Isolamento di nuclei dal tessuto adiposo intermuscolare umano e sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo a valle
3 maggio 2024
La biologia del tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) è in gran parte inesplorata a causa della limitata accessibilità del tessuto umano. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei nuclei e la preparazione della libreria di IMAT umano congelato per il sequenziamento di RNA a singoli nuclei per identificare la composizione cellulare di questo deposito adiposo unico.
Il nostro gruppo di ricerca sta cercando di comprendere la composizione cellulare e i profili trascrizionali specifici delle cellule del tessuto adiposo intermuscolare o IMAT nell'uomo. L'IMAT è in realtà un deposito adiposo ectopico che risiede tra e intorno alle fibre muscolari. La tomografia computerizzata e la risonanza magnetica sono state in grado di quantificare il volume dell'IMAT e hanno recentemente dimostrato che aumenta sia con l'età che con l'IMC, ed è anche associato a malattie degenerative muscolari.
Studi sul secretoma in vitro hanno recentemente dimostrato che le proteine secrete da IMAT hanno la capacità di influenzare la sensibilità all'insulina, i profili infiammatori e anche l'espressione proteica contrattile nel muscolo scheletrico umano. La quantità limitata di tessuto IMAT raccolto durante le biopsie e la natura lipidica degli adipociti rendono questo tessuto incompatibile con la digestione dei tessuti e l'RNA-Seq a singola cellula. Pertanto, volevamo sviluppare un protocollo che eseguisse l'isolamento dei nuclei su piccole quantità di tessuto che potessero poi essere utilizzati nell'RNA-Seq a singoli nuclei a valle.
Questo protocollo consentirà ai ricercatori di determinare le alterazioni trascrizionali composizionali e cellulo-specifiche che si verificano nell'IMAT in diversi stati di malattia metabolica e in risposta agli interventi. Ci auguriamo che queste informazioni siano cruciali nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche per aiutare ad alleviare la malattia metabolica prendendo di mira direttamente l'IMAT o i suoi fattori secreti. Il campo manca gravemente di dati sulla biologia di IMAT, sulle sue origini cellulari e sulla comunicazione con altre cellule, residenti sia all'interno che all'esterno di IMAT, nonché sulle sue risposte molecolari agli interventi sullo stile di vita, come la dieta e l'esercizio fisico o la farmacoterapia.
Tutte queste sono domande chiave per la ricerca del nostro gruppo.
Panoramica
Questo studio analizza la composizione cellulare e i profili trascrittionali specifici del tessuto adiposo intermuscolare (IMAT) nell'uomo, un ambito meno esplorato a causa della limitata accessibilità del tessuto. Viene presentato un protocollo dettagliato per l'isolamento di nuclei e la preparazione di librerie per il sequenziamento dell'RNA da singoli nuclei, al fine di facilitare l'identificazione dei componenti cellulari all'interno di questo deposito adiposo unico.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia del tessuto adiposo intermuscolare (IMAT)
- Composizione e funzione cellulare
- Impatto sulle malattie metaboliche
Sfondo
- IMAT è un deposito adiposo ectopico situato tra le fibre muscolari.
- Il suo volume aumenta con l'età e con l'IMC, correlando con le malattie degenerative muscolari.
- La secrezione di proteine da parte dell'IMAT influenza la sensibilità all'insulina e l'infiammazione nel muscolo scheletrico.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di nuclei da piccoli campioni di tessuto IMAT umano
- Sequenziamento dell'RNA da singoli nuclei
- Sviluppo del protocollo per la manipolazione di tessuto adiposo ricco di lipidi
Risultati principali
- Sviluppato un protocollo che consente ai ricercatori di analizzare la trascrittomica specifica per cellula dell'IMAT.
- Agevolata l'identificazione delle alterazioni cellulari nei disturbi metabolici e nelle interazioni.
- Migliorata la comprensione del ruolo dell'IMAT nella salute metabolica.
Conclusioni
- Lo studio fornisce informazioni preziose sulla biologia dell'IMAT.
- I risultati potrebbero guidare nuove strategie terapeutiche mirate all'IMAT nelle malattie metaboliche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il sequenziamento dell'RNA da singoli nuclei di tessuto adiposo intermuscolare umano (IMAT) affronta un'importante lacuna nella comprensione della composizione cellulare specifica del deposito e degli stati trascrizionali rilevanti per le malattie metaboliche e degenerative del muscolo. Questo protocollo consente un profilo ad alta risoluzione a partire da materiali bioptici limitati, sostenendo la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta e nella validazione degli obiettivi per i portafogli di malattie metaboliche. L'approccio migliora la riduzione del rischio meccanicistico nell'intersezione tra biologia del tessuto adiposo e del muscolo, fornendo indicazioni per la ricerca traslazionale e lo sviluppo di strategie terapeutiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dell'eterogeneità cellulare e dei programmi trascrizionali specifici per IMAT.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi rivelando firme di espressione genica specifiche per tipo cellulare.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistica per gli obiettivi legati a malattie metaboliche e muscolari.
- Fornisce dati fondamentali per la priorizzazione di strategie di intervento specifiche per deposito.
Screening e sviluppo di saggi
- Prepara sospensioni di nuclei validate adatte a flussi di lavoro ad alto rendimento di RNA-seq a singolo nucleo.
- Standardizza l'elaborazione dei campioni da biopsie di tessuto umano ricco di lipidi e limitate.
- Permette la rilevazione riproducibile di popolazioni cellulari rare e a bassa abbondanza.
- Supporta letture trascrittomiche quantitative per la valutazione di composti successivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i profili cellulari dell'IMAT a fenotipi muscolari e metabolici rilevanti per la malattia.
- Consente una continuità dalla scoperta su tessuti umani alla validazione in modelli preclinici.
- Supporta l'identificazione di biomarcatori traslazionali associati alla biologia dell'IMAT.
- Fornisce indicazioni per lo sviluppo mirato di programmi terapeutici specifici per il deposito, adeguati al rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di isolamento e sequenziamento dei nuclei si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica nella ricerca sulle malattie metaboliche e muscolari, consentendo una valida conferma degli obiettivi e una continuità traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla composizione cellulare dell'IMAT e sull'influenza del secretoma sui tessuti muscolari.
- Screening: Fornisce preparazioni standardizzate e riproducibili di nuclei per saggi trascrittomici su larga scala.
- Analisi: Offre dati quantitativi di RNA-seq a singolo nucleo per analisi comparative tra diversi stati patologici e interventi.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti su tessuti umani allo sviluppo di modelli preclinici e alla scoperta di biomarcatori.
- Utilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile per il profilo di altri depositi adiposi difficili o campioni bioptici limitati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella selezione dei bersagli correlati all'IMAT e nella comprensione dei meccanismi.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento dei nuclei da tessuti umani ricchi di lipidi e disponibili in quantità limitate, per analisi successive riproducibili.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione di programmi terapeutici mirati ai depositi adiposi e riduce il rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli asset per le malattie metaboliche e muscolari, aggiustata in base al rischio, sulla base di dati ottenuti da tessuti umani.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei tessuti, nell'isolamento dei nuclei e nella preparazione di librerie per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo.
- Richiede l'accesso a strumentazione specializzata per il conteggio dei nuclei e per il sequenziamento basato su goccioline.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro per le procedure di elaborazione dei campioni e per i flussi di analisi dati.
- Potrebbe richiedere adattamenti per altri distretti adiposi o tipi di tessuto con contenuto lipidico differente.
- È limitato dalla quantità e dalla qualità del materiale bioptico umano disponibile per l'analisi.
