Name: Monitoraggio dellapertura della barriera emato-encefalica nei ratti con un sistema ecografico focalizzato preclinico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 32 s
Description: Impara un protocollo combinato di risonanza magnetica e ultrasuoni focalizzati per aprire la barriera emato-encefalica nei ratti. Questo metodo consente il monitoraggio preciso e migliora la riproducibilità nella ricerca preclinica.

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Questo studio è stato parzialmente supportato dal National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) Grant K99DE032397, dal Seed Grant del Dipartimento UCSF (n. 7504831), dal RAP grant dell'UCSF (PI: Kazim Narsinh, MD) e dalla German Research Foundation (DFG, GA 3535/1-1).

Tutti gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati approvati dall'Università della California, San Francisco (UCSF) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). In questo studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley (200-250 g). I ratti sono stati alloggiati e curati secondo le linee guida del National Institutes of Health Office of Animal Care and Use su topi e ratti. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione degli animali
NOTA: Per le procedure interne, gli animali sono stati trasportati nella sala di preparazione e le procedure sono state condotte come segue:
<ol>
	<li>Mettere i ratti singolarmente in una camera di lucite ed esporre l'isoflurano (2%-3%) mescolato con l'ossigeno estratto da una bombola di ossigeno medica fino a quando non sono incoscienti (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente). 
	NOTA: L'anestesia con isoflurano consente l'implementazione di un protocollo di risonanza magnetica a lungo termine.</li>
	<li>Rimuovi i ratti dalla camera e rade i peli dalle zone anteriori e posteriori del collo usando una crema depilatoria.</li>
	<li>Applicare un unguento lubrificante sugli occhi.</li>
	<li>Posizionare il naso nel cono nasale per mantenere l'anestesia con la respirazione spontanea (vaporizzatore di isoflurano tra il 2% e il 2,5%, flussometro di ossigeno fino a 1-1,5 L/min).</li>
	<li>Posizionare il ratto anestetizzato su un tavolo chirurgico riscaldato e confermare con un pizzico di dito del piede. 
	NOTA: Il protocollo MRI includeva sequenze con contrasto potenziato, come l'imaging con eco gradiente pesato in T1 e l'imaging con eco di spin pesato in T2. Queste sequenze sono state condotte sia prima che dopo l'iniezione di agenti di contrasto a base di gadolinio (GAD) per valutare la permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB). Ciò comporta la somministrazione di agenti di contrasto GAD mentre il ratto si trova in uno scanner MRI7. Per facilitare questo processo, è stato utilizzato un tubo del catetere che si estende dal catetere cannulato nel ratto. L'estensione comprendeva un connettore per catetere e un tubo in polietilene di 30 cm. Per garantire la pervietà e prevenire perdite, il tubo di prolunga è stato lavato con glicerolo eparinizzato (250 UI di eparina/1 ml di glicerolo).</li>
</ol>
2. Ecografo focalizzato a guida stereotassica
NOTA: Gli animali sono stati trasferiti e posizionati su un tavolo in un sistema FUS stereotassico. Il naso del ratto è stato inserito nel cono del naso per mantenere l'anestesia. Il sistema FUS comprende un generatore di funzioni, un amplificatore RF e un oscilloscopio. Prima di configurare il trasduttore, ci siamo assicurati del corretto collegamento di tutti i dispositivi con il sistema. La configurazione del trasduttore è stata completata utilizzando i seguenti passaggi:
<ol>
	<li>Posiziona un puntatore appuntito sulla posizione del Bregma nel cranio e salva la posizione. La posizione di Bregma può essere identificata puntando la posizione di 9,0 mm anteriormente a Lambda sulla linea mediana8. La Lambda si trova al centro della linea tra i timpani bilaterali9.</li>
	<li>Posizionare il gel per ultrasuoni sulla testa del ratto, sulla sacca di accoppiamento dell'acqua e sul trasduttore (frequenza 1 MHz). Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria tra la pelle del ratto, la sacca di accoppiamento dell'acqua e il trasduttore.</li>
	<li>Collegare un cavo BNC coassiale del trasduttore all'ingresso del modulo del sistema FUS.</li>
	<li>In un computer di controllo) Fare clic su carica per immagini di ratti pre-registrate; Vengono scelti un numero di punti focali e la pressione acustica.</li>
	<li>In un computer di controllo) Fare clic sul test di movimento nel modulo di trattamento per assicurarsi che il trasduttore possa spostarsi da un punto all'altro entro un periodo di burst.</li>
	<li>Impostare i parametri di sonicazione descritti al punto 3.</li>
</ol>
3. Infusione e sonicazione di microbolle
<ol>
	<li>Attiva il microbubble. 
