Name: Preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Scopri la preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e la colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica. Questo metodo avanza la comprensione dello sviluppo dei linfociti T.

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Ringraziamo il Dr. Izumi Ohigashi per aver letto il manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale ZIA BC 011806 del National Institutes of Health, dal National Cancer Institute e dal Center for Cancer Research.

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti sotto l'approvazione del Comitato per la cura e l'uso degli animali del National Cancer Institute (ASP21-431, ASP21-432 e EIB-076-3).
1. Preparazione della sospensione di cellule del timo
NOTA: L'ontogenesi del topo influenza l'efficienza della liberazione enzimatica dei TEC dal timo. Di seguito sono descritti tre metodi a seconda dell'età del topo.
<ol>
	<li>Per topi postnatali di età superiore a 3 settimane
	<ol>
		<li>Raccogli il timo (due lobi del timo) da un topo. Mettere il timo in 5 mL di RPMI1640 contenente 10 mM di HEPES in una capsula di plastica da 60 mm su ghiaccio.</li>
		<li>Rimuovere il sangue, i tessuti non timotici e il grasso con una pinzetta curva a punta fine al microscopio da dissezione. Tagliare il timo a pezzetti (di circa 1-2 mm di dimensione) con le forbici da dissezione.</li>
		<li>Trasferire i pezzi di timo in una provetta conica da 15 mL contenente 3 mL di 1 mg/mL di collagenasi/dispasi e 1 U/mL di soluzione di DNasi in RPMI1640 contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS). Incubare a bagnomaria o blocco termico a 37 °C per 20 min.</li>
		<li>Mescolare delicatamente utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da 3 mL. Incubare per altri 20 minuti nel caso in cui i frammenti di tessuto siano ancora visibili.</li>
		<li>Mescolare delicatamente utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da 3 mL. Incubare per altri 10 minuti nel caso in cui i frammenti di tessuto siano ancora visibili.</li>
		<li>Mescolare delicatamente utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da 3 mL. Aggiungere 5 mL di EDTA 5 mM in 1x HBSS contenente l'1% di FBS.</li>
		<li>Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 μm e in una nuova provetta conica da 50 mL. Centrifugare la sospensione cellulare a 350 × g a 4 °C per 5 minuti.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di tampone FACS (1x HBSS contenente l'1% di albumina sierica bovina [BSA] e lo 0,1% di NaN3).</li>
		<li>Conservare le celle sul ghiaccio e determinare il numero di celle utilizzando un contatore di celle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per topi neonati di età compresa tra 1 e 2 settimane
	<ol>
		<li>Eseguire il passaggio 1.1.1.</li>
		<li>Rimuovere il sangue e i tessuti non timici con una pinzetta da dissezione al microscopio da dissezione. Trasferire il timo in una provetta di plastica da 1,5 ml contenente 200 μl di RPMI1640 con 10 mM HEPES e tagliare il timo in piccoli pezzi (di circa 1-2 mm di dimensione) con le forbici da dissezione.</li>
		<li>Lasciare che i frammenti di timo si depositino sul fondo della provetta, quindi rimuovere delicatamente la sospensione con una micropipetta da 200 μl.</li>
		<li>Trasferire i pezzi di timo in una provetta a fondo tondo in polipropilene da 5 mL contenente 2 mL di 0,5 mg/mL di Collagenasi/Dispasi e 1 U/mL di soluzione di DNasi in RPMI1640 contenente il 2% di FBS. Incubare a bagnomaria o blocco termico a 37 °C per 10 min.</li>
		<li>Miscelare delicatamente utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da 3 mL e quindi con una micropipetta da 1 mL dotata di un puntale in plastica per un'ulteriore omogeneizzazione.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di EDTA da 5 mM in 1x HBSS contenente l'1% di FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 μm e in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere 16 mL di RPMI1640 contenente 10 mM HEPES.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 350 × g a 4 °C per 5 minuti. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di tampone FACS.</li>
		<li>Conserva le celle sul ghiaccio e determina il numero di celle utilizzando un contatore di celle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Per topi embrionali e topi neonati fino a 1 settimana di età
	<ol>
		<li>Raccogli il timo (due lobi del timo) da un topo. Metti il timo in un piatto di plastica da 60 mm e rimuovi il sangue, i tessuti non timonici e il grasso con una pinzetta a punta fine curva al microscopio da dissezione.</li>
		<li>Mettere il timo in 0,2 mL di RPMI1640 contenente 10 mM di HEPES in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Eliminare il liquido con una micropipetta da 200 μl.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di 0,5 mg/mL di Collagenasi/Dispasi e 1 U/mL di soluzione di DNasi in RPMI1640 contenente il 2% di FBS. Incubare a bagnomaria o blocco termico a 37 °C per 10 min. Miscelare delicatamente utilizzando una micropipetta da 1 ml con puntale in plastica.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 mL di EDTA 5 mM in 1x HBSS contenente l'1% di FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 μm e in una nuova provetta conica da 15 mL. Aggiungere 9 mL di RPMI1640 contenente 10 mM HEPES.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 350 × g a 4 °C per 5 minuti. Risospendere il pellet cellulare in 1-3 mL di tampone FACS.</li>
