Name: Isolamento e crioconservazione di cellule mononucleate del sangue periferico umano altamente vitali da sangue intero: una guida per principianti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Impara a isolare e crioconservare cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da sangue intero con alta vitalità. Questo protocollo dettagliato include anche la raccolta di plasma EDTA e buffy coat per analisi immunologiche.

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<ol><li>Mathew, J., Sankar, P., Varacallo, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMathew%2C+J+%22Physiology%2C+Blood+Plasma%22">Physiology, Blood Plasma</a>. , StatPearls Pubs. Treasure Island, Florida. (2018).</li>
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<li>Pelák, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+enrichment+using+CD81-targeted+immunoaffinity+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte enrichment using CD81-targeted immunoaffinity matrix.</a> Cytometry Part A. 91 (1), 62-72 (2017).</li>
<li>Higdon, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+in-depth+immunophenotyping+of+delay+to+peripheral+blood+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact on in-depth immunophenotyping of delay to peripheral blood processing.</a> Clin Exp Immunol. 217 (2), 119-132 (2024).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+aptamer-CRISPR+nanodevice+enables+precise+profiling+of+interferon-gamma+release+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable aptamer-CRISPR nanodevice enables precise profiling of interferon-gamma release in humanized mice.</a> ACS Nano. 18 (4), 3826-3838 (2024).</li>
<li>Ren, Z., Li, C., Wang, J., Sui, J., Ma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+revealed+dysregulated+RNA-binding+protein+expression+patterns+and+functions+in+human+ankylosing+spondylitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome revealed dysregulated RNA-binding protein expression patterns and functions in human ankylosing spondylitis.</a> Front Med. 11, 1369341(2024).</li>
<li>Honardoost, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+immune+cell+dysregulation+and+molecular+subtypes+revealed+by+single-cell-RNA-seq+of+subjects+with+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Systematic immune cell dysregulation and molecular subtypes revealed by single-cell-RNA-seq of subjects with type 1 diabetes.</a> Genome Med. 16, 45(2024).</li>
<li>Amini, A., Esmaeili, F., Golpich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+role+of+lncRNAs+in+amelioration+of+Parkinson%27s+disease+symptoms+by+transplantation+of+dopaminergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Possible role of lncRNAs in amelioration of Parkinson's disease symptoms by transplantation of dopaminergic cells.</a> NPJ Parkinsons Dis. 10, 56(2024).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sars-Cov-2+spike+induces+intestinal+barrier+dysfunction+through+the+interaction+between+CEACAM5+and+Galectin-9%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sars-Cov-2 spike induces intestinal barrier dysfunction through the interaction between CEACAM5 and Galectin-9.</a> Front Immunol. 15, e1303356(2024).</li>
<li>Zhang, X., Wu, G., Ma, X., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+alterations+and+PI3k-PKB+pathway+suppression+in+patients+with+allergic+rhinitis+undergoing+sublingual+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune cell alterations and PI3k-PKB pathway suppression in patients with allergic rhinitis undergoing sublingual immunotherapy.</a> Adv Ther. 41 (2), 777-791 (2024).</li>
<li>Rucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+mitochondrial+DNA+copy+number+in+circulating+cell-free+DNA+and+extracellular+vesicles+across+cardiovascular+health+status%3A+A+prospective+case-control+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Exploring mitochondrial DNA copy number in circulating cell-free DNA and extracellular vesicles across cardiovascular health status: A prospective case-control pilot study.</a> FASEB J. 38 (10), e23672(2024).</li>
<li>Ghamrawi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buffy+coat+DNA+Methylation+Profile+is+Representative+of+Methylation+Patterns+in+White+Blood+Cell+Types+in+Normal+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Buffy coat DNA Methylation Profile is Representative of Methylation Patterns in White Blood Cell Types in Normal Pregnancy.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, e782843(2022).</li>