	NOTA: La microbolla utilizzata in questo studio è stata caratterizzata da un diametro di 1,7 μm e una concentrazione di 0,2 × 109 particelle per millilitro10. La fiala di microbolle è stata attivata sulla base delle istruzioni di prescrizione fornite dal fornitore e di un rapporto precedentemente pubblicato11.
	<ol>
		<li>Preparare una siringa da 5 ml con punta luer lock e riempita con 5 ml di cloruro di sodio allo 0,9% senza additivi.</li>
		<li>Rimuovere il tappo verde e collegare la siringa al perno di erogazione ventilato (vedere la Tabella dei materiali) avvitandolo in senso orario.</li>
		<li>Rimuovere la protezione del perno e posizionarla al centro del tappo di gomma della fiala. Premere con decisione fino a quando la punta non è completamente inserita nel tappo.</li>
		<li>Svuotare l'intera siringa da 5 ml nel flaconcino spingendo l'asta dello stantuffo.</li>
		<li>Agitare energicamente la fiala per 20 s per mescolare tutto il contenuto. Un liquido bianco e lattiginoso consistente mostrerà che si sono formate microsfere lipidiche di esafluoruro di zolfo.</li>
		<li>Per ottenere la dose richiesta, capovolgere la siringa e prelevare lentamente il volume previsto della sospensione in una siringa da 5 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utilizzare una pompa per infusione. 
	NOTA: L'approccio all'infusione12 è stato utilizzato per erogare microbolle ai ratti utilizzando una pompa a siringa. Una siringa contenente microbolle è stata collegata a un connettore per catetere inserito nel ratto. Le microbolle sono state trasferite attraverso tubi in polietilene e la portata della pompa di infusione è stata impostata su 0,66 mL/min. Questa velocità di infusione consente l'iniezione di 2 mL di microbolle da una siringa da 3 mL nell'arco di 3 minuti. L'infusione è iniziata prima della sonicazione per 1 minuto ed è continuata per tutto il periodo di sonicazione di 2 minuti.</li>
	<li>Eseguire la sonicazione. 
	NOTA: In questo studio, gli impulsi FUS sono stati scelti con i seguenti parametri: (1) Regione target: ippocampo sinistro; (2) Numero di macchie: 6 per coprire l'ippocampo nel cervello; (3) Lunghezza burst: 10 ms; (4) Periodo di burst: 1200 ms; (5) Pressione acustica: 0,65 MPa; (6) 'Modalità burst' nel menu della modalità sonica nel sistema FUS; (7) Tempo di sonicazione: 120 s.</li>
</ol>
4. Procedura di risonanza magnetica con scanner preclinico 3T
<ol>
	<li>Dopo la sonicazione, trasferire gli animali su un tavolo in uno scanner preclinico 3T privo di criogeni.</li>
	<li>Posizionare i ratti in posizione prona. Mantenere la temperatura del termoforo nello scanner e monitorare la frequenza respiratoria utilizzando un sensore pneumatico a cuscino. Eseguire il protocollo MRI per testare vari tipi di imaging RM (Tabella 1).</li>
	<li>Includere altre tecniche di imaging quantitativo, come l'imaging pesato in diffusione (DWI), la mappatura T2*, la mappatura T1 e la risonanza magnetica con mezzo di contrasto dinamico (DCE), oltre alla risonanza magnetica con mezzo di contrasto, per dimostrare la sua potenziale praticità per diversi studi di imaging. Fare riferimento alla Tabella 1 per i protocolli di risonanza magnetica utilizzati in questo studio.</li>
	<li>Iniettare agenti di contrasto MRI basati su GAD (Gadavist, 1 mmol/kg) dopo la sequenza di eco del gradiente RM pesato in T1 e acquisire immagini post-GAD. 