		<li>Conserva le celle sul ghiaccio e determina il numero di celle utilizzando un contatore di celle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metodo alternativo: Liberare la digestione
	<ol>
		<li>Eseguire i passaggi 1.1.1 e 1.1.2.</li>
		<li>Lasciare che i frammenti di timo si depositino sul fondo della provetta, quindi rimuovere delicatamente la sospensione con una micropipetta da 200 μl. Trasferire i pezzi di timo in una provetta da 5 mL contenente 1 mL di 0,5 U/mL di Liberase e 1 U/mL di DNasi in RPMI1640 contenente 10 mM di HEPES. Incubare a bagnomaria o blocco termico a 37 °C per 15 min.</li>
		<li>Miscelare delicatamente utilizzando una micropipetta da 1 ml con puntale in plastica. Incubare per altri 15 minuti nel caso in cui i frammenti di tessuto siano ancora visibili.</li>
		<li>Miscelare delicatamente utilizzando una micropipetta da 1 ml con puntale in plastica. Aggiungere 1 mL di 5 mM EDTA in 1x HBSS contenente l'1% di FBS.</li>
		<li>Filtrare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon da 60 μm e in una nuova provetta conica da 50 mL. Aggiungere 18 mL di RPMI1640 contenente 10 mM HEPES.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 350 × g, 4 °C per 5 minuti. Risospendere le cellule in 10 mL di tampone FACS (1x HBSS contenente l'1% di BSA e lo 0,1% di NaN3).</li>
		<li>Conserva le celle sul ghiaccio e determina il numero di celle utilizzando un contatore di celle.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Colorazione degli anticorpi delle cellule del timo
<ol>
	<li>Mettere 16 × 106 cellule in una provetta di polistirene a fondo tondo da 5 mL. Centrifugare le celle a 350 × g a 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 10 μl di concentrazione di lavoro di anticorpo monoclonale anti-recettore Fc (mAb, clone 2.4G2) nel tampone FACS per bloccare il legame non specifico delle IgG coloranti al recettore Fc della superficie cellulare. Incubare a 4 °C per 5 min.</li>
	<li>Aggiungere 40 μl ciascuno di concentrazioni operative di anticorpi monoclonali anti-CD45 (ematopoietici specifici per le cellule; ad es. marcati con BV421), anticorpi monoclonali anti-EpCAM (epiteliali specifici per le cellule; ad es. marcati con PE-Cy7), anticorpi monoclonali anti-Ly51 (che rilevano cTEC; ad esempio, marcati con AF647) e Ulex europaeus agglutinina I (UEA-1) (che rilevano mTEC; ad esempio, marcati con AF594) nel tampone FACS. Parallelamente, preparare le provette per le cellule colorate in un solo colore e le cellule non colorate per l'impostazione di un citometro a flusso.</li>
	<li>Incubare a 4 °C per 45 minuti. Mescolare bene ogni 10 minuti. Aggiungere 2 mL di tampone FACS.</li>
	<li>Centrifugare le celle 350 × g a 4 °C per 5 min. Eliminare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 1 μl di colorante Ghost Violet 510 (per distinguere le cellule vitali da quelle morte nell'analisi citofluorimetrica di cellule fissate e permeabili). Utilizzare il reagente Ghost Dye non diluito; Mescolate bene. Incubare a 4 °C per 30 min; Mescolare bene ogni 10 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 2 ml di tampone FACS. Centrifugare le celle 350 × g a 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Fissare le cellule aggiungendo 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 2% in PBS e incubando a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
	<li>Aggiungere 3,5 mL di PBS alla provetta e centrifugare le celle 700 × g a 4 °C per 8 minuti. Eliminare il surnatante.</li>
	<li>Permeabilizzare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone di fissazione/permeabilizzazione intracellulare e incubando a 4 °C per 20 minuti.</li>
	<li>Centrifugare le celle da 700 × g a 4 °C per 8 minuti. Eliminare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione 1x. Centrifugare le celle a 700 × g a 4 °C per 8 min. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 100 μl di concentrazioni di lavoro di anticorpi anti-beta5t o anticorpi anti-CCL21, o 40 μl di concentrazioni di lavoro di anticorpi anti-Aire (ad es. marcati con AF488), in 1x tampone di permeabilizzazione, mescolare bene e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione 1x. Centrifugare le celle a 700 × g a 4 °C per 8 min. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.14.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di concentrazioni operative di IgG anti-coniglio (ad es. marcate con AF555) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione 1x. Centrifugare le celle a 700 × g a 4 °C per 8 min. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS e mescolare bene.</li>
	<li>Conservare le cellule al buio a 4 °C fino all'analisi citofluorimetrica.</li>
	<li>Filtrare le celle attraverso una rete di nylon da 60 μm prima dell'analisi citofluorimetrica.</li>
</ol>

