Name: Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Scopri un protocollo di screening ad alto rendimento per Mycobacterium abscessus utilizzando ceppi reporter doppi e automazione robotica. Questo metodo accelera la scoperta di nuovi farmaci efficaci contro infezioni resistenti.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Saggio di screening ad alto rendimento per Mycobacterium abscessus utilizzando doppi reporter

<ol><li>Victoria, L., Gupta, A., Gomez, J. L., Robledo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+complex%3A+A+review+of+recent+developments+in+an+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus complex: A review of recent developments in an emerging pathogen.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 659997(2021).</li>
<li>Luthra, S., Rominski, A., Sander, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antibiotic-target-modifying+and+antibiotic-modifying+enzymes+in+Mycobacterium+abscessus+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of antibiotic-target-modifying and antibiotic-modifying enzymes in Mycobacterium abscessus drug resistance.</a> Front Microbiol. 9, 2179(2018).</li>
<li>Nathavitharana, R. R., Strnad, L., Lederer, P. A., Shah, M., Hurtado, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+questions+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+M.+abscessus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Top questions in the diagnosis and treatment of pulmonary M. abscessus disease.</a> Open Forum Infect Dis. 6 (7), ofz221(2019).</li>
<li>Cristancho-Rojas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Mycobacterium abscessus.</a> Clin Microbiol Infect. 30 (6), 712-717 (2024).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+repositioning%3A+Progress+and+challenges+in+drug+discovery+for+various+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug repositioning: Progress and challenges in drug discovery for various diseases.</a> Eur J Med Chem. 234, 114239(2022).</li>
<li>Doan, T. L., Pollastri, M., Walters, M. A., Georg, G. I. The future of drug repositioning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoan%2C+TL+%22Annual+reports+in+medicinal+chemistry%22">Annual reports in medicinal chemistry</a>. Macor, J. E. , Academic Press. 385-401 (2011).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+antibacterial+drug+screening+methods%3A+Current+prospects+for+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Evolution of antibacterial drug screening methods: Current prospects for mycobacteria.</a> Microorganisms. 9 (12), 2562(2021).</li>
<li>Attene-Ramos, M. S., Austin, C. P., Xia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Encycl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">High throughput screening.</a> Encycl Toxicol. 3, 916-917 (2014).</li>
<li>Gupta, R., Netherton, M., Byrd, T. F., Rohde, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter-based+assays+for+high-throughput+drug+screening+against+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reporter-based assays for high-throughput drug screening against Mycobacterium abscessus.</a> Front Microbiol. 8, 2204(2017).</li>
<li>Bento Clara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+double-reporter+strains+of+Mycobacterium+abscessus+for+drug+discovery%3A+A+study+in+mScarlet%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel double-reporter strains of Mycobacterium abscessus for drug discovery: A study in mScarlet.</a> Microbiol Spectr. , e0036224(2024).</li>
<li>Kolbe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+optimization+of+chromosomally-integrated+fluorescent+Mycobacterium+tuberculosis+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and optimization of chromosomally-integrated fluorescent Mycobacterium tuberculosis reporter constructs.</a> Front Microbiol. 11, 591866(2020).</li>
<li>Lopez-Roa, P., Esteban, J., Munoz-Egea, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+review+on+the+mechanisms+of+pathogenicity+in+Mycobacterium+abscessus%2C+a+rapidly+growing+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Updated review on the mechanisms of pathogenicity in Mycobacterium abscessus, a rapidly growing emerging pathogen.</a> Microorganisms. 11 (1), 90(2022).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Advanced+assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening+and+analysis+in+Assay+guidance+manual%22">Advanced assay development guidelines for image-based high content screening and analysis in Assay guidance manual</a>. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CLSI+document+M07-A10%22">CLSI document M07-A10</a>. , 10th ed, Wayne, PA. (2015).</li>
<li>Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferricin+peptides+increase+macrophages%27+capacity+to+kill+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Lactoferricin peptides increase macrophages' capacity to kill Mycobacterium avium.</a> mSphere. 2 (4), e00301-e00317 (2017).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+beyond+typical+treatments+for+atypical+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Looking beyond typical treatments for atypical mycobacteria.</a> Antibiotics (Basel). 9 (1), 18(2020).</li>