	NOTA: Per un ratto di 200 g, abbiamo iniettato 200 μl di mezzo di contrasto per risonanza magnetica e li abbiamo seguiti con una soluzione salina da 200 μl per lavare il tubo.</li>
</ol>
5. Esame macroscopico del cervello di ratto
NOTA: Dopo la risonanza magnetica, sono stati iniettati 2 ml di soluzione blu di Evans (diluita al 2% con soluzione salina tamponata con fosfato) e il ratto è stato lasciato riposare per almeno 30 minuti per consentire alla soluzione di diffondersi e circolare in tutto il corpo. Successivamente, i ratti sono stati soppressi utilizzando un sovradosaggio di isoflurano (5%) per l'esame macroscopico del cervello (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Per confermare l'eutanasia, è stato necessario dare un pugno alle dita dei piedi e l'animale è stato osservato per la cessazione della respirazione per almeno 1 minuto. È stata eseguita la procedura di perfusione, seguita da un esame del cervello di ratto. La procedura di perfusione è riassunta come segue:
<ol>
	<li>Eseguire una toracotomia utilizzando una forbice chirurgica per esporre gli organi nel torace e visualizzare la regione cardiaca.</li>
	<li>Incidere (~5 mm) l'atrio destro.</li>
	<li>Introdurre una soluzione salina nel ventricolo sinistro per scopi di perfusione.</li>
	<li>Apri l'osso del cranio con una forbice chirurgica per svelare e presentare il cervello. 
	NOTA: Un'adeguata perfusione dovrebbe portare a un aspetto uniformemente luminoso del cervello, mentre le aree blu persistenti indicano una perdita di albumina associata alla BBB, come rilevato dal blu di Evans.</li>
</ol>

Enhancing Drug Delivery to the Brain: MRI-Guided Ultrasound Techniques in Rats

<ol><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (1), a020412(2015).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+focused+ultrasound+in+the+brain%3A+from+thermoablation+to+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Applications of focused ultrasound in the brain: from thermoablation to drug delivery.</a> Nat Rev Neurol. 17 (1), 7-22 (2021).</li>
<li>Mungur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-intensity+focused+ultrasound+technique+in+glioblastoma+multiforme+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Low-intensity focused ultrasound technique in glioblastoma multiforme treatment.</a> Frontiers in Oncology. 12, 903059(2022).</li>
<li>Boado, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+brain+uptake+of+a+genetically+engineered+bifunctional+fusion+antibody+targeting+the+mouse+transferrin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and brain uptake of a genetically engineered bifunctional fusion antibody targeting the mouse transferrin receptor.</a> Mol Pharm. 7 (1), 237-244 (2010).</li>
<li>Hendricks, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+delivery+methods+bypassing+the+blood-brain+and+blood-tumor+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+Focus%22%5BJournal%5D)">Novel delivery methods bypassing the blood-brain and blood-tumor barriers.</a> Neurosurgical Focus. 38 (3), E10(2015).</li>
<li>Hynynen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+MR+imaging-guided+focal+opening+of+the+blood-brain+barrier+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits.</a> Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).</li>
<li>Hynynen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+reversible+blood-brain+barrier+disruption+by+non-invasive+focused+ultrasound+at+frequencies+suitable+for+trans-skull+sonications%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Local and reversible blood-brain barrier disruption by non-invasive focused ultrasound at frequencies suitable for trans-skull sonications.</a> NeuroImage. 24 (1), 12-20 (2005).</li>
<li>Yao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive%2C+targeted+creation+of+neuromyelitis+optica+pathology+in+AQP4-IgG+seropositive+rats+by+pulsed+focused+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive, targeted creation of neuromyelitis optica pathology in AQP4-IgG seropositive rats by pulsed focused ultrasound.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 78 (1), 47-56 (2019).</li>
<li>Cecyn, M. N., Abrahao, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+do+you+measure+the+Bregma+for+rodent+stereotaxic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22IBRO+Neurosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Where do you measure the Bregma for rodent stereotaxic surgery.</a> IBRO Neurosci Rep. 15, 143-148 (2023).</li>
<li>Kotopoulis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SonoVue+vs.+Sonazoid+vs.+Optison%3A+Which+bubble+is+best+for+low-intensity+sonoporation+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">SonoVue vs. Sonazoid vs. Optison: Which bubble is best for low-intensity sonoporation of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 98(2022).</li>