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

<ol><li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire%3A+what+thymocytes+see+%28and+don%27t+see%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see).</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).</li>
<li>Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+diversity+in+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of diversity in thymic epithelial cells.</a> Nat Rev Immunol. 17 (5), 295-305 (2017).</li>
<li>Hozumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-like+4+is+indispensable+in+thymic+environment+specific+for+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Delta-like 4 is indispensable in thymic environment specific for T cell development.</a> J Exp Med. 205 (11), 2507-2513 (2008).</li>
<li>Koch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-like+4+is+the+essential%2C+nonredundant+ligand+for+Notch1+during+thymic+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Delta-like 4 is the essential, nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment.</a> J Exp Med. 205 (11), 2515-2523 (2008).</li>
<li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD8%2B+T+cell+development+by+thymus-specific+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes.</a> Science. 316 (5829), 1349-1353 (2007).</li>
<li>Ripen, A. M., Nitta, T., Murata, S., Tanaka, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+thymic+cortical+epithelial+cells+expressing+the+thymoproteasome+subunit+%CE%B25t%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of thymic cortical epithelial cells expressing the thymoproteasome subunit β5t.</a> Eur J Immunol. 41 (5), 1278-1287 (2011).</li>
<li>Gommeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+serine+protease+regulates+positive+selection+of+a+subset+of+CD4%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4+ thymocytes.</a> Eur J Immunol. 39 (4), 956-964 (2009).</li>
<li>Viret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+serine+protease+contributes+to+the+diversification+of+the+functional+endogenous+CD4+T+cell+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific serine protease contributes to the diversification of the functional endogenous CD4 T cell receptor repertoire.</a> J Exp Med. 208 (1), 3-11 (2011).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Aire.</a> Annu Rev Immunol. 27, 287-312 (2009).</li>
<li>Takaba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+orchestrates+a+thymic+program+of+self-antigen+expression+for+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune tolerance.</a> Cell. 163 (4), 975-987 (2015).</li>
<li>Takaba, H., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+T+cell+selection+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of T cell selection in the thymus.</a> Trends Immunol. 38 (11), 805-816 (2017).</li>
<li>Lammers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ehf+and+Fezf2+regulate+late+medullary+thymic+epithelial+cell+and+thymic+tuft+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ehf and Fezf2 regulate late medullary thymic epithelial cell and thymic tuft cell development.</a> Front Immunol. 14, 1277365(2024).</li>
<li>Ushio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+diverse+thymic+medullary+epithelial+cells+interplay+to+direct+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Functionally diverse thymic medullary epithelial cells interplay to direct central tolerance.</a> Cell Rep. 43 (4), 114072(2024).</li>
<li>Kozai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+CCL21+in+establishment+of+central+self-tolerance+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells.</a> J Exp Med. 214 (7), 1925-1935 (2017).</li>
<li>Lkhagvasuren, E., Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+%CE%B2+receptor+regulates+the+development+of+CCL21-expressing+subset+of+postnatal+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin β receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells.</a> J Immunol. 190 (10), 5110-5117 (2013).</li>
<li>Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularity+of+thymic+epithelial+cells+in+the+postnatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellularity of thymic epithelial cells in the postnatal mouse.</a> J Immunol. 200 (4), 1382-1388 (2018).</li>
<li>Hirakawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+parameters+of+the+developing+thymic+epithelium+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fundamental parameters of the developing thymic epithelium in the mouse.</a> Sci Rep. 8 (1), 11095(2018).</li>
<li>Venables, T., Griffith, A. V., DeAraujo, A., Petrie, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+epithelial+cell+morphology+control+thymic+organ+size+during+atrophy+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy and regeneration.</a> Nat Commun. 10 (1), 4402(2019).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+nurse+cells+provide+microenvironment+for+secondary+T+cell+receptor+%CE%B1+rearrangement+in+cortical+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor α rearrangement in cortical thymocytes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (50), 20572-20577 (2012).</li>
<li>Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thymic+stromal+cell+populations+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 260 (1-2), 15-28 (2002).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li>
<li>Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+T+cell+maturation+on+defined+thymic+stromal+cell+populations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro.</a> J Exp Med. 176 (3), 845-853 (1992).</li>
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<li>Wells, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transient+ablation+and+single-cell+RNA-sequencing+reveals+the+development+of+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Combined transient ablation and single-cell RNA-sequencing reveals the development of medullary thymic epithelial cells.</a> eLife. 9, e60188(2020).</li>
<li>Hubert, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+anti-Aire+antibody+reveals+aire+expression+is+restricted+to+medullary+thymic+epithelial+cells+and+not+expressed+in+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A specific anti-Aire antibody reveals aire expression is restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery.</a> J Immunol. 180 (6), 3824-3832 (2008).</li>
<li>Nishikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+lineage+tracing+of+Aire-expressing+cells+reveals+a+requirement+for+Aire+in+their+maturation+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Temporal lineage tracing of Aire-expressing cells reveals a requirement for Aire in their maturation program.</a> J Immunol. 192 (6), 2585-2592 (2014).</li>
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<li>Cosway, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+thymus+medulla+specialization+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Redefining thymus medulla specialization for central tolerance.</a> J Exp Med. 214 (11), 3183-3195 (2017).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