<li>Spizek, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lincosamides%3A+Chemical+structure%2C+biosynthesis%2C+mechanism+of+action%2C+resistance%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Lincosamides: Chemical structure, biosynthesis, mechanism of action, resistance, and applications.</a> Biochem Pharmacol. 133, 20-28 (2017).</li>
<li>Hurst-Hess, K. R., Rudra, P., Ghosh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+protection+as+a+mechanism+of+lincosamide+resistance+in+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ribosome protection as a mechanism of lincosamide resistance in Mycobacterium abscessus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (11), e0118421(2021).</li>
<li>Kang, J. K., Kang, H. K., Hyun, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+effects+of+spiramycin+in+lps-activated+raw+264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory effects of spiramycin in lps-activated raw 264.7 macrophages.</a> Molecules. 27 (10), 3202(2022).</li>
<li>Zimmermann, P., Ziesenitz, V. C., Curtis, N., Ritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+effects+of+macrolides-a+systematic+review+of+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory effects of macrolides-a systematic review of the underlying mechanisms.</a> Front Immunol. 9, 302(2018).</li>
<li>Pradhan, S., Madke, B., Kabra, P., Singh, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+effects+of+antibiotics+and+their+use+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of antibiotics and their use in dermatology.</a> Indian J Dermatol. 61 (5), 469-481 (2016).</li>
<li>Volochnyuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+commercially+available+compounds+for+hts%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Evolution of commercially available compounds for hts.</a> Drug Discov Today. 24 (2), 390-402 (2019).</li>
<li>Sritharan, S., Sivalingam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+on+time-tested+anticancer+drug+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review on time-tested anticancer drug doxorubicin.</a> Life Sci. 278, 119527(2021).</li>
<li>Arwanih, E. Y., Louisa, M., Rinaldi, I., Wanandi, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+mechanism+of+acute+myeloid+leukemia+cells+against+daunorubicin+and+cytarabine%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Resistance mechanism of acute myeloid leukemia cells against daunorubicin and cytarabine: A literature review.</a> Cureus. 14 (12), e33165(2022).</li>
<li>Khasraw, M., Bell, R., Dang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epirubicin%3A+Is+it+like+doxorubicin+in+breast+cancer%3F+A+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Breast%22%5BJournal%5D)">Epirubicin: Is it like doxorubicin in breast cancer? A clinical review.</a> Breast. 21 (2), 142-149 (2012).</li>
<li>Schultz, C. W., Nevler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrvinium+pamoate%3A+Past%2C+present%2C+and+future+as+an+anti-cancer+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Pyrvinium pamoate: Past, present, and future as an anti-cancer drug.</a> Biomedicines. 10 (12), 3249(2022).</li>
<li>Bailly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+thiopeptide+thiostrepton.+An+update+of+its+mode+of+action%2C+pharmacological+properties+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The bacterial thiopeptide thiostrepton. An update of its mode of action, pharmacological properties and applications.</a> Eur J Pharmacol. 914, 174661(2022).</li>
<li>Kwok, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton+selectively+targets+breast+cancer+cells+through+inhibition+of+forkhead+box+m1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton selectively targets breast cancer cells through inhibition of forkhead box m1 expression.</a> Mol Cancer Ther. 7 (7), 2022-2032 (2008).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton%3A+A+novel+therapeutic+drug+candidate+for+Mycobacterium+abscessus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton: A novel therapeutic drug candidate for Mycobacterium abscessus infection.</a> Molecules. 24 (24), 4511(2019).</li>
<li>Perry, C. M., Scott, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cefdinir%3A+A+review+of+its+use+in+the+management+of+mild-to-moderate+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Cefdinir: A review of its use in the management of mild-to-moderate bacterial infections.</a> Drugs. 64 (13), 1433-1464 (2004).</li>
<li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+clinically+approved+cephalosporins+for+tuberculosis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Repurposing clinically approved cephalosporins for tuberculosis therapy.</a> Sci Rep. 6, 34293(2016).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+l%2Cd-transpeptidases+are+susceptible+to+inactivation+by+carbapenems+and+cephalosporins+but+not+penicillins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus l,d-transpeptidases are susceptible to inactivation by carbapenems and cephalosporins but not penicillins.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (10), e00866-e00917 (2017).</li>