<li>Bracco Diagnostics Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22LUMASON+%28sulfur+hexafluoride+lipid-type+A+microspheres%29+for+injectable+suspension%2C+for+intravenous+use+or+intravesical+use%22">LUMASON (sulfur hexafluoride lipid-type A microspheres) for injectable suspension, for intravenous use or intravesical use</a>. , Lumason - accessdata.fda.gov. (2016).</li>
<li>Lapin, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+opening+of+the+blood+brain+barrier+using+focused+ultrasound+with+constant+intravenous+infusion+of+microbubble+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Consistent opening of the blood brain barrier using focused ultrasound with constant intravenous infusion of microbubble agent.</a> Sci Rep. 10, 16546(2020).</li>
<li>Vlachos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+dependence+study+of+the+focused+ultrasound-induced+blood-brain+barrier+opening+at+distinct+pressures+and+microbubble+diameters+using+DCE-MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Permeability dependence study of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening at distinct pressures and microbubble diameters using DCE-MRI.</a> Magn Reson Med. 66 (3), 821-830 (2011).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+all-ultrasound+cranial+imaging+method+to+establish+the+relationship+between+cranial+FUS+incidence+angle+and+transcranial+attenuation+in+non-human+primates+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An all-ultrasound cranial imaging method to establish the relationship between cranial FUS incidence angle and transcranial attenuation in non-human primates in 3D.</a> Sci Rep. 14 (1), 1488(2024).</li>
<li>Plaksin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+analysis+predicts+nanoparticle+concentration+delivered+to+the+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging analysis predicts nanoparticle concentration delivered to the brain parenchyma.</a> Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).</li>
<li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+and+monitoring+focused+ultrasound+mediated+blood-brain+barrier+opening+in+rats+using+power+Doppler+imaging+and+passive+acoustic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Guiding and monitoring focused ultrasound mediated blood-brain barrier opening in rats using power Doppler imaging and passive acoustic mapping.</a> Sci Rep. 12 (1), 14758(2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse rilevanti da dichiarare.

Sono stati sviluppati un protocollo e una procedura animale che utilizzano un modello di ratto di cateterismo della vena giugulare per studi di apertura della BEE. Sebbene esistano numerosi protocolli preclinici, questo protocollo incorpora un sistema FUS disponibile in commercio e un modello di ratto, riducendo al minimo le procedure di preparazione degli animali e garantendo così la riproducibilità sperimentale.
In questo protocollo, la selezione delle microbolle si basava sulla sua stabilità e sulla conservazione a temperatura ambiente. Altre microbolle commerciali possono essere prese in considerazione come alternative. Kotopoulis et al. hanno studiato e confrontato vari tipi di microbolle per la sonoporazione a bassa intensità dei tumori del pancreas10. Sulla base dei risultati in vitro , la microbolla selezionata in questo studio è risultata essere la formulazione ottimale a intensità più basse, mentre altre microbolle erano più efficaci a intensità più elevate. Tuttavia, le microbolle più adatte per aprire la BBB in un modello di ratto rimangono poco chiare. Vlachos et al.13 hanno studiato gli effetti della pressione acustica e della dimensione delle microbolle sul volume dell'apertura della BBB e sul danno tissutale, come la rottura vascolare e l'edema. Il protocollo suggerito incoraggia studi futuri per indagare e identificare le microbolle e i parametri di sonicazione più adatti per l'uso in un modello di ratto.
In questo studio, il sistema FUS preclinico è stato selezionato per le sue capacità rapide e precise per il targeting multipunto. Il sistema è programmato per attraversare automaticamente punti focali predefiniti, una funzione che facilita la sonicazione regionale diretta all'area tissutale mirata. In alternativa, i trasduttori a ultrasuoni focalizzati (FUS) consolidati, come quelli offerti da Sonic Concepts ed ExAblate Neuro (vedi Tabella dei materiali), possono essere impiegati per aprire la barriera emato-encefalica14,15. In particolare, il trasduttore ExAblate Neuro è progettato per essere compatibile con l'imaging RM, fornendo una guida e un monitoraggio in tempo reale del processo di trattamento. In futuro, questi trasduttori potranno essere integrati nel protocollo sviluppato.