<li>Johansson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+biomarker+profiles+in+autosomal+dominant+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Plasma biomarker profiles in autosomal dominant Alzheimer's disease.</a> Brain. 146 (3), 1132-1140 (2023).</li>
<li>Bonaterra-Pastra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+plasma+lipoprotein+composition+and+function+in+cerebral+amyloid+angiopathy+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Comparison of plasma lipoprotein composition and function in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease.</a> Biomedicines. 9 (1), 72(2021).</li>
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<li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield+but+severely+compromise+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield but severely compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li>
<li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 85 (1), 7.1.1-7.1.8 (2009).</li>
<li>Faass, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+heptose+metabolites+and+the+cag+pathogenicity+island+to+the+activation+of+monocytes%2Fmacrophages+by+Helicobacter+Pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of heptose metabolites and the cag pathogenicity island to the activation of monocytes/macrophages by Helicobacter Pylori.</a> Front Immunol. 12, e632154(2021).</li>
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<li>Chao, S. -H., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavopiridol+inactivates+P-TEFb+and+blocks+most+RNA+polymerase+II+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+of+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Flavopiridol inactivates P-TEFb and blocks most RNA polymerase II transcription in vivo.</a> J of Biol Chem. 276 (34), 31793-31799 (2001).</li>
<li>Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ethylenediamine+tetraacetic+acid+%28EDTA%29+as+in+vitro+anticoagulant+for+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes.</a> Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).</li>
<li>Mohri, M., Rezapoor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heparin%2C+citrate%2C+and+EDTA+on+plasma+biochemistry+of+sheep%3A+Comparison+with+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of heparin, citrate, and EDTA on plasma biochemistry of sheep: Comparison with serum.</a> Res Vet Sci. 86 (1), 111-114 (2009).</li>
<li>Edwards, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-mediated+PCR+interference+in+SARS-CoV-2+assays+and+subsequent+reversal+with+heparinase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Heparin-mediated PCR interference in SARS-CoV-2 assays and subsequent reversal with heparinase I.</a> J Virol Methods. 327, 114944(2024).</li>
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<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+long-term+cryopreservation+of+pluripotent+stem+cells+at+-80+%C2%A0%C2%B0C%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at -80  °C.</a> Sci Rep. 6 (1), 34476(2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1000 &micro; L Tips</td><td>Gilson</td><td>F174501</td><td>Sono necessari circa 3 puntali per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Provetta da 15 mL</td><td>Biopioneeer</td><td>CNT-15</td><td>Per contenere Soluzioni 2/3 2 necessarie per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>2 mL Cryovials</td><td>Globe Scientific</td><td>3012</td><td>Sono necessari circa 40 crioviali per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>20 &micro; L Tips</td><td>Gilson</td><td>F174201</td><td>Per l'uso nel conteggio delle cellule; il volume necessario dipende dal metodo di conteggio delle cellule utilizzato. È necessario 1 puntale per 1 mL di PBMC congelate non raggruppate da scongelare</td></tr><tr><td>50 mL di provetta conica</td><td>CEM Corporation</td><td>50-187-7683</td><td>2 necessarie per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection 3 necessarie per 1 mL di PBMC congelate non raggruppate da scongelare</td></tr><tr><td>Anticorpo CD14</td><td>Biolegend</td><td>325621</td><td></td></tr><tr><td>CD16 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>360723</td><td></td></tr><tr><td>CD19 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>363007</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>300405</td><td></td></tr><tr><td>CD56 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>318303</td><td></td></tr><tr><td>CD66b Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Biopioneeer</td><td>DGN258367</td><td>1 necessario per 1 mL di PBMC congelati non raggruppati da