<li>Alvirez-Freites, E. J., Carter, J. L., Cynamon, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+activities+of+gatifloxacin+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1022-1025 (2002).</li>
<li>Braback, M., Riesbeck, K., Forsgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibilities+of+Mycobacterium+marinum+to+gatifloxacin%2C+gemifloxacin%2C+levofloxacin%2C+linezolid%2C+moxifloxacin%2C+telithromycin%2C+and+quinupristin-dalfopristin+%28synercid%29+compared+to+its+susceptibilities+to+reference+macrolides+and+quinolones%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibilities of Mycobacterium marinum to gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, telithromycin, and quinupristin-dalfopristin (synercid) compared to its susceptibilities to reference macrolides and quinolones.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1114-1116 (2002).</li>
</ol>

Il Mycobacterium abscessus (Mab) è un patogeno opportunista responsabile delle infezioni polmonari, specialmente nelle persone con fibrosi cistica e altre malattie polmonari. Le infezioni causate da Mab sono notoriamente difficili da trattare a causa della squisita resistenza intrinseca ai farmaci, paragonabile alla tubercolosi multiresistente1. I farmaci disponibili sono in gran parte inefficaci a causa dell'involucro cellulare micobatterico altamente impermeabile e di un genoma che codifica diversi enzimi che disattivano gli antibiotici2. Pertanto, il trattamento include la combinazione di diversi farmaci che richiede mesi o anni. Questo impegnativo regime multifarmacologico, combinato con una bassa compliance del paziente, si traduce in un tasso medio di guarigione compreso tra il 30% e il 50%3. Inoltre, negli ultimi decenni è aumentata la prevalenza delle infezioni polmonari causate da micobatteri non tubercolari, comprese quelle causate da Mab 1,4. Di conseguenza, la comunità scientifica sta correndo per sviluppare nuovi composti per trattare le infezioni da Mab.
Una delle strategie perseguite a questo scopo è il riposizionamento dei farmaci, il processo di identificazione di nuove opportunità terapeutiche per i farmaci esistenti. In questo modo si elude la sfida più grande che accompagna la pipeline di scoperta e sviluppo di un nuovo farmaco: il tempo5. Questo semplice concetto sfrutta i profili farmacocinetici e di sicurezza già stabiliti di diversi farmaci per ridurre i costi di sviluppo e abbreviare i tempi necessari per portare un farmaco dal laboratorio al letto del paziente6. Pertanto, sono state compilate librerie che combinano centinaia o migliaia di tali composti, consentendo ai ricercatori di testare rapidamente la possibilità di riutilizzare i farmaci contro il loro agente patogeno di interesse.
La maggior parte degli studi sullo sviluppo di farmaci contro il Mab si basa su un test gold standard ma tradizionale che valuta l'attività in vitro di un composto contro i micobatteri - unità formanticolonie che contano 7. Nonostante la sua accuratezza, questa procedura richiede molto tempo, diventando rapidamente irrealizzabile quando qualcuno mira a testare librerie contenenti migliaia di composti. A tal fine, nello sviluppo dei farmaci sono stati integrati screening ad alto rendimento (HTS), saggi robusti che sfruttano la robotica e i dispositivi di manipolazione dei liquidi, consentendo di eseguire rapidamente lo screening di migliaia di composti in parallelo8. Questo viene in genere fatto testando inizialmente una singola concentrazione, utilizzando piastre per microtitolazione di formati a 96, 384, 1536 o 3456 pozzetti, fungendo da punto di partenza per identificare i risultati e ottimizzarli ulteriormente lungo la pipeline per essere utilizzati clinicamente.
I saggi basati su reporter offrono un vantaggio significativo per la robustezza degli HTS grazie alla loro semplicità e sensibilità rispetto ad altri saggi basati su coloranti e assorbanza 7,9. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, solo pochi studi hanno ottimizzato uno screening ad alto rendimento contro Mab9.
Recentemente, il nostro laboratorio ha sviluppato ceppi reporter doppi in grado di emettere contemporaneamente luminescenza e fluorescenza10. Il Mab operon_mScarlet è una di queste varietà. È autoluminescente grazie all'espressione dell'operone LuxABCDE , che include una luciferasi batterica (per espressione dei geni luxAB ) e un substrato aldeidico a catena lunga (per espressione dei geni luxCDE ). D'altra parte, la lettura fluorescente è ottenuta attraverso l'espressione di una proteina fluorescente rossa di recente sviluppo, mScarlet, che supera le proteine eGFP e mCherry più comunemente utilizzate, fornendo un segnale più potente11. L'utilizzo di questo ceppo ci consente di valutare la vitalità batterica in coltura liquida misurando il segnale luminescente in un lettore di micropiastre senza aggiungere reagenti o eseguire ulteriori passaggi. In termini di rilevamento, la fluorescenza intrinseca consente la visualizzazione al microscopio in cellule vive o fissate senza l'uso di coloranti o anticorpi. Avere un singolo ceppo con entrambe le letture offre ai ricercatori un vantaggio significativo quando lo utilizzano nei saggi HTS: la ridotta variabilità tra i saggi con letture diverse, poiché non è necessario scambiare i ceppi in base alla natura del test.