La collagenasi, con o senza Dispasi, è ampiamente utilizzata per digerire il timo di topo per preparare i TEC 4,5,9,18,21. Liberase, che contiene una miscela di proteasi tra cui la collagenasi, viene utilizzato anche per digerire il timo per preparare i TEC17,22. L'uso di collagenasi e liberasi offre rese e qualità sostanzialmente equivalenti di cTEC e mTEC del timo di topo, anche se possono comparire piccole differenze a seconda del lotto di prodotti degli enzimi. La tripsina viene utilizzata anche per un'efficiente digestione del timo21,23, sebbene sia stato dimostrato che molte molecole della superficie cellulare, tra cui EpCAM e CD80 espresse dai TEC, sono suscettibili alla digestione della tripsina21. Per la digestione enzimatica del timo, la DNasi viene spesso aggiunta per ridurre la viscosità a causa del rilascio di DNA dalle cellule danneggiate17,21.
La digestione enzimatica del timo è essenziale per la liberazione dei TEC dal timo. Il timo deve essere digerito a sufficienza fino a quando i frammenti di tessuto diventano invisibili e la sospensione cellulare appare omogenea. Tuttavia, la digestione non deve essere lasciata troppo a lungo perché un trattamento enzimatico eccessivo danneggia le cellule e diminuisce la vitalità cellulare. In ogni esperimento, è importante prestare particolare attenzione al periodo di incubazione e alla forza di pipettaggio durante la digestione del timo. È anche importante essere consapevoli che l'attuale tecnologia di digestione enzimatica consente la liberazione solo di una piccola frazione di TEC, come dettagliato nell'Introduzione e come riportato in precedenza 17,18,19.
Poiché i TEC sono rari nella sospensione totale di cellule del timo, l'analisi citofluorimetrica dei TEC utilizzando la sospensione totale di cellule del timo richiede la colorazione di molte cellule, in genere 8 × 106-16 × 106 cellule per misurazione.
I TEC derivati da cellule di timo digerite con enzimi possono essere arricchiti utilizzando perle magnetiche anti-CD4522 e/o centrifugazione a gradiente di densitàPercoll 31. Queste procedure di arricchimento consentono di risparmiare tempo, soprattutto quando i TEC vengono successivamente purificati su un selezionatore di cellule citofluorimetriche. Va anche notato che l'arricchimento anti-CD45 rimuoverebbe una sottopopolazione di TEC che sono strettamente associati ai timociti20 che esprimono CD45 e la centrifugazione di Percoll potrebbe rimuovere una sottopopolazione inaspettatamente densa di TEC.
Per quanto riguarda la fissazione dei TEC, è noto che il trattamento con PFA restringe le cellule e riduce l'intensità di dispersione diretta nell'analisi citofluorimetrica. Un pipettaggio delicato delle cellule subito dopo l'aggiunta del 2% di PFA e la successiva aggiunta di PBS può aiutare a prevenire un eccessivo restringimento delle cellule.
Per l'analisi citofluorimetrica, data la rara presenza di TEC all'interno del timo, la loro delineazione richiede un approccio distinto rispetto ai timociti o agli splenociti. La classificazione iniziale si basa sull'utilizzo di CD45, un pan-marcatore ematopoietico ubiquitario sui timociti e su altre cellule ematopoietiche, comprese le cellule dendritiche e i macrofagi. Al contrario, i TEC, essendo di origine non ematopoietica, mancano di espressione di CD45. Invece, i TEC esprimono EpCAM sulla loro superficie, consentendo così una strategia di gating diretta di CD45-negativi ed EpCAM-positivi per distinguere i TEC. Nella nostra analisi citofluorimetrica, iniziamo definendo questa popolazione e successivamente garantiamo un ridimensionamento appropriato dei parametri di dispersione diretta e laterale, data la sostanziale discrepanza dimensionale tra TEC e timociti, e date le grandi dimensioni e l'elevata autofluorescenza dei TEC.
Successivamente, l'attenzione è rivolta alla valutazione dei marcatori cTEC- e mTEC all'interno della popolazione CD45-negativa EPCAM-positiva. A causa delle dimensioni ridotte di questa popolazione, questo passaggio diventa imperativo per compensare i cTEC e i mTEC. L'esame di un pannello interamente colorato (ad esempio, il marcatore cTEC Ly51 e il marcatore mTEC UEA-1 insieme a CD45 ed EpCAM che definiscono TEC) garantisce ulteriormente l'adeguatezza della scala di dispersione. Durante la configurazione della citofluorimetria, il nostro obiettivo principale ruota attorno al discernimento delle popolazioni positive e negative per ciascun anticorpo.
Nella co-colorazione di Aire, beta5t e CCL21, vengono identificate popolazioni distinte all'interno di sottogruppi di TEC. Data l'espressione selettiva di Aire da parte degli mTEC, ci concentriamo sulla colorazione a quattro colori delle cellule CD45-negative/EPCAM-positive/UEA-1-positive/Ly51-negative. Qui, le cellule UEA-1-positive vengono utilizzate per stabilire il controllo negativo per Aire, facilitando una chiara identificazione delle cellule Aire-positive. Un approccio simile è adottato per il CCL21, che è espresso all'interno dei mTEC. Al contrario, per beta5t, espresso esclusivamente da cTEC, viene applicata una strategia di gating comparabile, con enfasi sulle cellule Ly51-positive all'interno della colorazione a quattro colori, per accertare i livelli di fondo per beta5t. La successiva analisi dei campioni colorati con anti-beta5t facilita l'identificazione di una popolazione positiva.
L'anticorpo anti-beta5t e l'anticorpo anti-CCL21 sono anticorpi di coniglio, quindi questi anticorpi non devono essere miscelati senza una previa marcatura a fluorescenza. Le concentrazioni di lavoro degli anticorpi devono essere predeterminate eseguendo l'analisi citofluorimetrica delle cellule di controllo (ad esempio, TEC di topi wild-type e knockout) colorate con diluizioni seriali di anticorpi.
Nell'analisi citofluorimetrica, i cTEC e i mTEC sono spesso definiti dall'espressione sulla superficie cellulare di Ly51 o CD205 per i cTEC e di UEA1 e CD80 per i mTEC. Tuttavia, va tenuto presente che i cTEC e i mTEC devono essere eventualmente definiti dalla loro localizzazione microanatomica nel timo. Nel timo embrionale, evidenze emergenti hanno suggerito che l'espressione di Ly51 e CD205 non è limitata ai cTEC, ma si estende ad altre popolazioni di TEC, inclusi i progenitori bipotenti cTEC/mTEC e i mTEC immaturi32,33. Inoltre, l'espressione di Ly51 nei cTEC rimane bassa durante l'embriogenesi e il periodo perinatale rispetto al periodo postnatale33, come mostrato anche nella Figura 1 e nella Figura 2.
In conclusione, l'analisi citofluorimetrica della sospensione di singole cellule liberate enzimaticamente di TEC offre una potente tecnica per l'analisi quantitativa di TEC e delle loro sottopopolazioni con risoluzione di singola cellula, nonostante la limitata efficienza della liberazione di TEC. In particolare, l'analisi citofluorimetrica di molecole intracellulari in sospensione di TEC a singola cellula è utile per studiare l'espressione di una varietà di molecole importanti per lo sviluppo e la funzione dei TEC e delle loro sottopopolazioni.