scongelare</td></tr><tr><td>Tubo per la preparazione delle cellule mononucleate CPT</td><td>BD Biosciences</td><td>362753</td><td>6 provette necessarie per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Cryo Freezer Box</td><td>Southern Labware</td><td>SB2CC-81</td><td>Contiene 81 provette 1 necessario per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Cryotube Rack</td><td>Fisherbrand</td><td>05-669-45</td><td>Contiene fino a 50 crioviali</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>Circa 2,5 mL necessari per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Acqua distillata priva di DNasi/RNasi</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td>Circa 2 mL necessari per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Circa 9 mL necessari per 1 mL di PBMC congelati da scongelare</td></tr><tr><td>Provette EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td>necessaria 1 provetta per paziente/condizione di trattamento per la collezione PBMC/Plasma/Buffy Coat</td></tr><tr><td>Flavopiridol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3055-5MG</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR Antibody</td><td>Biolegend</td><td>307609</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica umana</td><td>GeminiBio</td><td>800-120</td><td>Sono necessari circa 25 ml per paziente o condizione di trattamento per la collezione PBMC/Plasma/Buffy Coat</td></tr><tr><td>Human Trustain FcX</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292912-1KG-K</td><td>Per l'uso nella stampante per etichette Mr. Frosty</td></tr><tr><td></td><td>Phomemo</td><td>M110-WH</td><td></td></tr><tr><td>Macchia viva</td> morta <td>Biolegend</td><td>423105</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Può contenere fino a 18 tubi. Sono necessari 2 Mr. Frostys per paziente/condizione di trattamento per la pipetta Multidispense per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td></td><td>Brandtech</td><td>705110</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette Multidispense</td><td>Brandtech</td><td>705744</td><td>Sono necessari circa 3 puntali per paziente/condizione di trattamento per la pipetta PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>P1000</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta P20</td><td>Gilson</td><td>F144056M</td><td>Per l'uso nel conteggio delle cellule; il volume necessario dipende dal metodo di conteggio delle cellule utilizzato.</td></tr><tr><td>Etichette per stampanti</td><td>Phomemo</td><td>PM-M110-3020</td><td>Sono necessarie circa 45 etichette per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection Sono necessarie circa 5 etichette per 1 mL di PBMC congelate non raggruppate da scongelare EDTA</td></tr><tr><td>senza RNasi (0,5 M)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>Circa 40 &micro; L necessario per 1 mL di PBMC congelate da scongelare</td></tr><tr><td>PBS senza RNasi (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>Circa 1 mL necessario per 1 mL di PBMC congelate da scongelare</td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>Circa 80 mL necessari per paziente o condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat Collection</td></tr><tr><td>Transfer Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td>Circa 5 necessari per paziente/condizione di trattamento per PBMC/Plasma/Buffy Coat</td></tr><tr><td>Supporto per provette</td><td>di raccolta Endicott-Seymour</td><td>14-781-15</td><td>Contiene fino a 80 provette CPT/EDTA</td></tr></tbody></table>

isolamento e crioconservazione di cellule mononucleate del sangue periferico umano altamente vitali da sangue intero: una guida per principianti

Isolation and Cryopreservation of Highly Viable Human Peripheral Blood Mononuclear Cells From Whole Blood: A Guide for Beginners

Dopo la raccolta e la crioconservazione delle PBMC, la vitalità di PBMC, monociti e linfociti scongelati da 56 campioni unici è stata valutata mediante citometria a flusso utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 4 seguendo le istruzioni del produttore (Figura 2A-F). È stata raggiunta una vitalità media ± SD di PBMC, monociti e linfociti rispettivamente del 94 ± del 4,0%, del 98 ± dell'1,1% e del 93 ± del 5,6% (Figura 2G). La misurazione della vitalità mediante esclusione del blu di tripano ha prodotto una vitalità media di 88 ± 7,5% e una conta cellulare di 2,3 x 106 ± 1,9 x 106. L'analisi della citometria a flusso ha anche dimostrato che i monociti vivi costituivano il 17-± il 5,9% e i linfociti costituivano il 53-± il 13,0% del totale delle PBMC.