Il protocollo MRI proposto incorpora varie sequenze MRI per dimostrare la sua potenziale praticità per diversi studi di imaging. Si raccomandano sequenze di eco gradiente pesate in T1 pre e post-contrasto e sequenze di eco di spin pesate in T2 per catturare le variazioni di intensità del segnale indotte dagli agenti di contrasto MRI dalla perdita di BEE. Gli utenti hanno la possibilità di includere la mappatura DWI, DCE e T2* nel proprio protocollo di imaging. In alternativa all'utilizzo di uno scanner MRI, Singh et al.16 hanno introdotto metodi che utilizzano l'imaging a ultrasuoni Doppler per la localizzazione focale e la mappatura acustica passiva per rilevare la cavitazione delle microbolle, che è correlata alle regioni aperte dalla BBB. Pertanto, questo protocollo promette di essere implementato all'interno di un sistema completamente ecografico, presentando una potenziale alternativa.
In questo studio è stato impiegato l'approccio dell'infusione12 , che si riferisce all'infusione durante la sonicazione. Poiché questo approccio fornisce continuamente microbolle al cervello, può portare a un'apertura più stabile e coerente della BBB rispetto all'infusione in bolo. Lapin et al.12 hanno studiato il confronto tra gli approcci dell'infusione e del bolo per un'apertura costante della BBB, scoprendo che una velocità di 7,2 μL di microbolle di Definity/kg/min o inferiore potrebbe aprire la BBB senza lesioni a vari livelli di pressione. Tuttavia, questo approccio può avere una potenziale limitazione nel mantenere nel tempo la concentrazione di microbolle all'interno della siringa. Le microbolle possono tendere a galleggiare e ad aggregarsi nella parte superiore della siringa, causando probabilmente una diminuzione della dose di microbolle. In alternativa, l'iniezione in bolo di microbolle può essere condotta nel seno retroorbitale. Gli studi futuri che utilizzano il protocollo proposto dovrebbero esplorare i confronti con diversi metodi e tipi di infusione di microbolle per ottimizzare l'apertura della BBB in un modello di ratto.
Il limite di questo studio è l'assenza di convalida istochimica per danni macroscopici, come i risultati di colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) o cristallovioletto. Tuttavia, il protocollo proposto può essere utilizzato per ottimizzare i parametri di sonicazione e risonanza magnetica per evitare danni macroscopici nel cervello. Inoltre, le procedure per l'analisi istopatologica possono essere incorporate in studi futuri per affrontare questa limitazione.

La BBB regola il movimento di ioni, molecole e cellule tra i vasi sanguigni e i tessuti cerebrali1. Questa funzione consente il mantenimento della funzione neuronale e della salute, impedendo la somministrazione di agenti macromolecolari terapeutici ai tessuti cerebrali. La limitata permeabilità della BBB può comportare una diminuzione dell'efficacia e dell'efficacia dei trattamenti per i tumori cerebrali e le malattie neurodegenerative, come il morbo di Parkinson, la sclerosi laterale amiotrofica e il morbo di Alzheimer2. Pertanto, sono stati studiati vari approcci, come la somministrazione potenziata dalla convezione, le iniezioni intracraniche dirette, l'interruzione osmotica e la progettazione di farmaci potenziati, per bypassare la BBB per la somministrazione controllata di agenti terapeutici3,4,5.
Tuttavia, questi approcci hanno limitazioni intrinseche come l'invasività, il rischio di infezione, il rischio di emorragia, l'eterogeneità e il rapido afflusso di farmaci. L'ecografia focalizzata pulsata a bassa intensità (FUS) con l'iniezione di microbolle è una tecnica promettente e non invasiva che consente l'interruzione localizzata e reversibile della BBB. Gli effetti meccanici degli ultrasuoni accoppiati con le microbolle possono alterare transitoriamente la permeabilità della BBB (cioè l'apertura della BBB)6,7. Per ulteriori progressi nelle applicazioni di trattamento che utilizzano l'apertura della BEE, sono essenziali esperimenti in vivo su piccoli animali.