Il timo è un organo mesenchimale epiteliale che promuove lo sviluppo e la selezione del repertorio dei linfociti T. Nei microambienti corticali e midollari all'interno del timo, le cellule epiteliali timomiche (TEC) svolgono un ruolo cruciale nel dirigere lo sviluppo e la selezione delle cellule T. È ben noto che le TEC corticali (cTEC) nella corteccia timica contribuiscono principalmente all'induzione dello sviluppo precoce delle cellule T e alla selezione positiva dei timociti che esprimono il recettore dell'antigene (TCR) delle cellule T di nuova generazione. Al contrario, le TEC midollari (mTEC) nel midollo timico sono essenziali per l'attrazione di timociti selezionati positivamente dalla corteccia e l'instaurazione di un'autotolleranza centrale eliminando le cellule T autoreattive e generando cellule T regolatorie1,2. Queste funzioni dei TEC nel supportare lo sviluppo e la selezione delle cellule T sono mediate da una varietà di molecole espresse in cTEC e mTEC.
Questi includono il ligando 4 simile a Delta (DLL4), importante per la specificazione del lignaggio delle cellule T dei progenitori linfoidi)3,4, beta5t (noto anche come Psmb11, importante per la selezione positiva delle cellule T CD8)5,6, e Prss16 (noto anche come proteasi serina specifica del timo, o TSSP, importante per la selezione positiva delle cellule T CD4)7,8 espresso in cTEC e regolatore autoimmune (Aire, importante per l'espressione promiscua dei geni self)9,10, dito di zinco della famiglia Fez 2 (Fezf2, importante per l'espressione promiscua di autogeni Aire-indipendenti e la generazione di cellule del ciuffo timico)11,12,13,14, e il ligando 21 delle chemochine con motivo C-C (CCL21, importante per la migrazione midollare e l'accumulo di timociti selezionati positivamente)14,15,16 espressi in mTEC. La citometria a flusso fornisce un mezzo per rilevare quantitativamente queste molecole funzionalmente significative nei TEC, facilitando la valutazione sia dello sviluppo che della funzione di cTEC e mTEC. Poiché molte delle molecole nei TEC sono espresse principalmente all'interno delle cellule, come nel citoplasma (ad esempio, componente del proteasoma beta5t) e nel nucleo (ad esempio, regolatore trascrizionale Aire), è vantaggioso analizzare quantitativamente le molecole intracellulari nei cTEC e negli mTEC utilizzando la citometria a flusso.
I TEC sono rari nel timo. Una femmina di topo a 5 settimane di età ha circa 1 × 106 cTEC e circa 2,5 × 106 mTEC, mentre la corteccia timica contiene circa 3 × 108 timociti CD4+CD8+ e il midollo timico contiene circa 5 × 107 timociti CD4+CD8- e CD4-CD8+17. Pertanto, la stragrande maggioranza (>99%) delle cellule del timo sono cellule ematopoietiche, compresi i timociti, piuttosto che TEC, nei giovani topi adulti. Inoltre, i TEC sono strettamente associati alle cellule vicine (ad esempio, i timociti) e ai componenti extracellulari architettonici (ad esempio, il collagene) all'interno del timo, quindi la liberazione dei TEC in sospensione cellulare richiede la digestione proteasica del timo. I metodi convenzionali per la digestione enzimatica producono solo una piccola frazione di TEC; circa l'1% (1 × 104) e il 10% (2 × 105) rispettivamente per cTEC e mTEC, da timo17,18,19. La bassa efficienza della liberazione di TEC dal timo è probabilmente dovuta alla suscettibilità dei TEC agli enzimi proteolitici e allo stress meccanico e alla stretta associazione dei TEC con le cellule vicine, in particolare tra cTEC e timociti CD4+CD8+20. A questo proposito, i risultati dell'analisi su singole cellule di TEC di topo, compresa l'analisi citofluorimetrica e l'analisi di sequenziamento dell'RNA su singola cellula, basati sugli attuali metodi di preparazione cellulare mediati dalla digestione enzimatica, sono rappresentativi solo di una piccola parte dei TEC e quindi sono ben lungi dall'essere completi. Tuttavia, nonostante tali limitazioni nel recupero enzimatico dei TEC, l'analisi citofluorimetrica dei TEC di topo in sospensione a singola cellula è ancora utile per l'analisi quantitativa di molecole funzionalmente rilevanti nei cTEC e nei mTEC. Nella sospensione cellulare, le TEC sono state definite come cellule positive per la molecola di superficie epiteliale EpCAM (CD326) e negative per la molecola di superficie ematopoietica CD45. All'interno delle TEC EpCAM+CD45-, i livelli di espressione sulla superficie cellulare delle molecole Ly51 (note anche come BP-1 e CD249) e la capacità di legare l'agglutinina I (UEA1) di Ulex Europaeus (principalmente legandosi a glicoproteine e glicolipidi contenenti fucosi legati a α) sono stati utilizzati per marcare fenotipicamente cTEC (Ly51alto, UEA1basso) e mTEC (Ly51basso, UEA1alto, alto). Qui descriviamo i nostri protocolli sperimentali per la preparazione convenzionale di sospensioni monocellulari di TEC di topo e la colorazione di molecole intracellulari per l'analisi citofluorimetrica, concentrandoci sull'analisi quantitativa di molecole intracellulari beta5t, CCL21 e Aire in TEC di topo appena preparati.

