Name: Strategie per valutare i comportamenti simil-autistici nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Scopri i test comportamentali per valutare i comportamenti simil-autistici nei topi, inclusi il test di grooming e il test di interazione sociale a tre camere. Questi metodi standardizzati migliorano la riproducibilità nella ricerca sull'autismo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Saggi comportamentali per il disturbo dello spettro autistico in modelli murini

<table><tbody><tr><td>1/4 '' Lettiera di pannocchia di mais Teklad&nbsp;</td><td>Harlan, TEKLAD</td><td>7092-7097</td><td>Il grezzo per i prodotti da letto in pannocchia di mais è 100% pannocchia di mais. Non vengono utilizzati altri componenti o additivi.</td></tr><tr><td>Videocamera per registrazione video HDComa</td> tradizionale <td>Sony</td><td>HDRCX405</td><td>50 Mbps XAVC S1 1920 x 1080 a 60P, AVCHD e codec MP4. Zoom ottico 30x / Zoom immagine nitida 60x per avvicinarsi all'azione. Obiettivo ZEISS grandangolare da 26,8 mm.</td></tr><tr><td>Guanti da esplorazione senza polvere di nitrile</td><td>Aurelia, Transform</td><td>ASTM D6319-00</td><td>Testato per l'uso con farmaci chemioterapici secondo ASTM D6978</td></tr><tr><td>Fondi per gabbie in plastica per roditori</td><td>Ancare</td><td>AN75PLF</td><td>AN75 Mouse 7&frac12; &rdquo; L x 11&frac12; &rdquo; L x 5" H</td></tr><tr><td>T&Aring; Lampada da terra e lampadine GARP</td><td>Le lampadine IEKA</td><td>604.640.49</td><td>sono da 23 W 120 V.</td></tr><tr><td>Ugo Basile Apparato di Socialità</td><td>Stoelting&nbsp;</td><td>60450</td><td>L'apparato di socievolezza (test sociale a 3 camere) è uno strumento prezioso per studiare il comportamento sociale nei topi.</td></tr><tr><td>Versa-Clean&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>PVCLN04</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Lavagna bianca e&nbsp; Pennarello cancellabile a secco a basso odore</td><td>EXPO</td><td>NA</td><td>Pennarelli cancellabili a secco in nero grassetto</td></tr></tbody></table>

strategie per valutare i comportamenti simil-autistici nei topi

Strategies for Assessing Autistic-Like Behaviors in Mice

Il bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR) svolge un ruolo cruciale nel sistema nervoso centrale (SNC) regolando la sintesi proteica de novo e reprimendo l'autofagia43. La disregolazione della via mTOR e della sintesi proteica sinaptica è stata implicata nell'ASD28. Studi sull'intero genoma su pazienti con ASD hanno identificato varie mutazioni geniche associate all'ASD, comprese quelle che colpiscono le proteine coinvolte nella segnalazione del complesso mTOR 1 (mTORC1), come la fosfatasi e l'omologo della tensina sul cromosoma dieci (PTEN), il complesso della sclerosi tuberosa (TSC1/2) e la proteina del ritardo mentale dell'X fragile (FMRP)44,45,46,47,48,49. La delezione di queste proteine in modelli murini induce comportamenti simili all'ASD, inclusi deficit sociali e comportamenti ripetitivi 45,46,47. L'eccessiva sintesi proteica sinaptica, guidata dall'aumento della traduzione dell'mRNA dipendente dal fattore di iniziazione eucariotico 4E (eIF4E), in particolare attraverso mTORC1, è stata collegata a una maggiore connettività sinaptica e ai fenotipi ASD 48,49,50. La proteina eIF4E, in combinazione con l'elicasi eIF4A e la proteina di impalcatura eIF4G, si assembla nel complesso di legame del cappuccio eIF4F, che facilita l'inizio della traduzione dell'mRNA50. Le proteine leganti eIF4E (4E-BP) inibiscono la traduzione legandosi a eIF4E e non permettendo la formazione del complesso eIF4F51. mTORC1 promuove la traduzione fosforilando i 4E-BP, liberando così eIF4E per facilitare la formazione di eIF4F51. Dei tre paraloghi 4E-BP nei mammiferi, 4E-BP2 (codificato da Eif4ebp2) è il più predominante nel cervello52. Test comportamentali con cucciolate wildtype e topi knockout 4E-BP2 hanno dimostrato l'utilità di questo protocollo: ricerche precedenti del nostro laboratorio hanno mostrato un comportamento ripetitivo simile all'ASD nei topi omozigoti Eif4ebp2 full-body knockout (Eif4ebp2 KO) e deficit sociali in Eif4ebp2 KO e modelli knockout condizionali per neuroni inibitori53,54. Per mostrare i comportamenti naturali degli animali, qui, presentiamo i risultati dell'auto-toelettatura e i test di interazione sociale a tre camere condotti su topi C57BL/6J. Abbiamo condotto il test di auto-toelettatura su Eif4ebp2 KO e li abbiamo confrontati con topi wild type. Per il test a tre camere, sono stati utilizzati topi KO condizionali 4E-BP2 (Eif4ebp cKO), che sono stati incrociati con topi Camk2α-Cre e topi Gad2-Cre. Come topi di controllo (Eif4ebp2 CTL), abbiamo utilizzato i compagni di cucciolata Camk2α-Cre e Gad2-Cre dello stesso sesso ed età. I seguenti risultati servono come risultati rappresentativi per convalidare i protocolli per la valutazione del comportamento ASD-like su modelli genetici di topi.