Pertanto, questo lavoro ha sviluppato un test ad alto rendimento contro Mab utilizzando un ceppo doppio reporter progettato internamente (Figura 1). Ciò ha permesso una rapida valutazione dell'attività in vitro dei farmaci 1280 destinati al riposizionamento utilizzando una libreria commerciale (vedi Tabella dei materiali). In primo luogo, le attività sono state valutate in un saggio di coltura in brodo utilizzando la luminescenza e, in secondo luogo, utilizzando macrofagi infettati da Mab sfruttando il segnale fluorescente, emulando meglio il processo di infezione osservato nel vivo12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig01v2.jpg"> Figura 1: Abstract grafico del protocollo stabilito. L'attore chiave in questo screening è un ceppo micobatterico doppio reporter sviluppato internamente , che viene utilizzato in tutti gli esperimenti. In primo luogo, utilizzando un dosatore di reagenti e batteri planctonici, viene eseguito uno screening iniziale testando i composti a una singola concentrazione. I risultati identificati proseguono con il test di convalida, in cui vengono testate tre diverse concentrazioni. Entrambi gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando la lettura luminescente. I risultati convalidati proseguono con il test di infezione, dove vengono testate anche tre diverse concentrazioni e i macrofagi derivati dal midollo osseo vengono infettati al MOI 1. Un sistema di imaging ad alto contenuto acquisisce il segnale fluorescente batterico e il software di analisi viene utilizzato per valutare il carico intracellulare attraverso la formula Mycoload. Il numero di composti si riduce all'aumentare della complessità del saggio. Creato con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig01largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>10% Formalina tamponata neutra</td><td>Bio Optica</td><td>05-01005Q</td><td>soluzione di fissazione</td></tr><tr><td>Micropiastra nera a fondo tondo nera a 384 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3658</td><td>Micropiastre bianche Corning 3658 Utilizzabile in polistirene 50</td></tr><tr><td>TS Washer</td> Membrana sigillante <td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>cell:: esploratore</td><td>Robot di movimentazione per apparecchiature</td><td>Revvity</td><td></td></tr><tr><td>Claritromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3487-100MG</td><td>Disciolto in DMSO alla concentrazione desiderata</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/4121/PB15</td><td>Diluire in terreno di crescita liquido alla concentrazione desiderata</td></tr><tr><td>Harmony 5.1</td><td>Software di analisi</td><td>Revvity</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 Incubatore, 165 L</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>incubatore cellulare</td></tr><tr><td>JANUS con 4 Tip Arm e MDT Arm</td><td>Revvity</td><td></td><td>liquid handler</td></tr><tr><td>KB 8182</td><td>Termaks incubatore con</td><td></td><td>agitazione</td></tr><tr><td>Libra S4+</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop&nbsp; Dispenser di reagenti combinati</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opera Phenix Plus</td><td>Sistema di imaging Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate</td><td>Revvity</td><td>6055302</td><td>Necessario per microscopi ad alto contenuto</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato (PBS) 1x</td><td>soluzione di lavaggio</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>Librerie chimiche Prestwick&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Libreria chimica commerciale destinata al riposizionamento di farmaci</td></tr><tr><td>Incubatore vibrante 3031</td><td>GFL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VICTOR Nivo</td><td>Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura cellulare: </forte></td><td></td><td></td><td>Quando necessario, aggiungere il 10% dell'integratore</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>10938-025</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>LCCM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Terreno condizionato da linea cellulare L929 che rilascia il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF); integratore di terreno per colture cellulari</td></tr><tr><td>L-glutammina (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio 100 mM (100X)</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td><forte>Soluzione di lavaggio per infezioni</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td> apirogenica <td>Fornitori multipli disponibili</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank 10x</td><td>Gibco</td><td>14060-040</td><td>Diluire a 1x con acqua apirogenica</td></tr><tr><td><forte>Soluzione permeabilizzante</forte></td><td></td><td></td><td>PBS con 0,1% Triton X100</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Altri fornitori disponibili</td></tr><tr><td><forte>Soluzione colorante</forte></td><td></td><td></td><td>PBS con DAPI (500 ng/mL) e HCS Far Red (10 ng/mL)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>HCS Far Red&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>H32721</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA Più</td><td>fornitori disponibili</td></tr><tr><td><forte>Mezzo di crescita liquido</forte></td><td></td><td></td><td>Quando necessario, aggiungere un integratore del 10%</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Brodo</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td>0,05% concentrazione finale. Altri fornitori disponibili</td></tr><tr><td>Integratore liquido del terreno di crescita:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0450/60</td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Valutazione del fattore Z' La Figura 2 illustra i dati di uno dei due esperimenti eseguiti per calcolare il fattore Z'. Il controllo positivo era la claritromicina a 4 μg/mL. Entrambi gli esperimenti hanno prodotto fattori Z' di 0,64 e 0,62, il che significa che le condizioni e la lettura utilizzate per questo test possono essere applicate al test di screening successivo (Z' &gt; 0,5). Tuttavia, il fattore Z' è stato calcolato per tutti gli esperimenti rimanenti (test di infezione) per controllare le prestazioni di ciascun esperimento.