<table><tbody><tr><td>Collagenasi/Dispasi</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 / Set di tamponi per colorazione del fattore di trascrizione</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Colorante fantasma viola 510&nbsp;</td><td>Tonbo</td><td>13-0870-T500</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anti-topo CD45 anticorpo monoclonale, Clone 30-F11</td><td>BD Horizon</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-topo Ly51 anticorpo monoclonale, Clone 6C3</td><td>BioLegend</td><td>108312</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-topo EpCAM/CD326 anticorpo monoclonale, Clone G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118216</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)</td><td>Vector Laboratories</td><td>DL-1067-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo monoclonale Aire anti-topo, Clone 5H12</td><td>eBioscience</td><td>53-5934-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di coniglio Psmb11/beta5t anti-topo, Clone CPTC-PSMB11 (topo)-1</td><td>NIH NCI</td><td>CPTC-PSMB11 (topo)-1</td><td>https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal</td></tr><tr><td>Anti-topo CCL21/exodus 2 anticorpo policlonale di coniglio</td><td>Bio-Rad</td><td>AAM27</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-coniglio IgG catena pesante capra ricombinante anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>A27039</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo CD32/CD16 Purificato (anticorpo a blocco Fc)</td><td>Leinco Technologies</td><td>C247</td><td></td></tr><tr><td>Rete di nylon 60 micron</td><td>Fornitura di componenti</td><td>W31436</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Blocco</td><td></td>di calore</tr><tr><td>Cellometro Auto 2000 Contatore di vitalità cellulare</td><td>Nexcelom Conteggio</td><td></td><td>delle cellule vitali</td></tr><tr><td>LSRFortessa Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>Citometro a flusso</td><td>Cinque laser (355, 408, 488, 595 e 637 nm)</td></tr><tr><td>Software FACSDiva versione 9.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>Analisi</td><td></td>citofluorimetrica</tr><tr><td>FlowJo 10.9.0</td><td>BD Biosciences</td> Analisi <td></td>dei <td>dati citofluorimetrici</td></tr><tr><td>Tasso di diluizione degli anticorpi (concentrazione di lavoro)</td><td></td>Tampone <td></td><td>di diluizione</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD32/CD16 &ndash; Purificato (anticorpo blocco Fc)</td><td>1:40</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anti-topo CD45 anticorpo monoclonale</td><td>1:25</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-topo EpCAM/CD326 anticorpo monoclonale</td><td>1:100</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-topo Ly51 anticorpo monoclonale</td><td>1:100</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)</td><td>1:400</td><td>FACS Buffer</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CCL21/exodus 2 anticorpo policlonale di coniglio</td><td>1:200 1x</td><td>Tampone</td><td></td>di permeabilizzazione</tr><tr><td>Anti-topo Psmb11/beta5t anticorpo monoclonale di coniglio, Clone CPTC-PSMB11(mouse)-1</td><td>1:1000</td><td>1x Tampone</td><td></td>di permeabilizzazione</tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-coniglio IgG anticorpo ricombinante di capra a catena pesante</td><td>1:400 1x</td><td>Tampone</td><td></td>di permeabilizzazione</tr><tr><td></td><td>Scopo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 contenente 10 mM di HEPES&nbsp;</td><td>Per la preparazione</td><td></td><td></td>di</tr><tr><td>cellule RPMI1640 contenenti il 2% di FBS</td><td>Per la preparazione</td><td></td><td></td>di cellule</tr><tr><td>tampone FACS (1x HBSS contenente l'1% di BSA&nbsp; e 0,1% di sodio azide)</td><td>Per la preparazione cellulare e la colorazione degli</td><td></td><td></td>anticorpi,</tr><tr><td>1 mg/ml di collagenasi/dispasi e 1U/ml di DNasi in RPMI1640 contenente il 2% di FBS Per la</td><td>digestione</td><td></td><td></td>enzimatica</tr>, <tr><td>il 2% di PFA in PBS</td><td>Per la fissazione</td><td></td><td></td>cellulare</tr><tr><td>, il tampone di fissazione/permeabilizzazione (1 parte di concentrato di fissazione/permeabilizzazione con 3 parti di diluente di fissazione/permeabilizzazione)</td><td>Per la fissazione cellulare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x tampone di permeabilizzazione (1 parte di concentrato 10X con 9 parti di acqua distillata)</td> <td>per la colorazione intercellulare degli anticorpi.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