In questo studio, abbiamo introdotto protocolli di risonanza magnetica e procedure animali per monitorare l'apertura della BBB in un modello di ratto. Il protocollo includeva un modello di ratto con un catetere della vena giugulare incannulato da un'organizzazione commerciale (vedi Tabella dei materiali). Un modello di ratto di cateterismo della vena giugulare presenta i potenziali benefici della somministrazione rapida di farmaci, dei test di monitoraggio emodinamico e del cateterismo stabile. L'apertura della BBB è stata realizzata utilizzando un sistema FUS preclinico. Progettato specificamente per l'apertura della BBB in modelli di piccoli animali come ratti e topi, questo sistema incorpora componenti essenziali, come un sistema da banco, un computer di controllo, un trasduttore, un degasatore dell'acqua e gli accessori di accompagnamento. L'uso di questo sistema FUS preclinico a guida stereotassica non solo migliora la precisione, ma semplifica anche le procedure animali e i protocolli di risonanza magnetica, contribuendo alla riproducibilità e alla semplicità del protocollo sperimentale complessivo.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>BD plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 mL, cloruro di sodio 0,9%</td><td>Hospira, Inc</td><td>00409-7101-67</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 3 mL siringa</td><td>BD plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL BD</td><td>plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago smussato, 21 G</td><td>SAI tecnologie di infusione</td><td>B21-50</td><td></td></tr><tr><td>Connettore catetere, 21 G</td><td>SAI per infusione tecnologie</td><td>CC-25-25</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blocco del catetere</td><td>SAI Tecnologie di infusione</td><td>Sku # HGS-10</td><td>(500 &micro;/mL) Glicerolo</td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma aldrich</td><td>E2129-10g</td><td></td></tr><tr><td>ExAblate Neuro</td><td>Insightec Inc., Israele</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gadavist</td><td>Bayer 2068062</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE&nbsp; Vaporizzatore di isoflurano</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPS-12RS Pompa a siringa</td><td>Inovenso</td><td>IPS-12</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano USP</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Lumason microbbuble</td><td>Bracco Diagnostics Inc</td><td>SKJ709700</td><td></td></tr><tr><td>ratti maschi Sprague-Dawley (200... 250 g)&nbsp;</td><td>Ago Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 18 G</td><td>BD Precisionglide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Mediatech</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene</td><td>BD Intramedic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>scanner Bruker Biospin preclinico 3T criogeno gratuito.</td><td>Bruker</td><td>Biospec3T</td><td></td></tr><tr><td>Rat con cateterismo della vena giugulare</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore a ultrasuoni focalizzato RK-50&nbsp;</td><td>FUS Instruments</td><td>Tx-50-1000-0</td><td></td></tr><tr><td>RK-50 sistema a ultrasuoni focalizzato da banco</td><td>FUS Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic Concepts</td><td>Sonic Concepts Inc., WA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spillo di erogazione ventilato&nbsp;</td><td>B Braun</td><td>4550560</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio dell'apertura della barriera emato-encefalica nei ratti con un sistema ecografico focalizzato preclinico

Monitoring Blood-Brain Barrier Opening in Rats with a Preclinical Focused Ultrasound System

Il cervello ha una barriera sanguigna semipermeabile altamente selettiva, chiamata barriera emato-encefalica (BBB), che impedisce la somministrazione di agenti macromolecolari terapeutici al cervello. L'integrazione degli ultrasuoni focalizzati pulsati a bassa intensità (FUS) guidati dalla risonanza magnetica con la pre-iniezione di microbolle è una tecnica promettente per la modulazione della BBB non invasiva e non tossica. La risonanza magnetica può offrire un contrasto superiore dei tessuti molli e varie valutazioni quantitative, come la permeabilità vascolare, la perfusione e la distribuzione spazio-temporale degli agenti di contrasto MRI. In particolare, le tecniche di risonanza magnetica con mezzo di contrasto a base di gadolinio hanno dimostrato di essere il gold standard per rilevare le aperture della BEE. Questo studio delinea una metodologia completa che coinvolge protocolli di risonanza magnetica e procedure animali per il monitoraggio dell'apertura della BBB in un modello di ratto. Il modello di ratto offre l'ulteriore vantaggio dell'utilizzo del catetere della vena giugulare, che facilita la somministrazione rapida dei farmaci. Un trasduttore FUS preclinico a guida stereotassica facilita il perfezionamento e la semplificazione delle procedure sugli animali e dei protocolli MRI. I metodi risultanti sono caratterizzati da riproducibilità e semplicità, eliminando la necessità di competenze chirurgiche specializzate. Questa ricerca si propone di contribuire all'ottimizzazione delle procedure precliniche con modelli di ratto e di incoraggiare ulteriori indagini sulla modulazione della BBB per migliorare gli interventi terapeutici nei disturbi neurologici.

