Preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica
26 luglio 2024
Descriviamo i protocolli per la preparazione di sospensioni a singola cellula di cellule epiteliali timiche-di topo e la colorazione di molecole intracellulari per l'analisi citofluorimetrica.
Le cellule T sono cellule immunitarie che proteggono il nostro corpo dalle malattie infettive e dal cancro. Il timo è un organo che produce cellule T e seleziona le cellule T in via di sviluppo in base ai componenti del corpo. Siamo interessati a come il timo produce e seleziona le cellule T che sono protettive per il nostro corpo e tuttavia tolleranti per il corpo.
Il nostro laboratorio ha contribuito all'analisi delle cellule epiteliali del timo, che hanno un ruolo chiave nella produzione e selezione delle cellule T nel timo. L'analisi a livello di singola cellula delle cellule epiteliali del timo ci ha aiutato a comprendere meglio il meccanismo molecolare dello sviluppo e della selezione delle cellule T. Le cellule epiteliali del timo sono molto diverse tra loro, con strutture complesse, il che rende difficile il loro isolamento.
L'attuale tecnologia per l'isolamento delle sospensioni a cella singola è limitata e necessita di miglioramenti. Anche così, l'isolamento di singole cellule epiteliali timiche migliora la nostra comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nel loro sviluppo e funzione. Speriamo che il nostro studio contribuisca alla comprensione della generazione e della rigenerazione delle cellule immunitarie.
Crediamo che servirà come una pietra miliare importante per il progresso della salute umana. Dopo aver raccolto il timo dal topo, metterlo in cinque millilitri di RPMI 1640 contenente 10 millimolari di HEPES in un piatto di plastica da 60 millimetri su ghiaccio. Sotto un microscopio da dissezione, usa una pinzetta curva a punta fine per rimuovere sangue, non timo e tessuti adiposi.
Tagliate il timo a pezzetti con le forbici da dissezione. Trasferire i pezzi di timo in una provetta da 15 millilitri contenente tre millilitri di un milligrammo per millilitro di collagenasi e dispasi e un'unità per millilitro di DNasi in RPMI 1640 contenente il 2% di FBS. Incubare la provetta a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Quindi miscelare la sospensione utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da tre millilitri e continuare l'incubazione per circa 30 minuti o fino a quando i frammenti di tessuto non sono visibili. Aggiungere cinque millilitri di EDTA da cinque millimolari in HBSS contenente l'1% di FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 micron in un nuovo tubo da 50 millilitri.
Centrifugare la sospensione a 350 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in 10 millilitri di tampone FACS. Conservare le celle sul ghiaccio e determinare il numero di celle utilizzando un contatore di celle. Dopo aver raccolto il timo da un topo neonatale, utilizzare una pinzetta curva a punta fine per rimuovere il sangue, il non timo e i tessuti adiposi.
Trasferire il timo in una provetta da 1,5 millilitri contenente 0,2 millilitri di RPMI 1640 contenente 10 millimolari di HEPES. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, scartare il terreno, quindi aggiungere 0,5 millilitri di 0,5 milligrammi per millilitro di Collagenasi e Dispasi e un'unità per millilitro di Dnasi in RPMI 1640 contenente il 2% di FBS. Incubare la provetta in un blocco termico a 37 gradi Celsius.
Durante l'incubazione, mescolare delicatamente utilizzando una pipetta da un millilitro. Dopo 10 minuti, aggiungere 0,5 millilitri di EDTA da cinque millimolari in HBSS contenente l'1% di FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 micron in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.
Aggiungere nove millilitri di RPMI 1640 contenente 10 millimolari di HEPES al tubo. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in uno o tre millilitri di tampone FACS. Conservare le celle sul ghiaccio e determinare il numero di celle utilizzando un contatore di celle.
Per iniziare, aggiungi 16 volte 10 alla potenza di 6 cellule di timo di topo neonatale o postnatale in un tubo di polistirene a fondo tondo da cinque millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 10 microlitri di concentrazione di lavoro di anticorpo monoclonale anti-recettore FC in tampone FACS.