Le cellule epiteliali timiche, TEC, svolgono un ruolo essenziale nel promuovere lo sviluppo e la selezione del repertorio delle cellule T. Le TEC corticali (cTEC) nella corteccia timica inducono lo sviluppo precoce delle cellule T e la selezione positiva dei timociti corticali. Al contrario, le TEC midollari (mTEC) nel midollo timico attraggono timociti selezionati positivamente dalla corteccia e stabiliscono un'autotolleranza nelle cellule T. Una varietà di molecole, tra cui DLL4 e beta5t espresse nei cTEC, così come Aire e CCL21 espresse in mTEC, contribuiscono alla funzione del timo supportando lo sviluppo e la selezione delle cellule T. L'analisi citofluorimetrica di molecole funzionalmente rilevanti in cTEC e mTEC è utile per migliorare la nostra comprensione della biologia dei TEC, anche se gli attuali metodi per la preparazione di sospensioni di singole cellule di TEC possono recuperare solo una piccola frazione di TEC (circa l'1% per i cTEC e circa il 10% per gli mTEC) dal timo di topo giovane adulto. Poiché molte di queste molecole funzionalmente rilevanti nelle TEC sono localizzate all'interno delle cellule, descriviamo i nostri protocolli per la preparazione di sospensioni di singole cellule di TEC di topo e la colorazione di molecole intracellulari per l'analisi citofluorimetrica.

L'analisi richiede un citometro a flusso che consenta il rilevamento di almeno sei canali di fluorescenza (per CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye e beta5t, CCL21 e/o Aire) nonché dei parametri di scatter anteriore e laterale. Profili citometrici rappresentativi di cellule del timo digerite con Collagenasi/Dispasi provenienti da topi di 0 giorni e da topi di 2 settimane sono mostrati rispettivamente nella Figura 1 e nella Figura 2. In entrambe le figure, il diagramma a dispersione del Pannello A mostra l'intensità dello scatter anteriore (FSC) e l'intensità di fluorescenza di Ghost Dye Violet 510 per tutti i segnali particellati. Oltre il 90% dei segnali particellati rappresenta cellule vitali, come indicato dalla colorazione negativa con il reagente Ghost Dye e dallo scatter anteriore, che riflette la dimensione cellulare. Il Pannello B mostra i segnali di fluorescenza della superficie cellulare delle cellule vitali del timo per CD45, una molecola espressa dalle cellule ematopoietiche, ed EpCAM, una molecola espressa dalle cellule epiteliali. Una popolazione cellulare piccola ma distinta risulta CD45- EpCAM+, rappresentando quindi le cellule epiteliali timiche (TEC).
<img alt="Analisi di citometria a flusso, EpCAM-PE-Cy7, CD45-BV421, popolazioni cellulari, cTECs, mTECs, visualizzazione dei dati." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66945/66945fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Profili rappresentativi di citometria a flusso di cellule timiche digerite con Collagenasi/Dispasi da topi selvatici di ceppo C57BL/6 di 0 giorni di vita. (A) Intensità della diffusione in avanti e intensità della fluorescenza di Ghost Dye Violet 510 dei segnali particellari totali. Il riquadro rosso indica i segnali delle cellule vitali. (B) Segnali di fluorescenza delle cellule vitali (riquadro rosso nel pannello A) per CD45 ed EpCAM. Il riquadro rosso indica le TECs CD45- EpCAM+. (C) Segnali di marcatura superficiale cellulare per Ly51 e UEA1 nelle TECs (riquadro rosso nel pannello B) che rivelano due popolazioni principali: cellule Ly51high UEA1low arricchite in cTECs e cellule Ly51low UEA1high arricchite in mTECs. (D-F) Rilevamento di (D) beta5t, (E) CCL21 e (F) Aire in cTECs (pannelli superiori) e mTECs (pannelli inferiori) come definito nel pannello C. Gli istogrammi grigi mostrano i profili di controllo marcati con (D,E) solo l'anticorpo secondario e (F) utilizzando cellule da topi privi di Aire. Abbreviazioni: FSC = diffusione in avanti; TECs = cellule epiteliali timiche; cTECs = TECs corticali; mTECs = TECs midollari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66945/66945fig01large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Analisi di citometria a flusso, gating delle cellule TEC, CD45-BV421, EpCAM-PE-Cy7, diagrammi a dispersione, istogrammi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66945/66945fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Profili rappresentativi di citometria a flusso di cellule timiche digerite con Collagenasi/Dispasi da topi selvatici di 2 settimane di età con background C57BL/6. (A) Intensità della diffusione in avanti e intensità di fluorescenza di Ghost Dye Violet 510 dei segnali particellari totali. Il riquadro rosso indica i segnali delle cellule vitali. (B) Segnali di fluorescenza delle cellule vitali (riquadro rosso nel pannello A) per CD45 ed EpCAM. Il riquadro rosso indica le TEC CD45- EpCAM+. (C) Segnali di marcatura superficiale cellulare per Ly51 e UEA1 nelle TEC (riquadro rosso nel pannello B) che rivelano due popolazioni principali: cellule Ly51high UEA1low arricchite in cTEC e cellule Ly51low UEA1high arricchite in mTEC. (D-F) Rilevamento di (D) beta5t, (E) CCL21 e (F) Aire in cTEC (pannelli superiori) e mTEC (pannelli inferiori) come definito nel pannello C. Gli istogrammi grigi mostrano i profili di controllo marcati con (D,E) solo l'anticorpo secondario e con (F) IgG abbinata all'isotipo marcata con FITC. Abbreviazioni: FSC = diffusione in avanti; TEC = cellule epiteliali timiche; cTEC = TEC corticali; mTEC = TEC midollari; FITC = isotiocianato di fluoresceina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66945/66945fig02large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
I segnali di marcatura della superficie cellulare per Ly51 e UEA1 mostrati nel pannello C rivelano due popolazioni principali nelle TEC; una popolazione relativamente alta per Ly51 e bassa per UEA1, arricchita di cTEC, e un’altra relativamente bassa per Ly51 e alta per UEA1, arricchita di mTEC21,22,23,24,25. Durante le fasi embrionali e neonatali, compresi i soggetti di 0 giorni, la frequenza delle cTEC è maggiore rispetto a quella delle mTEC. Nelle fasi postnatali, la frequenza delle mTEC prevale principalmente perché l’efficienza del rilascio delle cTEC dal timo diventa estremamente bassa (circa l’1% delle cTEC e il 10% delle mTEC possono essere recuperati in una sospensione monocellulare)17.
La fissazione e la permeabilizzazione delle cellule permettono la rilevazione di molecole intracellulari all'interno delle TEC. Il pannello D mostra l'espressione di beta5t nella maggior parte delle cTEC, ma non nelle mTEC; il pannello E mostra il rilevamento di CCL21 in una frazione di mTEC, ma non nelle cTEC, e il pannello F mostra Aire espresso in una sottopopolazione di mTEC.
Ulteriori profili di citometria a flusso di molecole intracellulari nelle cellule epiteliali timiche (TEC) di topo possono essere trovati in articoli pubblicati; per beta5t6,20, CCL2114,16,26 e Aire27,28, così come per ulteriori molecole intracellulari, tra cui cheratina22,29 e Fezf211,30.