Come prova di concetto del test HTS progettato, è stata testata una libreria di composti destinati al riposizionamento dei farmaci. Comprende 1280 molecole diverse e di piccole dimensioni, il 95% delle quali sono farmaci approvati sia dalla FDA che dall'EMA. Queste molecole offrono un'elevata diversità chimica e farmacologica.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig02.jpg"> Figura 2: Risultati della valutazione del fattore Z'. Mab a 2,5 x 105 CFU/mL è stato incubato con e senza claritromicina a 4 μg/mL per 48 ore a 37 °C. Dopo il periodo di incubazione, la luminescenza è stata misurata per valutare la vitalità dei micobatteri. Il grafico mostra i singoli valori di luminescenza dei micobatteri vitali trattati e non trattati in un esperimento indipendente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Screening della libreria per i risultati Tutti i composti sono stati testati a 6,66 μM contro Mab. A causa delle dimensioni della libreria, i composti sono stati divisi in quattro diverse piastre per microtitolazione a 384 pozzetti (Figura 3A-D). I risultati sono stati normalizzati sia per il solvente che per l'effetto bordo verificato.
In questo test di screening sono stati identificati trentatré risultati, trenta dei quali hanno diminuito significativamente l'emissione di luminescenza, riducendo la vitalità dei micobatteri (Figura 3). È interessante notare che tre composti hanno portato a una maggiore emissione di luminescenza, probabilmente correlata all'aumento del metabolismo o della proliferazione batterica (Figura 3). Tutti i 33 risultati sono stati sottoposti al test di convalida, compresi i tre composti che aumentavano la luminescenza, per verificare se questo profilo sarebbe stato mantenuto.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig03.jpg"> Figura 3: Risultati dello screening della libreria. (A-D) Il Mab a 2,5 x 105 CFU/mL è stato incubato con 1280 composti a 6,66 μM per 48 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, la luminescenza è stata misurata per valutare la vitalità dei micobatteri. I grafici mostrano l'RLU di un esperimento indipendente, presentato come unità arbitrarie dopo la normalizzazione dell'effetto solvente e dell'effetto spigolo. L'RLU AVG e la SD corrispondente sono stati calcolati per ciascuna targa per determinare una soglia (in grigio; AVG ± 3SD). I simboli rotondi rappresentano un composto testato. In blu, qualsiasi composto al di fuori di tale soglia è considerato un hit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Saggio di convalida dei risultati Le concentrazioni utilizzate per questo test sono state 13,3 μM, 6,66 μM e 3,3 μM. Ogni composto è stato testato in duplicato per aumentarne la robustezza.
È importante sottolineare che i composti 30, 31 e 32, precedentemente associati a RLU più elevati (Figura 3A, C), hanno mantenuto questo profilo, con oltre il 200% di vitalità micobatterica raggiunta nei pozzetti trattati con il composto 32 (Figura 4).
I composti 20 e 33 sono stati considerati inattivi, poiché la vitalità dei micobatteri è vicina al 100% in tutte le concentrazioni testate (Figura 4).
I composti 9 e 21 hanno mostrato un'inattività simile alle due concentrazioni più basse; tuttavia, contrariamente al 20, rimangono attivi al massimo, 13,3 μM, con il composto 21 che mostra una potenza maggiore (Figura 4).
