un aumento significativo nei tessuti del gruppo di lesione pancreatica 5. La citometria a flusso di sospensioni di cellule acinose pancreatiche, marcate con un CPI di adattamento alla Nexina 5, ha indicato un tasso di mortalità cellulare notevolmente più elevato nel gruppo di lesioni pancreatiche 5 rispetto ad altri, con significatività statistica.