Successivamente, i monociti sono stati selezionati da PBMC scongelati da 59 campioni unici mediante citometria a flusso e inviati per la preparazione della libreria e il sequenziamento dell'RNA come descritto altrove24. Un numero medio di sequenze SD ± totali di 18,0 ± 16,3 milioni è stato raggiunto con un allineamento di lettura di 93 ± 6,3% e un contenuto di GC di 49,6 ± 1,4% (Figura 3A-B). È stata trovata una percentuale media di letture mappate in modo univoco ± SD dell'88 ± del 3,6% con un sottoinsieme di 56 campioni unici. Questi parametri dimostrano che le PBMC altamente valide adatte alle applicazioni a valle, compreso il sequenziamento dell'RNA di alta qualità, possono essere ottenute da operatori con qualsiasi livello di formazione di laboratorio utilizzando questo protocollo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componente</td>
			<td>Densità</td>
			<td>Citazione</td>
		</tr><tr><td>Plasma</td>
			<td>da 1,022 g/mL a 1,026 g/mL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Piastrine</td>
			<td>da &lt;1,061 g/mL a &gt;1,070 g/mL</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>PBMC</td>
			<td>&lt;1,077 g/mL</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Neutrofili a bassa densità*</td>
			<td>&lt;1,077 g/mL</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>Granulociti (neutrofili*, basofili ed eosinofili)</td>
			<td>&gt;1,077 g/mL</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Eritrociti</td>
			<td>1,11 g/mL</td>
			<td>4</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Componenti del sangue intero elencati in ordine decrescente di densità. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagant/Materiale</td>
			<td>Quantità (per 6 provette CPT e 1 provetta EDTA)</td>
			<td colspan="5">Mancia</td>
			<td colspan="3">Avvertenze</td>
		</tr><tr><td>Tubi CPT</td>
			<td>6</td>
			<td colspan="5">Etichetta in base all'ID del paziente o del campione.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Tubo EDTA</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">Etichetta in base all'ID del paziente o del campione.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">Oltre all'ID del paziente o del campione, etichettare 1 provetta per le PBMC e 1 per i rifiuti.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Criovali</td>
			<td>39</td>
			<td colspan="5">Etichetta 30 per PBMC, 8 per plasma EDTA e 1 per buffy coat. Non tutti i crioviali possono essere utilizzati.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Il signor Frosty</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">Riempire fino a metà con isopropanolo e pre-raffreddare per una notte a -20°C.</td>
			<td colspan="3">L'isopropanolo è un irritante infiammabile. Tenere lontano da scintille/fiamme. Evitare di inalare e maneggiare con guanti e cura.</td>
		</tr><tr><td>Flavopiridolo</td>
			<td>100 μL di stock 1000X</td>
			<td colspan="5">Per preparare 1000X stock di flavopiridol, sospendere 5 mg di flavopiridol in 1,14 mL di DMSO per una concentrazione di 10 mM. Aliquotare 200 μl in contenitori individuali, quindi congelare. Per l'uso, scongelare le singole aliquote e diluire 1:10 in acqua distillata priva di DNasi/RNasi, quindi utilizzare come soluzione 1000X.</td>
			<td colspan="3">Il flavopiridolo è un irritante. Maneggiare con i guanti e curare.</td>
		</tr><tr><td>Soluzione 1</td>
			<td>50 ml</td>
			<td colspan="5">RPMI Medio. Per preparare 50 mL di soluzione madre, utilizzare 50 mL di RPMI Medium.</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td>Soluzione 2</td>
			<td>15 ml</td>
			<td colspan="5">RPMI Medium + 12,5% Albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridol. Per preparare 50 mL di soluzione madre, utilizzare 25 mL di terreno RPMI + 25 mL di albumina sierica umana + 50 μL di 1000X Flavopiridol.</td>
			<td colspan="3">Il flavopiridolo è un irritante. Maneggiare con i guanti e curare.</td>
		</tr><tr><td>Soluzione 3</td>
			<td>15 ml</td>
			<td colspan="5">RPMI Medium + 11,25% albumina sierica umana + 1 μM di flavopiridolo + 10% DMSO. Per preparare 50 mL di soluzione madre, utilizzare 22,5 mL di terreno RPMI + 22,5 mL di HSA + 5 mL di DMSO + 50 μL di 1000X Flavopiridol.</td>
			<td colspan="3">Il flavopiridolo è un irritante e il DMSO è tossico e viene facilmente assorbito attraverso la pelle. Maneggiare con i guanti e curare.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Lista di controllo dei reagenti e dei materiali da preparare ed etichettare per la raccolta e la crioconservazione delle PBMC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagant/Materiale</td>
			<td>Quantità (per 1 ml di aliquota di PBMC congelati)</td>
			<td colspan="2">Mancia</td>
			<td>Avvertenze</td>
		</tr><tr><td>Soluzione 4</td>
			<td>10 ml</td>