Il test di auto-toelettatura è presentato nella Figura 1. La configurazione schematica ed effettiva mostra le fasi di assuefazione e test del test di auto-toelettatura (Figura 1A). La toelettatura dei topi è stata classificata in due tipi principali: toelettatura rostrale e toelettatura caudale (Figura 1B). Tra i 10 video registrati da topi maschi C57BL/6J durante il test, abbiamo osservato che i topi in genere iniziavano la toelettatura con la toelettatura di zampe/naso e poi trascorrevano gran parte del tempo di toelettatura leccando i loro corpi, concentrandosi in particolare sul lavaggio della pancia e degli arti posteriori (Figura 1C). Le medie per le diverse aree di toelettatura sono le seguenti: zampe/naso 13,1 ± 4,7 s, viso/testa 5,2 ± 1,2 s, corpo/coda 39,3 ± 8,5 s. La toelettatura delle orecchie e della coda è stata osservata raramente. Inoltre, i singoli attacchi (Figura 1D) rappresentano ogni volta in cui il topo di prova ha cambiato area per la toelettatura (ad esempio, da zampe e naso a viso/testa o corpo/coda), con la toelettatura del corpo che è il comportamento di auto-toelettatura osservato più frequentemente. I mezzi per le diverse aree di toelettatura sono i seguenti: zampe/naso 2,4 ± 0,4 attacchi, viso/testa 2,5 ± 0,4 attacchi, corpo e coda 5,4 ± 0,7 attacchi. Successivamente, abbiamo analizzato i video dei topi KO contro Eif4ebp2 e dei loro compagni di cucciolata di controllo wildtype (CTL) di entrambi i sessi. Sulla base di precedenti ricerche del nostro laboratorio che hanno indagato su topi maschi KO con Eif4ebp2 , abbiamo previsto un aumento della toelettatura, indicativo di un comportamento ripetitivo anormale53. Come previsto, abbiamo osservato differenze significative nel tempo di auto-toelettatura e nel numero di attacchi. Una differenza significativa è stata riscontrata nel tempo di auto-toelettatura tra i topi di controllo maschi (Figura 1E) (n = 7, media = 25,61 ± 5,8 s) e i topi KO Eif4ebp2 (n = 5, media = 46,57 ± 7,3 s) (t(23)= 2,286, p = 0,0454; t-test non appaiato), così come tra topi di controllo femmine (n = 5, media = 21,86 ± 7,8 s) e topi KO Eif4ebp2 (n = 6, media = 81,70 ± 21,2 s) (t(23) = 2,440, p = 0,0373; t-test non appaiato). Inoltre, i topi maschi KO contro Eif4ebp2 (n = 5, media = 7,2 ± 1,4 attacchi) hanno iniziato più attacchi di toelettatura rispetto al gruppo di controllo (Figura 1F), (n = 7, media = 3,4 ± 0,3 attacchi) (t(23) = 2,683, p = 0,0476; t-test di Welch). Una differenza significativa è stata osservata anche tra le femmine di topi KO contro Eif4ebp2 (n = 6, media = 7,5 ± 0,9 attacchi) e il gruppo di controllo (n = 5, media = 2,2 ± 0,5 attacchi) (t(23) = 4,770, p = 0,0010; t-test non appaiato). In conclusione, sia i topi femmine che i maschi con 4E-BP2 KO mostrano un aumento del fenotipo di auto-toelettatura ripetitiva.