Il composto 3 mostra anche inattività alla concentrazione più bassa e una perdita di attività a 6,66 μM, anche se inferiore al composto 21 (Figura 4). Solo nella concentrazione più bassa, i composti 2, 7, 8, 10, 16, 18, 24 e 28 hanno mostrato un potenziale terapeutico inferiore. Tuttavia, 2, 10 e 28 portano ancora al &lt;50% della vitalità micobatterica.
A livello globale, i restanti quattordici composti erano attivi in tutte le concentrazioni testate.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig04.jpg"> Figura 4: Risultati del test di convalida dell'hit. Il Mab a 2,5 x 105 CFU/mL è stato incubato con ogni hit precedentemente identificato a 13,3 μM, 6,66 μM e 3,3 μM (1,3%, 0,7% e 0,3% di DMSO, rispettivamente) per 48 ore a 37 °C. Dopo il periodo di incubazione, la luminescenza è stata misurata per valutare la vitalità dei micobatteri. Il grafico mostra le percentuali di micobatteri vitali trattati rispetto ai micobatteri non trattati di un esperimento indipendente, con ogni composto testato in duplicato. I simboli rotondi rappresentano i duplicati per ogni composto. Le barre rappresentano la media di questi duplicati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Test di infezione Su trentatré composti testati, ventotto sono stati selezionati per il test dell'infezione (Figura 4). I composti 7, 8, 9, 20 e 33 non sono stati selezionati per questo test. Mentre 9, 20 e 33 sono stati esclusi a causa della loro inattività al momento della convalida (Figura 4), i primi due sono stati esclusi per motivi tecnici. Ciononostante, questi composti sono stati identificati come rifampicina e linezolid, antibiotici già usati per trattare le infezioni da Mab12. Tutti i composti testati nel test dell'infezione sono stati identificati e sono elencati nella Tabella 1. L'attività antimicrobica dei composti contro i macrofagi infetti da Mab è stata valutata utilizzando la fluorescenza intrinseca dei batteri come lettura.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composto</td>
			<td>Nome</td>
			<td>Composto</td>
			<td>Nome</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Sulfatiazolo</td>
			<td>18</td>
			<td>Cefuroxima</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>Ciprofloxacina</td>
			<td>19</td>
			<td>Rifaximina</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>21</td>
			<td>Cefdinir</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Daunorubicina</td>
			<td>22</td>
			<td>Claritromicina</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Doxorubicina</td>
			<td>23</td>
			<td>Besifloxacina</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>Thiostrepton</td>
			<td>24</td>
			<td>Levofloxacina</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>Amikacina</td>
			<td>25</td>
			<td>Rifabutina</td>
		</tr><tr><td>11</td>
			<td>Moxalattamo</td>
			<td>26</td>
			<td>Gatifloxacina</td>
		</tr><tr><td>12</td>
			<td>Sulfametismo</td>
			<td>27</td>
			<td>Epirubicina</td>
		</tr><tr><td>13</td>
			<td>Sulfamonometossina</td>
			<td>28</td>
			<td>Pirvinio pamoato</td>
		</tr><tr><td>14</td>
			<td>Cefoxitina</td>
			<td>29</td>
			<td>Moxifloxacina</td>
		</tr><tr><td>15</td>
			<td>Novobiocin</td>
			<td>30</td>
			<td>Troleandomicina</td>
		</tr><tr><td>16</td>
			<td>Cefmetazolo</td>
			<td>31</td>
			<td>Lincomicina</td>
		</tr><tr><td>17</td>
			<td>Roxitromicina</td>
			<td>32</td>
			<td>Spiramicina</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Elenco dei composti testati nel test di infezione. I composti convalidati nella fase 4 sono stati testati nel test di infezione (fase 5).