Questo studio presenta un protocollo preclinico per il monitoraggio dell'apertura della barriera ematoencefalica in un modello ratto mediante l'utilizzo di un sistema FUS commerciale per animali. Il sistema FUS è stato posizionato su un banco o su un carrello di grandi dimensioni (Figura 1). I ratti sono stati anestetizzati con isoflurano mescolato con ossigeno attraverso un cono nasale montato sul telaio dotato di supporto per il trasduttore. Un idrofono risonante a 500 kHz, utilizzato per rilevare la cavitazione acustica, è stato inserito all'interno del trasduttore FUS con una frequenza risonante di 1,0 MHz.
Come mostrato in Figura 2, il sistema FUS include impostazioni di sonificazione e la capacità di regolare le posizioni bersaglio. Deve essere eseguito un "test di movimento" per assicurare che il trasduttore possa traslare tra punti diversi all'interno di un periodo di burst.
Quando la BBE viene aperta, le molecole di GAD e del blu di Evans attraversano la BBE. L'immagine RM pesata in T1 ha rilevato le alterazioni indotte dal GAD nell'intensità del segnale RM (Figura 3A). Dopo la procedura di perfusione, il tessuto colorato con il blu di Evans era direttamente visibile (Figura 3B).
Sono stati condotti esperimenti su tre ratti per dimostrare la riproducibilità dell'apertura della barriera emato-encefalica (BBBO). Figura 4A mostra le immagini ponderate in T1 con eco di gradiente dopo la sonificazione e la somministrazione di GAD. È stato osservato un aumento significativo dell'intensità del segnale in risonanza magnetica nel sito bersaglio in tutti e tre gli esperimenti. Le immagini DCE-MR hanno indicato che la variazione più significativa dell'intensità del segnale si è verificata 7-8 minuti dopo il bolo dell'agente di contrasto per risonanza magnetica (Figura 4B). Le sequenze ponderate in T1 con eco di gradiente e ponderate in T2 con eco di spin hanno chiaramente mostrato una regione di apertura della barriera emato-encefalica, mentre nessuna variazione significativa è stata osservata nella mappa T1 prima della somministrazione di GAD (Figura 4C).
I protocolli sugli animali e di risonanza magnetica proposti in questo studio dimostrano la fattibilità di condurre studi di imaging mediante risonanza magnetica utilizzando un modello ratto con cateterizzazione della vena giugulare. L'imaging di perfusione mediante risonanza magnetica e/o l'imaging tensoriale di diffusione possono essere integrati nel protocollo per indagare un nuovo biomarcatore di risonanza magnetica per rilevare l'apertura della barriera ematoencefalica.
<img alt="Impostazione sperimentale per l'imaging mediante ultrasuoni; comprende un trasduttore da 1 MHz, un oscilloscopio, un supporto per ratto e altro ancora." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Sistema FUS preclinico da banco e posizionamento del ratto. (A) Sistema FUS preclinico da banco. (B) Posizionamento del ratto all'interno del sistema. (C) Trasduttore da 1 MHz e idrofono, con l'idrofono posizionato al centro del trasduttore FUS. (D) Posizionamento del trasduttore e del contenitore per l'accoppiamento con acqua sulla testa del ratto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig01large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Visualizzazione dei parametri della sonificazione e localizzazione delle aree tramite MRI per l'analisi del targeting con ultrasuoni focalizzati." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Interfaccia utente del software del sistema FUS preclinico. L'interfaccia utente del software del sistema FUS preclinico consente la modifica delle impostazioni della sonificazione e delle posizioni del bersaglio. Prima di avviare la sonificazione, è necessario eseguire il "test del movimento" per verificare che il trasduttore possa spostarsi tra le aree all'interno di un periodo di burst. Questa funzione misura il tempo di movimento del trasduttore tra le aree senza effettuare la sonificazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig02large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Sezioni cerebrali coronali e assiali con campioni reali di R1 e R2 per l'analisi comparativa dell'anatomia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Immagini pesate in T1 post-GAD e regioni cerebrali dopo l'apertura della BEE. (A) Immagine pesata in T1 post-GAD e (B) fotografia del cervello di ratto