Incubare la provetta a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere 40 microlitri ciascuno di anticorpo monoclonale anti-CD45, anticorpo monoclonale anti-EpCAM, anticorpo monoclonale anti-Ly-51 e UEA-1 nel tampone FACS. Mescolare il contenuto di una provetta e incubare a quattro gradi Celsius per 45 minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere due millilitri di tampone FACS. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in un microlitro di soluzione di colorante viola 510 fantasma. Mescolare il contenuto di una provetta e incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Ora aggiungere due millilitri di tampone FACS e centrifugare la sospensione cellulare prima di fissare le cellule con un millilitro di aldeide paraforme al 2% per 10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 3,5 millilitri di PBS al tubo. Centrifugare la sospensione cellulare a 700 G per otto minuti a quattro gradi Celsius e permeabilizzare le cellule con un millilitro di tampone di fissazione intracellulare e permeabilizzazione.
Mescolare il contenuto di una provetta e incubare a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare e aggiungere un millilitro di tampone di permeabilizzazione. Anche in questo caso, centrifugare la sospensione, prima di aggiungere 100 microlitri ciascuno di concentrazioni di lavoro di anticorpi anti-beta5t o anticorpi anti-CCL21.
Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere un millilitro di tampone di permeabilizzazione e centrifugare la sospensione cellulare a 700 G per otto minuti a quattro gradi Celsius. Ora aggiungi 100 microlitri di concentrazioni di lavoro di IgG anti-coniglio e incuba per 30 minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver aggiunto il tampone di permeabilizzazione, centrifugare la sospensione cellulare. Risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone FACS e mescolare bene. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 micron prima dell'analisi citofluorimetrica.
I profili citometrici a flusso delle cellule di timo digerite da collagenasi e dispasi da topi di zero giorni e topi di due settimane hanno dimostrato che oltre il 90% dei segnali di particolato rappresentava cellule vitali. I segnali fluorescenti delle cellule vitali erano rappresentati da CD45 ed EpCAM. Durante le fasi neonatali, i cTEC erano più frequenti dei mTEC, ma dopo la nascita i mTEC hanno dominato a causa della bassa efficienza di liberazione dei cTEC.
La fissazione e la permeabilizzazione delle cellule consentono la rilevazione di molecole intracellulari all'interno delle TEC. L'espressione di beta5t è stata rilevata nella maggior parte dei cTEC, ma non nei mTEC. CCL21 è stato rilevato in una frazione di mTEC ma non nei cTEC.
In confronto, l'aria era espressa in una sottopopolazione di mTEC.
Panoramica
In questo articolo vengono descritti i protocolli per la preparazione di sospensioni di singole cellule epiteliali timiche di topo e il loro successivo analisi mediante citometria a flusso. Comprendere queste cellule è fondamentale per ottenere informazioni sullo sviluppo e la selezione dei linfociti T.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Citometria in flusso
Sfondo
- I linfociti T sono cellule immunitarie fondamentali che proteggono contro le malattie.
- Il timo è responsabile della produzione e della selezione dei linfociti T.
- Le cellule epiteliali timiche svolgono un ruolo chiave nello sviluppo dei linfociti T.
- L'analisi a singola cellula contribuisce a comprendere i meccanismi di selezione dei linfociti T.
Scopo dello studio
- Analizzare le cellule epiteliali timiche a livello singola cellula.
- Comprendere i meccanismi molecolari coinvolti nello sviluppo dei linfociti T.
- Migliorare le tecniche di isolamento per le diverse cellule epiteliali timiche.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di sospensioni di singole cellule da cellule epiteliali timiche di topo.
- Colorazione di molecole intracellulari.
- Analisi citofluorimetrica per un esame dettagliato.
- Utilizzo di tecniche avanzate di isolamento.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di diversi tipi di cellule epiteliali timiche.
- Migliore comprensione dei meccanismi di sviluppo dei linfociti T.
