Name: Immunocolorazione a montaggio intero e conteggio automatico delle cellule gangliari retiniche di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Scopri l'immunocolorazione a montaggio intero della retina di topo per quantificare rapidamente le cellule gangliari retiniche con software AI. Questo metodo automatizzato accelera la ricerca sul glaucoma.

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<meta charset="utf8"></head><body>Immunocolorazione e conteggio basato sull'intelligenza artificiale delle RGC nella retina a montaggio intero di topo

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial-ethnic+disparities+in+concurrent+rates+of+peripapillary+%26+macular+OCT+parameters+among+a+large+glaucomatous+clinical+population%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population.</a> Eye. , (2024).</li>
<li>Atkinson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+measure+of+patient+satisfaction+with+ocular+hypotensive+medications%3A+the+Treatment+Satisfaction+Survey+for+Intraocular+Pressure+%28TSS-IOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Qual+Life+Outcomes%22%5BJournal%5D)">A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP).</a> Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse-fixation+device+for+IOP+measurement+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice.</a> Vision Res. 219, 108397(2024).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+counting+of+retinal+ganglion+cells+in+the+entire+mouse+retina+based+on+improved+YOLOv5%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Res%22%5BJournal%5D)">Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5.</a> Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).</li>
<li>Al-Khindi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Tbx5+regulates+direction-selective+retinal+ganglion+cell+development+and+image+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization.</a> Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).</li>
<li>Claes, M., Moons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells%3A+Global+number%2C+density+and+vulnerability+to+glaucomatous+injury+in+common+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice.</a> Cells. 11 (17), 2689(2022).</li>
<li>Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-based+whole-mount+preparation+for+the+investigation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (194), e65222(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1&volte; PBS</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa594 Capra coniugata Anti-coniglio IgG&nbsp; (H+L)</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-BRN3A [EPR23257-285]</td><td>Abcam</td><td>ab245230</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> AutoCount <td>https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs</td></tr><tr><td>Disco cloud</td><td>Collegamento</td><td></td> all'unità Google <td>https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6&nbsp;</td></tr><tr><td>Disco cloud</td><td>Baidu link</td><td>Codice di estrazione: g44k</td><td>https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg&nbsp;</td></tr><tr><td>Marker</td><td>Sharpie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Siero d'asino</td><td>Biosharp, Labgic</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Macklin</td><td>P804536</td><td></td></tr><tr><td>ProClean 300</td><td>Beyotime</td><td>ST853</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>BBI, Sangon</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioFroxx, neoFroxx</td><td>1139ML100</td><td></td></tr></tbody></table>

immunocolorazione a montaggio intero e conteggio automatico delle cellule gangliari retiniche di topo