Descriviamo i protocolli per la preparazione di sospensioni a singola cellula di cellule epiteliali timiche-di topo e la colorazione di molecole intracellulari per l'analisi citofluorimetrica.

Preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica

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Qui si descrive un metodo efficace per l'isolamento, l'identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo topo (TEC). Il protocollo può essere utilizzato per gli studi di funzione del timo per il normale sviluppo delle cellule T, la disfunzione del timo, e la ricostituzione delle cellule T.

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

La pelle ospita una complessa rete di cellule immunitarie. Descriviamo una metodologia efficiente per la digestione della pelle di topo, proveniente da diverse parti del corpo dell'animale, al fine di ottenere una sospensione unicellulare e analizzare le diverse popolazioni leucocitarie residenti nella pelle mediante citometria a flusso.

Preparazione di cella singola sospensioni per analisi citofluorimetrica provenienti da diverse regioni della pelle del mouse

Questo articolo descrive la metodologia in vivo e in vitro per caratterizzare i progenitori di sedimentazione timica mediante l'analisi della cinetica di generazione, fenotipo e numero della loro progenie di cellule T.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Questo articolo viene illustrato un metodo potente per quantificare i mitocondri o i lisosomi delle cellule viventi. La combinazione di coloranti specifici lisosoma o mitocondri con anticorpi fluorescente coniugati contro marcatori di superficie permette la quantificazione di questi organelli in popolazioni di cellule miste, come primario cellule ottenute da campioni di tessuto, utilizzando citometria a flusso multicolor.

Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

Qui, presentiamo un protocollo per preparare singole cellule da timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza per studiare ulteriormente queste cellule mediante citometria a flusso. Inoltre, questo protocollo è stato utilizzato per determinare le sottopopolazioni di cellule T regolatorie mediante citometria a flusso.

Determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule T nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso

In questo studio, presentiamo un protocollo efficace e riproducibile per isolare le popolazioni immunitarie del sistema respiratorio murino. Forniamo anche un metodo per l'identificazione di tutte le cellule immunitarie innate e adattative che risiedono nei polmoni di topi sani, utilizzando un pannello di citometria a flusso a 9 colori.

Analisi citometrica a flusso per l'identificazione delle cellule immunitarie innate e adattative del polmone murino

Per studiare la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali, un approccio comune consiste nell'analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie. Qui, vengono forniti due protocolli semplici ed efficaci per isolare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale murino e dal midollo osseo del cranio.

Isolamento delle cellule immunitarie dal cervello e dal cranio del topo

Scopri la preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e la colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica. Questo metodo avanza la comprensione dello sviluppo dei linfociti T.

Preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica (Video) | JoVE Journal

Preparazione di sospensioni unicellulari di cellule epiteliali timiche di topo e colorazione di molecole intracellulari per analisi citofluorimetrica

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