La tossicità dei composti nei confronti dei macrofagi infetti da Mab è stato il primo parametro valutato. La soglia stabilita per ritenere un composto tossico o non tossico era l'85% dei macrofagi vitali (Figura 5). Dei ventotto composti testati, 4, 5, 6, 27 e 28 sono stati ritenuti tossici. (Figura 5). Pertanto, questi cinque composti sono stati esclusi dalla seguente valutazione dell'attività intramacrofagica.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig05.jpg"> Figura 5: Tossicità dei colpi nei confronti dei macrofagi infetti da Mab. I BMM di topi BALB/c sono stati infettati con Mab (MOI=1) e incubati con ogni hit precedentemente identificato a 13,3 μM, 6,66 μM e 3,3 μM (1,3%, 0,7% e 0,3% di DMSO, rispettivamente) per 48 ore a 37 °C con 7% di CO2. Le cellule sono state visualizzate in un microscopio a fluorescenza ad alto contenuto, utilizzando il numero di nuclei (colorati con DAPI) per misurare la vitalità cellulare. Il grafico mostra le percentuali di macrofagi infetti vitali trattati rispetto ai macrofagi infetti vitali non trattati di due esperimenti indipendenti. I simboli rotondi rappresentano la vitalità della cellula per ogni test. Le barre rappresentano la media di due esperimenti indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per dedurre l'attività intramacrofagica dei restanti ventitré composti contro il Mab intracellulare (Figura 6), la formula Mycoload (precedentemente spiegata nella fase 6) è stata utilizzata per ottenere la percentuale di vitalità micobatterica normalizzata ai macrofagi infetti non trattati. La maggior parte dei composti ha perso il proprio potenziale terapeutico contro i micobatteri internalizzati (Figura 6) rispetto al test di convalida dei risultati (Figura 4), poiché il numero di risultati si è ridotto da venticinque a sei alla massima concentrazione testata. Sorprendentemente, tutti e tre i composti che hanno aumentato la vitalità del Mab planctonico rispetto ai batteri non trattati (30, 31 e 32; Figura 3 e Figura 4) hanno mostrato attività antimicobatterica contro il Mab intracellulare, con i composti 30 e 32 che presentano una differenza statistica significativa rispetto al DMSO, anche a 3,3 μM nel caso del composto 32 (Figura 6). I micobatteri trattati con i composti 11 e 23 hanno mostrato vitalità &lt;50% a 13,3 μM; tuttavia, questo non era significativamente diverso dal controllo DMSO (Figura 6). I composti 21, 26 e 29 erano abbastanza potenti a 13,3 μM da giustificare una differenza statistica significativa, con 29 che era il più attivo (Figura 6). Infine, i composti 17, 22 e 25 sono risultati estremamente potenti in tutte le concentrazioni testate contro i micobatteri internalizzati. Questi sono stati identificati rispettivamente come roxitromicina, claritromicina e rifabutina (Tabella 1). Dei tre composti, la claritromicina è risultata la più attiva contro il Mab, con una vitalità micobatterica che non ha mai superato il 10%, presentando un valore p di &lt;0,0001 in tutte le concentrazioni testate rispetto al DMSO (Figura 6).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig06.jpg"> Figura 6: Attività intramacrofagica dei Hits contro i macrofagi infetti da Mab. I BMM dei topi BALB/c sono stati infettati con Mab (MOI=1) e incubati con ogni hit precedentemente identificato a 13,3, 6,66 e 3,3 μM (1,3, 0,7 e 0,3% di DMSO, rispettivamente) per 48 ore a 37 °C con CO2 al 7%. Le cellule sono state visualizzate in un microscopio a fluorescenza ad alto contenuto e il segnale fluorescente è stato utilizzato per calcolare il Mycoload (vedi passaggio 6). Il grafico mostra le percentuali di Mycoload riscontrate nei macrofagi infetti trattati rispetto ai macrofagi infetti non trattati in due esperimenti indipendenti. Le statistiche sono state eseguite utilizzando l'ANOVA a due vie con il test di confronto multiplo di Dunnet; *, p &lt; 0,05; **, p &lt; 0,01; , p &lt; 0,001; , p &lt; 0,0001 rispetto al DMSO (controllo del solvente). Gli asterischi seguono lo stesso codice colore per ogni concentrazione della legenda del grafico. I simboli rotondi rappresentano il Mycoload per ogni test. Le barre rappresentano la media di due esperimenti indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura 1 supplementare: Esempio di layout di una piastra a 384 pozzetti utilizzato nella valutazione del fattore Z'. Bianco - pozzetti vuoti (solo terreno di crescita liquido); giallo - controllo positivo (batteri trattati con un antibiotico); rosso - controllo negativo (batteri non trattati). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 2 supplementare: Esempio di layout di piastre a 384 pozzetti utilizzato nello screening della libreria. Bianco - pozzetti vuoti (solo terreno di crescita liquido); verde - controllo dei solventi; rosso - controllo negativo (batteri non trattati); blu - composti da vagliare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 3 supplementare: Esempio di layout di piastra a 384 pozzetti utilizzato per la convalida dell'hit. Bianco - pozzetti vuoti (solo terreno di crescita liquido); verde - controllo del solvente (in duplicati); rosso - controllo negativo (batteri non trattati); blu - composti da vagliare (in duplicati). I colori sbiaditi rappresentano diluizioni seriali 1:2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura 4 supplementare: Esempio di layout di piastra a 96 pozzetti utilizzato per un test di infezione. Bianco - pozzetti vuoti (acqua per prevenire l'evaporazione); rosso - controllo negativo (macrofagi non trattati); giallo - controllo positivo (macrofagi trattati con un antibiotico); verde - controllo dei solventi; blu - composti da testare. I colori sbiaditi rappresentano diluizioni seriali 1:2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 5: Protocollo di analisi delle immagini. In questo lavoro viene utilizzato un protocollo dettagliato di analisi delle immagini, che può essere adattato a software open source. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%205.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

assay-development-for-high-throughput-drug-screening-against

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra un test per valutare l'efficacia dei farmaci contro l'infezione da Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Viene generato un modello di infezione in vitro contenente aggregati di Mtb/macrofagi che imita l'infezione in vivo. Dopo l'introduzione di antibiotici adeguati, la loro efficacia viene testata tramite il dosaggio della resuzarina per monitorare la sopravvivenza dei batteri con l'aumentare delle concentrazioni di farmaci.