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells

Questo protocollo descrive in dettaglio la metodologia per l'immunocolorazione a montaggio intero delle retine di topo, garantendo una meticolosa preparazione dei tessuti, un'incubazione precisa degli anticorpi e un conteggio automatizzato affidabile delle cellule. La procedura facilita la marcatura e la quantificazione robusta delle cellule gangliari retiniche (RGC), consentendo una valutazione accurata delle popolazioni cellulari in vari contesti sperimentali. Il metodo è stato utilizzato per contare le RGC in topi wild-type e modellati con glaucoma, ottenendo risultati coerenti. Un risultato rappresentativo mostra che il numero di RGC in un topo adulto normale a 2 mesi di età è di circa 45.000 (Figura 6).
Per valutare se il software di intelligenza artificiale è in grado di quantificare con precisione le RGC marcate con BRN3a in modelli normali e di malattia, abbiamo generato un modello murino di glaucoma7 indotto da N-metil-D-aspartato (NMDA). La retina a montaggio intero di questo modello è stata immunocolorata con anti-BRN3A e le RGC sono state quantificate utilizzando il software di conteggio automatico. Il risultato ha indicato una colorazione di fondo relativamente alta (Figura 7). Ciononostante, il software è stato in grado di identificare con precisione quasi tutti gli RGC. In questa retina sono state identificate un totale di 15.231 RGC, rispetto a circa 45.000-50.000 RGC in una normale retina di topo, indicando una grave degenerazione. Pertanto, il software di intelligenza artificiale può essere utilizzato efficacemente anche per contare le RGC nelle retine con una qualità di colorazione meno ottimale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig01.jpg"> Figura 1: Diagramma schematico per la preparazione di RGC. (A) Il bulbo oculare viene rimosso e posizionato in 1x PBS. (B) Il bulbo oculare viene fissato in PFA al 4% su ghiaccio per 3 ore. (C) Rimozione della cornea. (D) Estrazione della lente. (E) L'oculare è diviso in 4 lembi usando le forbici. (F) La sclera viene staccata e i detriti vengono rimossi delicatamente dalla superficie della retina con una spazzola morbida. (G) La retina è immunomarcata con anti-BRN3A. (H) I segnali fluorescenti vengono riprodotti utilizzando un microscopio confocale. (I) Conteggio automatico degli RGC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig02v3.jpg"> Figura 2: Isolamento della retina del topo a montaggio intero. (A) Il topo viene soppresso mediante lussazione cervicale. (B) Il mouse è posizionato su una superficie piana. (C) Il bulbo oculare viene rimosso con cura con le forbici. (D) Il bulbo oculare viene posizionato delicatamente in 1x PBS. (E) Il bulbo oculare è fissato con una pinza sul bordo della cornea. (F) Viene praticata una piccola incisione sul bordo della cornea con un ago. (G) La struttura a forma di ciotola viene rimossa dopo aver rimosso la cornea. (H) La lente viene rimossa con cura con una pinza. (I) Viene praticata una piccola incisione lungo il bordo della cornea verso il nervo ottico sulla sclera, evitando danni alla retina. (J) La sclera viene squarciata lungo l'incisione con una pinza. (K) La retina viene appiattita e pulita con un pennello. (L) La retina viene appiattita e fissata rapidamente con metanolo ghiacciato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig03.jpg"> Figura 3: Immunocolorazione della retina del topo a montaggio intero. (A) Dopo il lavaggio con 1x PBS, la retina viene bloccata con un tampone bloccante. (B) La retina viene incubata con un anticorpo primario a 4 °C durante la notte. (C) La retina viene lavata con 1x PBS tre volte. (D) La retina viene incubata con un anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente. (E) La retina è montata su un vetrino con RGC rivolte verso l'alto. (F) Le immagini vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig04.jpg"> Figura 4: Installazione del software di conteggio automatico. (A) Il passaggio 1 prevede l'aggiornamento del percorso del file alla directory "yolov5_cpu". (B) Viene avviata l'interfaccia grafica. (C) Verifica della presenza del file del modello nella directory principale dell'unità C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig05.jpg"> Figura 5: Funzionamento del software di conteggio RGC automatizzato. (A) Il software di conteggio è aperto. (B) Si fa clic sul pulsante APRI IMMAGINE per importare l'immagine. (C) Si fa clic sul pulsante RUN per avviare il conteggio automatico. (D) Le celle contate sono contrassegnate da una casella quadrata rossa e il numero di cella viene visualizzato nell'angolo in alto a destra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig06.jpg"> Figura 6: Conteggio automatizzato degli RGC del topo. Il pannello superiore (a sinistra) mostra i risultati rappresentativi della retina a montaggio piatto immunocolorata con anti-BRN3A; il pannello superiore (a destra) mostra il conteggio automatico degli RGC con software precedentemente sviluppato. Barra di scala: 100 μm. Gli inserti dei pannelli superiori vengono ingranditi e visualizzati rispettivamente nel pannello inferiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig07.jpg"> Figura 7: Conteggio RGC in un modello murino di glaucoma indotto da NMDA. Pannello di sinistra: Panoramica della retina a montaggio completo, che mostra gli RGC riconosciuti dal software AI. Pannello di destra: Vista ingrandita di un'area parziale della retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Immunocolorazione a montaggio intero e conteggio automatico delle cellule gangliari retiniche di topo

Glaucoma is a leading cause of blindness globally, characterized by a complex pathogenic mechanism that makes vision restoration challenging. Mice serve ...

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Neuroscienze

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Fonte: Lani-Louzada, R., et al. Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori. J. Vis. Exp. (2022). Questo video dimostra la quantificazione delle cellule gangliari retiniche da retine di ratto fissate chimicamente e sottoposte a cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare. Il processo include la permeabilizzazione, la colorazione degli anticorpi e la controcolorazione nucleare, seguita dalla visualizzazione...

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Fonte: Wang, Z., et al. Imaging transpupillare in vivo a due fotoni della retina del topo. J. Vis. Exp. (2021).Questo video mostra una tecnica per l'imaging retinico in vivo utilizzando la microscopia a due fotoni. I topi anestetizzati vengono preparati per l'imaging fissando le loro teste, applicando lubrificante per gli occhi e posizionando un vetrino coprioggetti sull'occhio. Le cellule gangliari retiniche (RGC) che esprimono proteine fluorescenti vengono prima visualizzate utilizzando...

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Fonte: Laboissonniere, et. al. RNA-seq a singola cellula di sottoinsiemi definiti di cellule gangliari retiniche. J. Vis. Exp. (2017).  Questo video mostra una tecnica di tracciamento fluorescente per identificare i sottotipi di cellule gangliari retiniche (RGC) in una retina di topo transgenico. Il processo prevede il fissaggio della retina isolata in una camera di registrazione, il mantenimento della vitalità cellulare con perfusione ossigenata e il targeting di RGC marcate in fluorescenza...

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Immunocolorazione a montaggio intero e conteggio automatico delle cellule gangliari retiniche di topo

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