dopo l'apertura della BEE. Le etichette R1 e R2 in (A) corrispondono alle regioni mostrate in (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig03large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Risonanza magnetica con mezzo di contrasto dinamico; imaging del cervello di ratto; intensità del segnale; pesatura T1, T2, mappatura T1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66793/66793fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Imaging RM dopo sonificazione e iniezione di GAD. (A) Immagini RM pesate in T1 di tre ratti dopo sonificazione e iniezione di GAD. (B) Risonanza magnetica con mezzo di contrasto dinamico (DCE-MRI) del Ratto n. 3, che illustra le variazioni temporali dell'intensità del segnale. L'agente di contrasto per RM a base di GAD è stato iniettato nel punto temporale indicato dalla freccia rossa. (C) Immagini RM pesate in T1, pesate in T2 e mappe di T1 del Ratto n. 3, acquisite prima dell'iniezione del mezzo di contrasto GAD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66793/66793fig04large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>DWI 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Mappa T1 Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>DCE Cor 2D (Bolo 1)</td>
			<td>Cor 2D</td>
			<td>Cor 2D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mappa R2*</td>
			<td></td>
			<td>FLASH pre</td>
			<td>RARE pre</td>
			<td></td>
			<td>FLASH post</td>
			<td>RARE post</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequenza</td>
			<td>EPI</td>
			<td>GRE</td>
			<td>TSE</td>
			<td>GRE</td>
			<td>TSE</td>
			<td>GRE</td>
			<td>GRE</td>
			<td>TSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TR</td>
			<td>2100 ms</td>
			<td>500 ms</td>
			<td>2400, 1600, 1100, 800, 450, 300 ms</td>
			<td>30 ms</td>
			<td>2000 ms</td>
			<td>39.3 ms</td>
			<td>30 ms</td>
			<td>1500 ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE</td>
			<td>22.1 ms</td>
			<td>12 echi;</td>
			<td>10.29 ms</td>
			<td>5.1 ms</td>
			<td>65 ms</td>
			<td>2.9 ms</td>
			<td>5.1 ms</td>
			<td>65 ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3 - 47 ms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spessore</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
			<td>1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campo di vista</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
			<td>40 x 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrice</td>
			<td>192</td>
			<td>192</td>
			<td>192</td>
			<td>256</td>
			<td>192</td>
			<td>128</td>
			<td>256</td>
			<td>192</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA (gradi)</td>
			<td>90</td>
			<td>60</td>
			<td>90/180</td>
			<td>20</td>
			<td>90/180</td>
			<td>12</td>
			<td>20</td>
			<td>45/180</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Numero di fette</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempo di acquisizione</td>
			<td>4 min 12 s</td>
			<td>3 min 12 s</td>
			<td>10 min 38 s</td>
			<td>2 min 9 s</td>
			<td>1 min 52 s</td>
			<td>8 min 23 s</td>
			<td>3 min 52 s</td>
			<td>1 min 24 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opzioni</td>
			<td>Segmento 12, 3 direzioni, b = 0, 54, 180, 522 s/mm2</td>
			<td>Numero di medie = 2, intervallo tra eco = 4 ms</td>
			<td>Intervallo tra eco 10,3 ms, fattore RARA 2</td>
			<td></td>
			<td>Fattore RARE 10, medie 4</td>
			<td>200 µL di agente (Gadavist, 1 mmol/kg)</td>
			<td></td>
			<td>Fattore RARE 10, medie 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>per ratto di 200 g, 1 min pre, 7 min post, iniettare 200 µL/min, flash di 200 µL di soluzione salina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Protocollo preclinico di risonanza magnetica sullo scanner MRI a 3T.

Questo studio descrive un protocollo combinato di risonanza magnetica (MRI) e ultrasuoni focalizzati pulsati a bassa intensità (FUS), utilizzando ratti vivi con cateterismo della vena giugulare per monitorare l'apertura della barriera emato-encefalica (BEE).

Monitoraggio dell'apertura della barriera emato-encefalica nei ratti con un sistema ecografico focalizzato preclinico

The brain has a highly selective semipermeable blood barrier, termed the blood-brain barrier (BBB), which prevents the delivery of therapeutic ...

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