Un test per valutare l'efficacia di un farmaco contro un modello di infezione da Mycobacterium tuberculosis

Qui descriviamo un saggio fenotipico applicabile agli schermi ad alta produttività /alto contenuto di RNA sintetico (siRNA), composto chimico e librerie mutanti Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo si basa sul rilevamento di Mycobacterium tuberculosis con etichetta fluorescente all'interno di una cellula ospite etichettata fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alto rendimento modulare per scoprire nuovi composti contro Mycobacterium tuberculosis, il targeting intracellulare e in brodo coltura di batteri e citotossicità contro la cellula ospite di mammifero.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nuovi modelli e saggi che migliorerebbero il processo di sviluppo precoce dei farmaci antitubercolari di prossima generazione sono altamente auspicabili. Qui, descriviamo un test rapido, economico e compatibile con BSL-2 per valutare l'efficacia del farmaco contro il Mycobacterium tuberculosis che può essere facilmente adattato per lo screening ad alto rendimento.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Descriviamo una singola cellula saggio ad alta prestazione per misurare la citotossicità delle cellule T quando incubati con cellule tumorali bersaglio. Questo metodo impiega una densa matrice elastomerica di sub-nanolitri pozzetti (~ 100.000 pozzetti / matrice) per confinare spazialmente le cellule T e le cellule bersaglio con rapporti definiti ed è accoppiato al microscopio a fluorescenza per monitorare effettore-bersaglio coniugazione e apoptosi successiva.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Tre saggi, tra cui l'effetto citopatico (CPE) a base di test, analisi dose-risposta e Time-of-Addition (ToA) test sono stati sviluppati, ottimizzati, validati ed utilizzati per identificare nuovi farmaci antivirali contro il virus della Bluetongue (BTV), nonché per determinare il meccanismo d'azione possibile (MOA) per i farmaci antivirali di nuova identificazione.

Saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

Saggi in vitro per misurare la replicazione del virus sono state notevolmente migliorate dallo sviluppo di virus a RNA ricombinanti esprimenti luciferasi o altri enzimi in grado di bioluminescenza. Qui i dettagli di una pipeline screening ad alto rendimento che unisce tali ceppi ricombinanti di morbillo e virus chikungunya per isolare antivirali ad ampio spettro di librerie chimiche.

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

Qui si descrive la citotossicità cellulare e singoli saggi di infettività rotonde che consentono lo screening rapido e preciso dei composti di determinare la loro citotossicità cellulare (CC 50) e valori di IC 50 contro WT e resistente di HIV-1 farmaco.

Screening rapido di HIV trascrittasi inversa e inibitori dell&#39;integrasi

Questo protocollo descrive un test qRT-PCR ad alto rendimento per l'analisi delle firme di espressione dell'IFN di tipo I e III. Il test discrimina le differenze di una singola coppia di basi tra i trascritti altamente simili di questi geni. Grazie all'assemblaggio in batch e al pipettaggio robotizzato, i saggi sono coerenti e riproducibili.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Scopri un protocollo di screening ad alto rendimento per Mycobacterium abscessus utilizzando ceppi reporter doppi e automazione robotica. Questo metodo accelera la scoperta di nuovi farmaci efficaci contro infezioni resistenti.

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Esplora altri video