			<td colspan="2">PBS + 2 mM EDTA Per preparare 50 mL di soluzione madre, utilizzare 5 mL di PBS 10X + 200 μL di EDTA 0,5M + 44,8 mL di acqua distillata priva di DNasi/RNasi</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">Oltre all'ID del paziente o del campione, etichettare 1 provetta per le PBMC pre-filtrate, 1 per le PBMC post-filtrate e 1 per i rifiuti. Riempire la provetta etichettata per PBMC precolorate con 9 mL di soluzione 4 per mL di PBMC congelate</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Provetta da 1,5 mL</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">Per il conteggio delle cellule; etichetta con ID paziente o campione</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Soluzione di Trypan Blue allo 0,4%</td>
			<td>20 μl</td>
			<td colspan="2">Per il conteggio delle cellule; può essere aggiunto alla provetta da 1,5 ml in anticipo il giorno prima.</td>
			<td>Il blu di tripano è un agente cancerogeno. Maneggiare con i guanti e curare.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Lista di controllo dei reagenti e dei materiali da preparare ed etichettare per lo scongelamento e il conteggio dei PBMC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente/Materiale</td>
			<td>Quantità (per milione di celle)</td>
		</tr><tr><td>Macchia di morte viva</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Fiducia Umana FcX</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Anticorpo CD3</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Anticorpo CD19</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Anticorpo CD56</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Anticorpo CD66b</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Anticorpo HLA-DR</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Anticorpo CD14</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr><tr><td>Anticorpo CD16</td>
			<td>2,5 μl</td>
		</tr><tr><td>RNAsina</td>
			<td>100 Unità</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 4: Tabella dei reagenti per l'isolamento dei monociti dalle PBMC mediante citometria a flusso.
<img alt="Diagramma di separazione dei componenti del sangue in centrifugazione a gradiente di densità; plasma, PBMCs, strati di buffy coat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Componenti del sangue intero separati mediante centrifugazione in centrifugazione a gradiente di densità o provette con EDTA. (A) La centrifugazione del sangue intero in provette per centrifugazione a gradiente di densità determina la separazione di plasma, piastrine e PBMC al di sopra del mezzo di gradiente di densità con multinucleati ed eritrociti al di sotto del mezzo di gradiente di densità. (B) La centrifugazione del sangue intero in provette EDTA determina la separazione del plasma nello strato più superficiale, degli eritrociti nello strato inferiore e del buffy coat nell'interfaccia. Creato con Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="grafici a dispersione per citometria a flusso; PBMC, monociti, linfociti; Analisi di vitalità, grafico del tipo di cellula." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: La vitalità delle PBMC crioconservate scongelate è stata valutata mediante colorazione a flusso vivo/morto e citometria a flusso. (A) I detriti, contrassegnati da un asterisco *, sono esclusi dalle PBMC mediante un gating a dispersione anteriore e laterale. (B) Analisi rappresentativa vivo/morto di PBMC interi (C) I pan-monociti sono classificati come HLA-DR positivi e negativi per i seguenti antigeni di superficie marcati con FITC: CD3, CD19, CD56 e CD66b. (D) Analisi rappresentativa viva/morta dei monociti. (E) Linfociti controllati dai seguenti antigeni di superficie marcati con FITC: CD3, CD19, CD56 e CD 66b. (F) Analisi rappresentativa dei linfociti vivi/morti. (G) Percentuale di vitalità di ciascun tipo di cellula quantificata da 56 campioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafici di analisi dei dati FastQC; Milioni di sequenze vs distribuzione di contenuti GC allineabile." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66794/66794fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Qualità del sequenziamento dell'RNA dei monociti selezionati da PBMC crioconservate. Sono stati sequenziati 56 campioni unici e sono state generate ± medie SD 18,0 ± 16,3 milioni di sequenze totali. (A) L'allineamento era elevato, con il 92,5% ± il 6,3% delle sequenze allineate con il genoma di riferimento. (B) Il contenuto di GC di queste sequenze era del 49,6 ± dell'1,4%. Creato con FastQC25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video supplementare 1: Dimostrazione di come utilizzare la centrifuga <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794_R1.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Video supplementare 2: Dimostrazione di come utilizzare una pipetta multi-dispenser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66794/66794_R2.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Isolamento e crioconservazione di cellule mononucleate del sangue periferico umano altamente vitali da sangue intero: una guida per principianti

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