- La citometria a flusso ha fornito informazioni sull'espressione di molecole intracellulari.
- Sono stati stabiliti protocolli per la ricerca futura in biologia dei linfociti T.
Conclusioni
- Lo studio contribuisce alla comprensione delle funzioni delle cellule epiteliali timiche.
- I protocolli possono essere applicati a ulteriori ricerche in immunologia.
- Le conoscenze acquisite potrebbero portare a progressi nelle terapie con cellule T.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La preparazione di sospensioni cellulari singole e la colorazione intracellulare delle cellule epiteliali timiche di topo (TEC) consentono un'analisi precisa dei meccanismi di sviluppo dei linfociti T a livello cellulare. Questo flusso di lavoro supporta la riduzione del rischio meccanicistico e la validazione degli obiettivi per programmi di scoperta incentrati sull'immunologia, in particolare quando la selezione e la tolleranza guidate dalle TEC sono fondamentali. Un'analisi affidabile mediante citometria a flusso delle sottopopolazioni di TEC orienta le decisioni di portafoglio nelle fasi iniziali e la continuità traslazionale nelle strategie di modulazione immunitaria.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Consente la validazione funzionale di molecole espresse da TEC coinvolte nella selezione e tolleranza dei linfociti T.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistico distinguendo i contributi delle TEC corticali e midollari alla modellazione del repertorio immunitario.
- Fornisce dati quantitativi per guidare la priorizzazione degli obiettivi e le valutazioni di plausibilità biologica.
Screening e sviluppo di saggi
- Stabilisce sospensioni cellulari singole standardizzate per saggi citofluorimetrici riproducibili.
- Permette una rilevazione robusta di marcatori intracellulari come beta5t e CCL21 in sottogruppi definiti di TEC.
- Consente la scalabilità dei saggi e la comparabilità tra studi per piattaforme di profilazione delle cellule immunitarie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per le malattie caratterizzando i meccanismi mediati dalle TEC alla base della tolleranza immunitaria.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di bersagli per la modulazione immunitaria.
- Fornisce una base per lo sviluppo di biomarcatori associati alla funzione delle TEC e alla selezione dei linfociti T.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo un'analisi ad alta risoluzione delle sottopopolazioni di TEC e delle loro firme molecolari.
- Biologia della scoperta: Permette di avanzare nella verifica delle ipotesi sui meccanismi di selezione e tolleranza dei linfociti T mediati dalle cellule epiteliali timiche (TEC).
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili mediante citometria a flusso per l'espressione dei marcatori delle TEC.
- Analisi: Offre dati con risoluzione a singola cellula per l'analisi comparativa dei sottogruppi di TEC e della prevalenza dei marcatori.
- Ricerca traslazionale: Collega le conoscenze meccanicistiche a modelli preclinici di modulazione immunitaria e tolleranza.
- Riutilizzo aziendale: Offre un protocollo riutilizzabile per l'isolamento e l'analisi delle TEC in diversi programmi di ricerca e sviluppo in immunologia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli antigeni immunologici e riduce l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di selezione dei linfociti T.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento delle TEC e la colorazione intracellulare per flussi di lavoro di citometria a flusso riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di proseguimento o interruzione fornendo dati solidi sui meccanismi immunitari indotti dalle TEC.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei bersagli di modulazione immunitaria sulla base di meccanismi cellulari validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissociazione dei tessuti, nella citometria a flusso e nei protocolli di colorazione intracellulare.
- Richiede l'accesso a strumentazione citofluorimetrica avanzata e a software analitici.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra gruppi di lavoro delle procedure di preparazione e colorazione delle cellule per garantire la comparabilità dei dati.
- Potrebbe richiedere adattamenti in base all'età dei topi o alla frequenza delle sottopopolazioni di cellule epiteliali timiche (TEC).
- I bassi tassi di recupero delle TEC (1% cTECs, 10% mTECs) potrebbero limitare la produttività e la dimensione del campione.