Il test di interazione sociale a tre camere è raffigurato in Figura 2. L'impostazione schematica e reale mostra il quadro generale del test sociale a tre camere, che include l'abitudine, l'approccio sociale e la preferenza per la novità sociale (Figura 2A). Abbiamo condotto il test a tre camere inizialmente su topi C57BL/6J (Figura 2B; n = 12, maschio). I topi in genere preferivano interagire con S1 rispetto a un nuovo oggetto inanimato, con un tempo medio di interazione di 124,2 ± 10,6 s per S1 e 60,01 ± 3,9 s per E (t(23) = 5,665, P &lt; 0.0001; Welch's test). Similarly, C57BL/6J mice displayed more interest in a newly introduced S2 compared to a familiar S1 (Figura 2C), con un tempo medio di interazione di 66,07 ± 7,3 s per S2 e 36,21 ± 4,6 s per S1 (t(23) = 3,468, P = 0,0027; t-test non appaiato). Figurini 2D-G presentano i dati di una precedente pubblicazione del Dr. Wiebe su PNAS, test a tre camere di Eif4ebp2 Topi cKO54. Questi topi avevano 4E-BP2 deleto condizionatamente in CamkIIα+ esprimendo neuroni eccitatori (Eif4ebp2Ex cKO) e Gad2+ che esprimono neuroni inibitori (Eif4ebp2In cKO). Ambedue Eif4ebp2Ex cKO (n = 14) e compagni di cucciolata di controllo Eif4ebp2Ex CTL (n = 11) ha trascorso più tempo interagendo con S1 rispetto a E (Figura 2D), (effetti principali della camera, F(1,23) = 28,90, p &lt; 0.0001, Bonferroni post hoc Significare: Eif4ebp2Ex cKO, S1 84,2 ± 7,4 s, E 49,7 ± 4,4 s, t(23) = 3,544, p = 0,0035; Eif4ebp2Ex CTL S1 94,1 ± 5,7 s, E 49,7s ± 5,6, t(23) = 4,042, p = 0,0010; nessun effetto principale del genotipo, F(1,23) = 1,328, p = 0,2610; nessun effetto di interazione camera x genotipo, F(1,23) = 0,4548, p = 0,5068; ANOVA a 2 vie). Un risultato simile è stato osservato nella preferenza per la fase di novità sociale, dove entrambi i gruppi hanno mostrato una maggiore interazione con S2 rispetto a S1 (Figura 2E), (effetto principale della camera, F(1,23) = 35,28, p &lt; 0.0001, Bonferroni post hoc: Eif4ebp2Ex cKO, S1 42,8 s ± 5,1, S2 75,7 s ± 5,5 t(23) = 4,076, p = 0,0009 e Eif4ebp2Ex CTL , S1 38,3 ± 4,3 s, S2 77,6 ± 6,8 s, t(23) = 4,325, p = 0,0005; nessun effetto principale del genotipo, F(1,23) = 0,07213, p = 0,7907; nessuna camera per effetto di interazione genotipo, F(1,23) = 0,2839, p = 0,5993; ANOVA a 2 vie). Stranamente Eif4ebp2In I topi cKO non hanno mostrato un approccio sociale per S1 rispetto a E rispetto ai compagni di cucciolata di tipo selvatico Eif4ebp2Ex CTL (Figura 2F), (camera per effetto di interazione genotipo, F(1,30) = 8,624, p = 0,0063, Bonferroni post hoc: Eif4ebp2In cKO, S1 60,1 ± 5,8 s, E 59,6 ± 6,8 s, t(30) = 0,04905, p &gt; 0,9999; Eif4ebp2Ex CTL, S1 63,4 ± 6,7 s, E 26,4 ± 3,0 s, t(30) = 4,667, p = 0,0001; effetto principale della camera, F(1,30) = 9,074, p = 0,0052; effetto principale del genotipo, F(1,30) = 7,994, p = 0,0083; ANOVA a 2 vie). Ambedue Eif4ebp2In cKO e Eif4ebp2Ex I topi CTL hanno dimostrato una preferenza simile per la novità sociale (Figura 2G), (effetto principale della camera, F(1,30) = 19,56, p = 0,0001, Bonferroni post hoc: Eif4ebp2In cKO, S1 29,5 ± 4,3 s, S2 42,9 ± 5,6 s, t(30) = 2,441, p = 0,0415 e Eif4ebp2In CTL, S1 25,5 ± 5,4 s, S2 43,7 ± 5,0 s, t(30) = 3,986, p = 0,0008; nessun effetto principale del genotipo, F(1,30) = 0,05985, p = 0,8084; nessuna camera per effetto di interazione genotipo, F(1,30) = 0,4351, p = 0,5145; ANOVA a 2 vie). Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che Eif4ebp2 cKO in Gad2+ interneuroni, ma non Camk2IIα+ neuroni eccitatori, si traduce in una diminuzione dell'approccio sociale. I dati rappresentativi dimostrano ulteriormente l'efficacia dei nostri protocolli nella valutazione dei comportamenti sociali dei topi transgenici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66846/66846fig01.jpg"> 
Figura 1: Comportamento di auto-grooming ed effetti della delezione 4E-BP2 sul comportamento di self-grooming. (A) Schema che illustra il periodo di tempo e la configurazione utilizzati per valutare il comportamento di auto-grooming. Le figure mostrano il topo di prova in una gabbia vuota con lettiera fresca per un totale di 20 minuti, con 10 minuti assegnati per l'assuefazione e 10 minuti per il punteggio dei comportamenti di auto-toelettatura. L'impostazione effettiva del test di auto-toelettatura: una telecamera viene posizionata davanti a una gabbia pulita (con lettiera fresca). (B) Esempi di diverse fasi dell'auto-toelettatura dei topi per valutare il comportamento ripetitivo simile all'ASD. L'immagine a sinistra raffigura la toelettatura rostrale di zampe, naso e viso; La foto a destra illustra la toelettatura caudale del ventre e dell'arto posteriore. (C) Analisi manuale delle registrazioni video del tempo di auto-toelettatura di topi maschi C57/BL6J (2-3 mesi, n = 10) e (D) numero di singoli periodi di auto-toelettatura. (E) Tempo di toelettatura dei topi knockout Eif4ebp2 (2-3 mesi) e (F) Attacchi di toelettatura in entrambi i topi maschi knockout Eif4ebp2 (blu) e femmine (rosa) rispetto ai rispettivi compagni di cucciolata wildtype Eif4ebp2 (azzurro e rosa chiaro). Per l'analisi statistica, il t-test di Student non accoppiato è stato eseguito in (E,F). I dati vengono visualizzati come media ± sem. **p &lt; 0,01; *p &lt; 0,05; ns, p &gt; 0,05, non significativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66846/66846fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66846/66846fig02.jpg"> 
Figura 2: Comportamento dell'interazione sociale a tre camere ed effetti dei topi knockout condizionali 4E-BP2 sull'interazione sociale. (A) Lo schema illustra le tre fasi del test di interazione sociale a tre camere. Nella fase di assuefazione, il topo di prova viene posto al centro di un apparecchio vuoto a tre camere per 10 minuti. L'effettiva configurazione dell'apparato a tre camere e degli involucri dei cavi per gli stimoli. Una telecamera è fissata sopra l'apparato. Analisi manuale di registrazioni video aeree di topi maschi C57BL/6J (2-3 mesi, n = 12) durante l'approccio sociale (B) e (C) la preferenza per le fasi di novità sociale. I topi C57BL/6J hanno trascorso più tempo a interagire con S1 rispetto a E, così come con S2 rispetto a S1. (D) L'approccio sociale dei topi maschi di 2-3 mesi Eif4ebp2Ex conditional knockout (Eif4ebp2 flx/flx:Camk2a-Cre, viola, n = 14) e Eif4ebp2Ex wildtype (Eif4ebp2 +/+:Camk2a-Cre, bianco, n = 11). (E) Preferenza per la novità sociale dei topi maschi di 2-3 mesi Eif4ebp2Ex conditional knockout (Eif4ebp2 flx/flx:Camk2a-Cre, viola, n = 14) e Eif4ebp2Ex wildtype (Eif4ebp2 +/+:Camk2a-Cre, bianco, n = 11). I grafici a barre indicano differenze di tempo di interazione simili per l'approccio sociale e la preferenza per la novità sociale nel knockout condizionale Eif4ebp2Ex rispetto ai suoi compagni di cucciolata di controllo. (F) Approccio sociale di maschi di 2-3 mesi Eif4ebp2In knockout condizionale (Eif4ebp2 flx/flx:Gad2-Cre, verde, n = 13) e Eif4ebp2In topi wildtype (Eif4ebp2+/+:Gad2-Cre, bianco, n = 19). (G) Approccio sociale di maschi di 2-3 mesi di età Eif4ebp2In knockout condizionale (Eif4ebp2 flx/flx:Gad2-Cre, verde, n = 13) e Eif4ebp2In topi wildtype (Eif4ebp2+/+:Gad2-Cre, bianco, n = 19). I grafici a barre indicano un approccio sociale compromesso ma nessuna differenza nella preferenza per la novità sociale in Eif4ebp2In knockout condizionale rispetto ai suoi compagni di cucciolata wildtype. Per l'analisi statistica, il t-test di Welch e il t-test di Student non appaiati sono stati eseguiti rispettivamente in (B) e (C); ANOVA a due vie con test post hoc di Bonferroni è stato eseguito in (D-G). I dati vengono visualizzati come media ± sem. ****p &lt; 0,0001; p &lt; 0,001; **p &lt; 0,01; ns (p &gt; 0,05): non significativo. I dati per i pannelli D-G sono stati ottenuti con il permesso di Wiebe et al.54. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66846/66846fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Strategie per valutare i comportamenti simil-autistici nei topi

Autism spectrum disorder (ASD) is a neurobiologically complex condition with a heterogeneous genetic etiology. Clinically, ASD is diagnosed by social ...

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